JP4106361B2 - ヒアルロン酸産生微生物菌株及び精製ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
ストレプトコッカスズエピデミカスに突然変異を誘発して非溶血性を有し、ヒアルロニダーゼ活性のない突然変異株を選別した。
ストレプトコッカス属KL0188を培養してヒアルロン酸生産効率及び生産されたヒアルロン酸分子量を測定した。
ストレプトコッカスズエピデミカス(KCTC3318)を実施例2と同様の方法で培養し、収得したヒアルロン酸の生産性及び分子量を測定した。
〔3−1 ヒアルロン酸産生微生物菌株の培養液調製〕
ストレプトコッカス属KL0188(寄託番号KCTC10248BP)を100mlのトッド−ヒューイット培地に接種し、35℃で代数的成長期まで培養させ、これを1次種培養液として使用した。この1次種培養液を1Lのトリプシン大豆培地(Difco、USA)に接種し、35℃で代数的成長期まで培養させ2次種培養液とした。
ヒアルロン酸培養液をヒアルロン酸の濃度が0.1乃至0.2%になるように希釈した。これに0.02%の硫酸ラウリル及び0.05%のホルマリン溶液を加えて3時間攪拌した。その後、遠心分離またはろ過して菌体を除去し、培養濾液を調製した。
培養濾液のpHを7.5乃至8.5になるように滴定し、芳香族系吸着樹脂SP207を3(w/v)%加えた後、4乃至10℃で3時間攪拌しながら発熱性物質を吸着させた。その後、吸着樹脂処理液をろ過して吸着樹脂が除去された濾液を収得し、限外濾過を行なった。
濾液に塩化ナトリウム(NaCl)を0.9(w/v)%加え、活性炭を3(w/v)%添加した後、2時間攪拌して蛋白質及び核酸などを活性炭に吸着させた。その後、ろ過して活性炭を除去し、ヒアルロン酸水溶液を得た。
ヒアルロン酸水溶液に1Mの濃度になるようにNaClを添加し、0.2μmのフィルターでろ過した。その後、1.5乃至3倍容のエタノールを加えてヒアルロン酸及びその塩を沈殿させた後、70%エタノールで数回洗浄した。沈殿物は滅菌された条件下で乾燥してヒアルロン酸及びその塩を得た。
吸着樹脂としてHP20を使用した以外は、実施例3と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
活性炭処理後、SP207に吸着させた以外は、実施例3と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
活性炭処理後、HP20に吸着させた以外は、実施例4と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
ヒアルロン酸産生微生物菌株としてストレプトコッカスズエピデミカス(KCTC3318)を使用した以外は、実施例3と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
芳香族樹脂を利用した吸着工程を省略した以外は、実施例3と同様の方法でヒアルロン酸及びその塩を精製した。
実施例3乃至7、及び比較例の方法で精製したヒアルロン酸及びその塩の純度を測定した。
A.ヒアルロン酸収率:ヒアルロン酸収率は、カルバゾール法を変形した方法で定量して初期の体積と最終体積を比較した。
B.発熱性物質測定:ヒアルロン酸及びその塩を1.5g/Lになるように発熱性物質含量が0.001EU/ml以下である水に溶解した後、チャールズリバーエンドセーフ社(Charles River Endosafe)のLAL(Limulus Amebocyte Lysate)試薬を使用して添付されたマニュアルによって分析した。分析値はヒアルロン酸塩1mg当り存在するエンドトキシン単位(EU)で示した。
C.純度試験:純度試験は、カルバゾール法を変形した方法(Anal.Biochem.,4,330(1962))で実施した。
D.蛋白質含量:ロウリ(Lowry)法で実施した。
E.核酸含量:ヒアルロン酸及びその塩を生理食塩水に1%で溶解した後、260nmにおける吸光度を測定した。
上記の測定結果を表1に示す。
Claims (4)
- ヒアルロニダーゼ酵素を発現せず、非溶血性を示すヒアルロン酸産生微生物菌株ストレプトコッカス属KCTC10248BP。
- 請求項1に記載のストレプトコッカス属KCTC10248BPの培養液を芳香族系吸着樹脂及び活性炭で処理し、有機溶媒で沈殿させてヒアルロン酸及びその塩を精製する工程を含む精製ヒアルロン酸及びその塩の製造方法。
- 前記芳香族系吸着樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体または臭素化ポリスチレンである、請求項2に記載の製造方法。
- 前記製造方法は、
(a)前記ヒアルロン酸産生微生物菌株培養液から培養濾液を製造する工程と、
(b)前記培養濾液に芳香族系吸着樹脂を加えて攪拌及び限外濾過してエンドトキシンが除去されたヒアルロン酸水溶液を製造する工程と、
(c)前記ヒアルロン酸水溶液に有機溶媒を加えてヒアルロン酸及びその塩を沈殿させ、これを乾燥する工程と、を有し、
前記(a)工程または(b)工程後に、前記培養濾液または前記ヒアルロン酸水溶液に活性炭を加えて攪拌した後、活性炭を除去する工程と、を含む、請求項2に記載の製造方法。
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