KR100250573B1 - 신규 스트렙토코커스속 미생물 및 그로부터 제조되는 히아루론산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고분자량의 히아루론산 또는 그 염의 생산에 적합한 신규한 스트렙토코커스속 미생물 및 이로부터 얻어지는 고분자량 히아루론산에 관한 것이다. 본 발명은 공지된 균주인 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 ATCC 35246을 돌연변이시켜 용혈성이 없으며 히아루로니다제를 생성하지 않는 신규한 돌연변이 미생물을 제공함으로써 히아루론산의 생산성을 증대시키고, 상기 신규한 돌연변이 미생물로 부터 평균 분자량이 3,500,000 달톤 이상인 보다 고분자량의 히아루론산을 수득한다.

Description

신규 스트렙토코커스속 미생물 및 그로부터 제조되는 히아루론산

제1도는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 ATCC35246과 돌연변이 미생물 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707의 발효 결과를 비교하여 나타낸 것이고,

제2도는 본 발명에 의해 생산된 히아루론산과 기타 히아루론산의 고속 액체크로마토그래피에서의 용출 시간에 따른 분자량을 비교하여 나타낸 것이고,

제3도는 본 발명에 의해 생산된 히아루론산과 기타 히아루론산을 점도계를 사용하여 농도별 점도변화를 비교하여 나타낸 것이다.

본 발명은 고분자량의 히아루론산(Hyaluronic acid=HA) 또는 그 염의 생산에 적합한 신규 스트렙토코커스속 미생물 및 이로부터 얻어지는 고분자량의 히아루론산에 관한 것이다.

히아루론산은 생체 고분자의 일종으로 분자량이 5만 내지 1,300만 달톤에 이르는 무색 투명한 고점도의 선형 다당류이며, 반복 단위인 글루쿠론산과 N-아세틸 글루코즈아민이 (1-3)과 (1-4)로 번갈아 결합되어 있다. 히아루론산은 피부, 눈의 초자체, 관절액, 탯줄, 닭 벼슬 등에 널리 분포되어 있으며 스트렙토코커스속 등의 박테리아에 의해 생성되기도 한다.

히아루론산은 보습 효과가 강하며 물리적 마찰에 대한 윤활 효과 및 세균 등의 침입에 대한 보호 효과가 있어 피부 노화 방지용 고급 화장품 첨가제, (백내장, 녹내장, 각막 손상등으로 인한)안과 수술시 눈 조직의 보호제, 관절염 치료제, 외상 피복제, 외과 수술시 피복제 등과 같이 화장품 및 의료용으로 광범위하게 개발되고 있다.

히아루론산을 생산하는 방법은 생체 조직으로부터 추출하는 방법과 미생물을 발효시켜 발효 산물로서 회수하는 방법이 있다.

닭 벼슬이나 탯줄 등의 생체 조직으로부터 히아루론산을 추출하는 방법은 발라즈(Balaz)의 미국 특허 제4,141,973호에 눈, 관절 등의 치료에 대한 히아루론산의 용도와 함께 기재되어 있다. 히아루론산의 보습 효과를 이용한 화장품용 히아루론산의 생산은 발라즈(Balaz)의 미국 특허 제4,303,676호에 기재되어 있다.

생체 조직으로부터 추출에 의한 히아루론산의 생산은 조직 내에 있는 콘드로이틴 설페이트와 글리코즈아미노 글리칸 등의 생체 고분자 불순물을 제거하기 위한 복잡한 정제 과정이 필요하기 때무에 비용이 많이 들게 되어 대량생산에 부적합하다. 이에 반해 미생물을 이용한 히아루론산의 생산은 상대적으로 생산 비용이 적게 들고 고분자량의 히아루론산을 비교적 간단한 정제 과정을 거쳐 높은 수율로 얻을 수 있다고 알려져 있다(발라즈의 미국 특허 제4,141,973호, 아가사까(Akasaka)의 일본 공개 특허 제58-056692호, 님로드(Nimrod)의 미국 특허 제86-00066호).

히아루론산 생산에 사용되어 온 스트렙토코커스속의 미생물 종에는 파이오제네스, 패칼리스, 디스갈락티에, 주에피데미쿠스, 이퀴, 이퀴시밀리스 등이 있으며, 이들은 버기스 편람(Bergey’s Manual)에서 란스필드 혈청군 A 또는 C 타입으로 분류되어 있다. 일본 공개 특허 제58-566922 미 60-500997호, 미국 특허 제4,141,973호, 대한민국 공개 특허 제92-9494 및, 87-11252호 등에는 스크렙토코커스속의 미생물을 이용하여 히아루론산을 생산한다고 보고되어 있다. 그러나 상기 특허들에서는 히아루론산의 평균 분자량이 300,000 내지 2,500,000달톤으로서 비교적 적으며, 따라서 화장품 용도에서도 보습력이 떨어질 뿐 아니라 안과 수술시나 관절염 치료약 등의 치료제 및 치료 보조제로 사용하기에는 분자량이 떨어진다.

본 발명자들은 이와 같은 문제점들을 해결하기 위하여 연구를 하던 중 스트렙토코커스 주에피데미쿠스로부터 얻은 돌연변이체가 고분자량의 히아루론산을 대량 생산할 수 있다는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명의 목적은 고분자량의 히아루론산을 생산하고 히아루로니다제가 없으며 용혈성이 전혀 없는 스트렙토코커스속 돌연변이 미생물 및 이로부터 얻어지는 고분자량의 히아루론산을 제공하는 것이다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 언급한 스트렙토코커스속 돌연변이 미생물은 다음과 같이 스크리닝할 수 있다. 공지 균주인 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 ATCC 35246 배양액을 먼저 NTG(N-메틸-N′-니트로-N-니트로조구아니딘)로 처리하여 용혈성이 없는 균주를 선별하고, 다시 NTG로 처리하여 히아루론산 분해 효소인 히아루로니다제 활성이 없는 균주를 선별한다. 선별된 균주를 평판배양시킨 후, 평판배지상에서 성장이 빠르고 점액성이 크게 콜로니 크기가 큰 콜로니를 선별한다.

상기와 같이 선별된 돌연변이 균주는 히아루로니다제를 생성하지 않으며, 용혈현상이 나타나지 않을 뿐 아니라, 평균 분자량 3,500,000 달톤, 특히 바람직하게는 4,000,000 달톤 이상의 매우 높은 분자량을 갖는 히아루론산을 생산하는 것으로 나타났다. 이 돌연변이 균주는 하기에서 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 그의 세균학적 특성에 의거하여 “스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707”로 명명하였다.

본 발명에 따른 돌연변이주 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707은 93년 1월 29일자로 한국 유전자 은행에 수탁번호 KCTC 075BP로 기탁되었다.

일반적으로 미생물의 배양에 사용되는 배지 성분은 탄소원, 질소원, 무기염류와 같은 미량 원소 등을 포함한다. 탄소원으로는 전분, 글루코즈, 수크로즈, 갈락토즈, 프럭토즈등을 사용할 수 있으며 이 중 글루코즈가 가장 효과적이다. 질소원으로는 황산 암모늄, 질산 암모늄, 질산 나트륨, 카자미노산, 효모 추출물, 펩톤, 트립톤 등이 사용 가능하다. 여기에 경우에 따라 염화나트륨, 인산 제일 및 제이 나트륨, 황산 제일철, 염화 칼륨, 황산 마그네슘 등이 사용될 수 있다.

가장 효과적인 배지 성분의 조성은 다음과 같다 : 10 내지 100g/ℓ의 글루코즈, 1.0g/ℓ의 황산 마그네슘, 2.0g/ℓ의 인산 제일 칼륨, 5.0g/ℓ의 이스트 엑기스, 15.0g/ℓ의 효모 펩톤, 7.0g/ℓ의 글루탐산, 및 0.75g/ℓ의 우리딘.

히아루론산 생산을 위한 스트렙토코커스속 돌연변이 미생물의 배양 방법은 하기와 같다. 500㎖ 플라스크에 토드 훼이트배지(미국 딥코(Difco)사) 100㎖를 채우고 121℃에서 15분간 증기 멸균한다. 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707을 접종하여 37℃의 진탕 배양기에서 대수기까지 배양하여 종배양액으로 사용한다. 5ℓ 발효조에 상술한 조성을 갖는 히아루론산 생산 배지 3ℓ를 넣고 121℃에서 20분간 증기 멸균한 후, 종배양액을 접종한다.

배양액의 pH는 7.1 내지 7.3, 온도는 35℃ 내지 38℃, 통기량은 0.1 내지 1.0VVM으로 유지하면서 호기 배양한다.

배양이 종결된 후 배양액중에 존재하는 히아루론산은 공지된 다당류 분리정제방법[J.Soc. Cosmet. Chem. Japan.22,35-42(1988)]에 따라 회수한다. 본 발명에 의한 돌연변이 미생물의 히아루론산 생산량은 배지의 조성에 따라 2.5 내지 6.0g/ℓ였고 평균 분자량은 배지 조성에 관계없이 4,000,000 달톤 이상이었다. 히아루론산의 정량은 카바졸방법[Z.Dische, J.Biol.Chem. 167,189(1947)]에 의하여 실시하였다. 분자량의 측정은 고속 액체 크로마토그래피에 의한 방법과 점도계의 의한 방법을 동시에 실시하였다. 고속 액체 크로마토그래피에 의한 방법은 폴리에틸렌옥사이드를 표준 물질로 사용하여 표준 곡선을 구한 후 동일 조건에서 용출시켜 분자량을 확인하였다[P.Chabrecek, Chromtorgraphia 30,201-204(1990); Narlin B.Beaty, Anal. Biochem. 147, 387-395, (1985); Noriko Motohashi, J.Chrom. 299, 508-512(1984)]. 점도계에 의한 방법은 나를린[Narlin, Analytical Biochemistry 147, 347-395(1985)]의 관계식:

극한점도(Limited Intrinsic Viscosity) = 0.000356 × MW exp(1.0699)

에 의거하였다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니다.

[실시예 1]

[돌연변이 균주의 스크리닝]

[단계1) 용혈성이 없는 균주의 획득]

공지된 균주인 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 ATCC 35246을 25㎖의 토드 훼이트 배지에 접종하여 37℃에서 14시간동안 진탕 배양한 다음, 배양액 2.5㎖를 다시 25㎖의 토드 훼이트 배지에 접종하여 37℃에서 대수 성장기까지 진탕 배양했다. 배양후 배양액 1㎖를 저온에서 원심 분리하여 침전된 세포를 수거한 다음, 여기에 트리스-말레산 완충액을 첨가하여 현탁시켜 2회 세척했다. 세척한 세포를 상기 완충액에 현탁시킨 다음 100 내지 200㎍/ℓ의 NTG(N-메틸-N′-니트로-N-니트로조구아니딘)를 첨가하여 37℃에서 20 내지 30분간 진탕 시키거나 60 내지 120분간 정치시켜 돌연변이를 유발시켰다.

NTG로 처리된 세포 현탁액을 저온에서 원심 분리하여 침전된 세포를 수거한 후 상기 완충액에 현탁시켜 수회 세척하여 잔류 NTG를 제거했다. 잔류 NTG가 제거된 세포를 다시 상기 완충액에 현탁시킨 후 25㎖의 토드 훼이트 배양액에 접종하여 37℃에서 18시간동안 진탕 배양하여 생존 가능한 돌연변이 세포의 수를 증가시켰다.

이때 얻어진 배양액을 생리 식염수로 적당히 희석하여 혈액 한천 배지상에 단일 콜로니가 나타나도록 도말한 다음 37℃에서 정치 배양했다. 성장한 콜로니중 용혈 작용이 완전히 없어진 콜리니를 선별하여 돌연변이 미생물로서 수거했다.

이와같이 하여 용혈성이 전혀 없는 돌연변이 미생물을 얻었다.

[단계2) 히아루노니다제를 생성하지 않는 균주의 획득]

상기 단계1에서 분리하고 돌연변이 시켜 용혈성이 배제된 미생물을 상술한 단계1과 동일한 방법으로 돌연변이를 유발시킨 다음, 배양액 ㎖당 400㎍의 히아루론산과 1%의 알부민 분획 V를 함유하는 토드 훼이트 한천 배지에 단일 콜로니가 형성되도록 적당히 희석하여 도말했다. 이를 37℃의 습실에서 2 내지 5일간 정치 배양한 다음, 여기에 2N 아세테이트 용액 약 10㎖를 가하여 10분간 정치시켰다. 이때 불투명한 주변부를 갖는 콜로니를 선별하여 히아루로니다제를 생성하지 않는 돌연변이 균주를 얻었다.

[단계3) 히아루론산 생산성이 우수한 돌연변이 균주의 획득]

상기 단계2에서 얻어진 돌연변이 미생물을 상술한 단계1과 동일한 방법으로 돌연변이를 유발시킨 다음, 적당히 희석하여 토드 훼이트 한천 배지에 도말한 후 37℃의 습실에서 정치 배양했다. 이때 대조용으로서 돌연변이되기 전의 균주를 동시에 접종하여 대조용 보다 성장이 빠르고 점액성이 크며 콜로니의 크기가 큰 콜로니들을 선별했다.

[단계4) 고분자량의 히아루론산 생성 균주 획득]

상기 단계3에서 얻어진 돌연변이 미생물들을 글루코즈를 주탄소원으로 하는 히아루론산 배지 2ℓ를 채운 발효조에 각각 접종하여 37℃로 18시간동안 pH를 중성으로 조절하면서 통기 배양하였다. 배양액을 회수하여 0.45㎛의 필터로 여과한 후 고속 액체 크로마토그래피에서 용출시켰을 때 히아루론산의 용출 시간이 대조용인 돌연변이 전의 원균주에 의한 발효액보다 더 빠른 것을 선별하여 원균주에 의해 얻어지 히아루론산 보다 분자량이 훨씬 높아진 히아루론산을 생산하는 돌연변이 미생물(KCTC 0075BP)을 얻었다.

상술한 스크리닝 방법을 이용하여 히아루론산을 생산하는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스에 연속적으로 돌연변이를 일으켜 얻은 돌연변이 균주는 히아루로니다제를 생성하지 않으며, 스트렙토리신을 전혀 생성하지 않아 용혈 현상이 전혀 나타나지 않으며 돌연변이에 으해 매우 높은 분자량의 히아루론산을 생산할 수 있는 능력을 가지게 되었음을 발견하였다. 이 돌연변이 균주를 이용하여 생산된 히아루론산은 평균 분자량이 3,500,000달톤 이상이었다.

[단계5) 돌연변이 균주의 세균학적 특성 조사]

상기와 같은 방법으로 얻은 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF 707은 하기와 같은 세균학적 특성을 나타냈다.

· 그림 염색 : 양성

· 10℃ 에서의 성장 : 음성

· 45℃ 에서의 성장 : 음성

· 6.5% 식염수 중에서의 성장 : 음성

· PH9.6 에서의 성장 : 음성

· 40% 담즙에서의 성장 : 음성

· 아르기닌 분해성 : 양성

· 히퓨테이트 분해성 : 음성

· 에스큘린 분해성 : 음성

·바시트라신 내성 : 음성

· 당분의 분해성 : 음성

글루코즈, 말토즈, 수크로즈, 솔비톨, 락토즈 : 양성

만니톨, 글리세린, 트레할로즈 : 음성

용혈성과 히아루로니다제를 제외하고는 세균학의 버기스편람(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriolgy, 1974]에 나타난 스트렙토코커스 주에피데미쿠스의 특성에 가장 근접하는 상기의 특성에 의거하여, 본 출원인은 상기의 돌연변이 미생물을 “스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707”(KCTC 0075BP)로 명명하였다.

[실시예2]

[ATCC 35246과의 히아루론산 생산성 비교]

상기 실시예1의 단계4)에서 얻어진 고분자량의 히아루론산의 생산성이 훨씬 향상된 돌연변이 미생물 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF 707과 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 ATCC 35246에 의한 히아루론산 생산성을 비교하였다(제1도). 제1도에서 볼 수 있듯이, 상기 돌연변이 균주에 의한 발효 단위부피당 히아루론산 생산성은 ATCC 35246에 의한 것 보다 20%정도 증가하였다.

[실시예3]

[시판 중인 히아루론산 제품과의 분자량 비교]

상기의 돌연변이 미생물에 의한 발효액과 공지 균주인 ATCC 35246에 의한 발효액으로부터 분리된 히아루론산을 상술한 고속 액체 크로마토그래피법에 의해 현재 시판 중인 히아루론산 제품들{힐론(HEALON)(스웨덴 카비파마시아 제약 회사의 안과용 제품), 알츠(ARTZ)(일본 생화학 공업주식회사슬과절용 제품)}과 그 분자량을 비교하였다(제2도). 또한 점도계를 이용하여 LBF707에 의해 생산된 히아루론산과 시판 히아루론산 제품인 힐론 및 알츠 등의 점도를 비교하였다(제3도). 비교결과 본 발명의 돌연변이 균주인 LBF707의 배양액에서 분리된 히아루론산의 평균분자량이 가장 높은 것으로 나타났다. 점도측정 결과는 본 발명의 돌연변이 균주에 의한 히아루론산의 극한 점도가 가장 높은 것으로 나타났다.

[실시예 4][

미생물의 회분식 배양]

5ℓ발효조에 배양액이 3ℓ가 되도록 하기 조성의 배양액을 넣었다. 배양액의 조성은 배양액 리터당 60g의 글루코즈, 1.0g의 황산 마그네슘, 2.0g의 인산 제일 칼륨, 5.0g의 효모 추출물, 15.0g의 효모 펩톤, 7.0g의 글루탐산, 및 0.75g의 우리딘이다.

상기 배지를 스팀을 이용하여 121℃에서 20분간 멸균한 다음, 여기에 본 발명의 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF 707의 종배양액 150㎖를 가하고, 배양액의 pH는 7.1 내지 7.3, 온도는 35℃ 내지 38℃, 통기량은 0.1 내지 1.0VVM으로 유지하면서 호기배양을 수행하였다.

배양이 종결된 후 배양액중에 존재하는 히아루론산의 농도는 2.5 내지 6.0g/ℓ 였으며, 평균 분자량은 3,500,000 달톤 이상이었다.

[실시예 5]

[미생물의 유가식 배양]

상기 실시예4의 방법을 이용하여 배양 초기 글루코즈의 농도를 40g/ℓ로 하여 배양을 시작하였다. 배양시작 12 내지 18시간 후에 배양액 내의 글루코즈 농도가 10g/ℓ 이하로 유지되도록 글루코즈를 첨가하는 유가배양 방법으로 배양을 계속하였다. 배양액중의 히아루론산의 농도가 더 이상 증가하지 않을 때까지 배양을 수행한 결과, 총 배양 시간은 24 내지 36시간, 히아루론산의 농도는 4.0 내지 5.0g/ℓ였으며, 평균 분자량은 3,500,000 달톤 이상이었다.

Claims (3)

1. 히아루론산을 생성하는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) LBF 707(KCTC 0075BP).
2. 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 ATCC 35246에 N-메틸-N′-니트로-N-니트로조구아니딘을 가하여 돌연변이를 유발하고, 용혈성이 배제되고 히아루로니다제를 생산하지 않는 균주를 스크리닝하는 것을 특징으로 하는, 향상된 히아루론산 생산성을 갖는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF 707(KCTC 0075BP)의 유도방법.
3. 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF 707(KCTC 0075BP)을 배양한 후 배양액으로부터 히아루론산을 분리하는 것을 포함하는, 3,500,000 달톤 이상의 평균 분자량을 갖는 히아루론산을 제조하는 방법.