KR870001815B1 - 발효법에 의한 히알우론산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

발효법에 의한 히알우론산의 제조방법
제1도는 실시예 2에서의 배양중의 배양시간(hr)과 히알우론산의 생산량(g/ℓ), 글루코오스양(%) 또는 세포생장(OD660) 사이의 상관관계를 도해적으로 설명하는 것이며,
제2도는 실시예 2에서 얻은 히알우론산의 적외선흡수 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명은 발효법에 의한 히알우론산의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 스트렙토코쿠스속에 속하는 미생물을 배양(또는 인큐베이팅)하여 스트렙토리신이 혼입되어 있지 않은 히알우론산을 취재하는 것을 특징으로하는 발효법에 의한 히알우론산의 제조방법에 관한 것이다.
지금까지, 히알우론산은 소위 안구의 유리액, 닭의볏이나 탯줄 또는 관절액등에서 분리되었으며 히알우론산은 단백질 또는 다른 뮤코폴리사카라이드 및 물과 결합되어서 물질로써 윤활제적인 역할 및 세균침입을 방지하거나 수분을 보유하는 물질로 사용 되어왔다. 그러나 히알우론산을 얻기위한 상기 방법은 고가의 비용으로 인하여 유익하지 못하였다.
예컨대, B. Holmstr
Figure kpo00001
m, Appl, Microbial, 15(6), 1409~1413, 1967, J. B. Woolcock, J. Gem. Microbial, 85, 372~275, 1974와 E. Kjem, Acta Pathol. Microbial. Scand, 84(3), 162~164, 1976에서 히알우론산은 스트렙토코쿠스피오겐스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 에쿠이(Streptococcus equi), 스트렙토코쿠스 에쿠이시밀리스(S. equisimilis), 스트렙토코쿠스 디스갈락티에(S. dysgalactiae), 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스(S. zooepidemicus)와 같은 스트렙토코쿠스 속에 속하는 박테리아균주를 이용하여 비교적 저렴하게 생산될 수 있음이 보고되어왔다. 그러나, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8th edition, 1974)에 따르면, 상기 언급된 모든 균주는 젖산균과 같은 스트렙토코크스속의 비오게닉군에 속해있고 란세필드 혈청군(Lancefield serum group)의 A 또는 C 타입의 박테리아이다. 즉, 이들 균주는 일반적으로 용혈성 연쇄구균으로 공지된 박테리아이며 가용성용혈소, 즉 스트렙토리신에 의한 β-용혈작용을 나타내는 것으로 공지되어있다.
스트렙토리신 생산능력과 병원성과의 상관관계는 분명히 밝혀지지 않았지만 히알우론산 생산물은 히알우론산이 상술한 균주의 배양으로부터 공업적으로 생산되었을 때 바람직하지 못하게 상술한 단백질이 혼입될 가능성이 있다. 특히, 외용 의약조성물이나 또는 화장품에 히알우론산이 배합되어야할때, 이들은 피부에 적용되는 것이므로 스트렙토리신이 히알우론산 생산물로부터 완전히 제거되는 것이 요망된다.
상술한 균주의 계대배양이 계속될때 용혈작용이 점차로 감소할뿐 아니라 히알우론산 생산능력이 저하되어 유점체 콜로니가 사라진다. 또한 그 균주의 용혈작용은 반복적인 계대배양후에도 여전히 잔존된다. 결과적으로, 스트렙토리신이 혼입되지 않은 히알우론산을 효과적으로 생산하는 것은 매우 어렵거나 거의 불가능한 것이다.
그러므로, 본 발명의 목적은 상술한 단점을 해소하고 스트렙토리신이 혼입되어있지 않은 히알우론산의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비용혈성이며 히알우론산을 효과적으로 생산할 수 있는 미생물을 발견하는 것이다.
본 발명의 다른목적과 장점은 하기 기술에 의해 명확히 설명된다.
본 발명에 의하여, (i) 비용혈성이며 배양배지에서 히알우론산을 생산할 수 있는 스트렙토코우스 속에 속하는 미생물을 배양하는 단계와 (ii) 배양생산물로부터 스트렙토리신이 혼입되지 않은 히알우론산을 분리하는 단계를 포함하는 스트렙토리신이 없는 히알우론산을 생산하는 발효법이 제공된다.
본 발명에 의한 발효에서 유용한 미생물은 비용혈성이며 히알우론산을 생산할 수 있는 스트렙토코쿠스 속에 속하는 돌연변이 주이다. 상기 돌연변이주의 전형적인 예는 일본국 미생물공업기술연구소(FRI)에 1984년 4월 14일 FERM P-7580로 기탁되고 부다페스트 조약하에 미생물공업기술연구소(FRI)(즉, 일본 쓰꾸바에 소재하는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관)에 FERM BP-784로 변경된 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스에 속하는 비용혈성의 돌연변이주인 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 NH-131이다. 이 균주는 또한 1985년 9월 5일 한국과학기술원에 수탁번호 KAIST 8168P로 기탁되었다.
균주 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 NH-131(FERM BP-784)는 몰모트의 안구결막으로부터 채취한 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스로부터 분리되었다. 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스의 비용혈성 돌연변이주의 선택적으로 하기와 같이 분리될 수 있다.
즉, 용혈작용이 감소한 균주의 세포를 찾기위하여 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 균주의 세포를 계대 배양한다.
그 선택세포에 자외선 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로 소구아니딘(이하 (NIG 라고함)을 사용하는 통상적인 돌연변이 처리를 실시한다. 그 처리세포를 혈액 한천배지(blood agar medium)상에 도말하여 생장시킨후, 비용혈작용을 가지며 점액성 콜로니를 형성할 수 있는 변이주를 선택적으로 수거한다. 이와 같이하여, 필요한 변이주가 제공될 수 있다.
스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 NH-131의 균학적 특성은 하기와 같다.
스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 NH-131 변이주는 그 균주 NH-131이 그람양성이며 β-용혈성(-)스트렙토코쿠스이며 혈액한천배지상에 투명한 점액성콜로니를 형성한다는 것을 제외하고는 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, p498(1974)에 설명되어 있는 바의 특허균주 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스의 균학적이 특징과 대체로 동일하다.
(1) 그람염색:+ 글루코오즈:+
(2) β-용혈작용:- 말토오즈:±
(3) 60℃에서 30분간 열저항성:- 락토오즈:±
(4) 40%담즙에 대한 저항성:- 슈크로오즈:+
(5) 6.5%염에 대한 저항성:- 소르비톨:-
(6) pH 9.6에서의 알카리 저항성:- 살리신:-
(7) 마뇨산 나트륨에 대한 분해능:- 글리세롤:-
(8) 에스쿨린에 대한 분해능:- 만니톨:-
(9) 젤라틴 용해성:- 트레할로오즈:-
(10) 바시트라신 감수성:+ (주)+:양성
(11) 당분의 분해능 ±:가양성
-:음성
본 발명에 의한 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 변이주는 바람직하게는 탄소원, 무기염과 선택적 유기영양분을 함유하는 배양배지에서 배양되거나 생장될 수 있다. 본 발명에 의한 전분가수 분해물, 글루코오즈(포도당), 슈크로오즈(지당), 갈락코오즈와 푸락토오즈(과당)와 같은 당분을 함유하는 탄소원이 바람직하게 사용될 수 있다. 질소원의 전형적인예는 암모늄설페이트, 소듐나이트 레이트, 암모늄이차포스페이트(즉, 디암모늄 하이드로포스페이트), 고기추출액, 펩톤, 여러아미노산의 혼합물과 효모추출액이다. 이들 성분외에도 염화나트륨, 마그네슘, 칼륨, 철, 칼슘과 인산의 다른 금속염, 황산, 탄산 및 비타민이 필요에 따라 임의로 가해질 수 있다.
당분은 배양배지에 한꺼번에 가해질 수 있다. 그러나, 그 당분이 소부분으로 배양배지에 가해지는 것이 보다 유리하며 그로써 히알우론산의 수득량이 증가된다.
본 발명에 의한 배양은 30℃ 내지 37℃의 온도에서 예로써 진탕배양 또는 호기 교반배양에 의해 호기성 조건하에 바람직하게 수행될 수 있다.
그 배양은 수용성알카리 용액으로 그 배지의 pH가 5.5 내지 9.0으로 조절됨으로써 수행되고, 목적하는 히알우론산은 안정하게 대량으로 생산될 수 있다. 수용성 알칼리용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 염기성아미노산과 저급아민과 같은 통상적인 알카리화합물중에서 하나 이상이 선택될 수 있다.
배양 후, 배양혼합물에 축적된 히알우론산은 폴리사카라이드의 분리와 정제에 대한 통상방법에 의해 회수할 수 있다. 그러나, 회수전의 배양혼합물의 산성화는 그 회수된 히알우론산의 순도가 증가하므로 바람직하다.
예컨대, 히알우론산은 하기와 같이 배양혼합물로부터 분리될 수 있다. 배양혼합물에서 그 세포와 다른 불용성성분은 여과 또는 원심분리에 의해 우선 제거된다.
그후, 산출여과물에 포함된 단백질을 예컨대, 트리클로로 아세트산 또는 클로로포름의 혼합물과 이소아밀알콜, 활성탄소 또는 활성점로와 같은 흡착제, 펩신, 파파인 또는 프로나제와 같은 단백질 분해효소로써 제거한다.
배양배지에 남아있는 저분자증량의 오염성분들은 초여과, 투석, 유기용매부가 침전법, 양이온 계면활성제 또는 이온교환수지를 사용하는 흡착방법에 의해 제거시킨다.
목적의 히알우론산은 예컨대 냉동건조, 분무건조 또는 유기용매 침전방법에 의해 그 배양혼합물로부터 회수될 수 있다.
본 발명에 의해, 목적의 스트렙토리신의 혼입이 없는 히알우론산이 고수득으로 생산될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 의해 생산되는 히알우론산은 피부에 적용되는 외용제와 화장용 조성물에 의약조성물에 유리하게 배합될 수 있다.
[실시예]
본 발명은 하기에서 더욱 상세히 설명되어지나 그로써 국한되지는 않으며 하기실시예에서 "퍼센트"는 다른 언급이 없는한 모두 중량으로 나타낸다.
[실시예 1]
몰모트의 안구결막으로부터 분리한 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스의 세포를 브레인하아트 인퓨존 배지(brain heart infusion medium, Eiken Kagaku Co., Japan에서 시판됨)에서 37℃ 온도에서 배양한다. 대수증식기증의 세포를 수거하고 원심분리를 저온에서 반복하고 그 분리된 세포를 1/20M 인산염 완충용액으로 2회 세척하여 살균시킨다. 상기와 같이 얻어진 그 세포를 100 내지 500㎍/ml를 함유하는 1/20M의 인산염 완충용액중에서 37℃의 온도로 20분간 진탕시킨후 얼음에서 냉각시킨다. 그 세포를 저온에서 1/20M 인산염 완충제로 2회 세척하고 브레인 하아트 인퓨죤 배지에 접종시킨다. 37℃온도에서 24시간 배양한다. 그리하여 용혈성을 나타내지 않고 혈액 한천 배지(Eiken Kagaku Co, Japan에서 시판)상에 도말될 때 점성콜로니를 형성하는 변이주가 얻어진다. 이 변이주 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 NH-131은 발효 연구소(일본)에 기탁되었다.
스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 NH-131(즉, FERM BP-784)는 브레인 하아트 인퓨죤 배지를 함유하는 테스트튜브에서 진탕배양한다. 말 혈액을 그 산출배양 혼합물에 가하고 37℃ 온도에서 2시간동안 정치시키면 적혈구가 테스트 튜브 바닥에 침전되고 그 상청액은 배양배지 자체의 색깔을 나타낸다. 그로서, 이 변이주는 용혈성을 가지지 않는다는 것이 증명된다.
[실시예 2]
6%의 글루코오즈, 0.5%의 효모추출액(Oriental Yeast Co., Japan에서 시판됨) 1.0%의 폴리펩톤(Daigo Eiyo Kagaku Co. Japan에서 시판됨), 0.005%의 아데카놀 LG-805(즉, Asahi Denka Kogyo Co.에서 시판되는 폴리에스테르형 지포제)으로 이루어지는 배양배지를 사용한다. 글루코즈를 제외한 배양배지 10리터를 30리터들이 자아(jar)발효기에 분주한다. 121℃에서 20분간 살균한 후 사전에 배양된 스트렙토코쿠스주에피데미쿠스 NH-131을 배양배지에 접종시킨다. 배지의 pH를 수산화나트륨으로 7.0으로 조절하면서 35℃에서 2일동안 호기교반배양을 실시한다.
글루코오즈를 별도로 살균하고 배양시작에 자아발효기에 6% 글루코오즈의 0.2부를 가하고 나머지 5.8%부를 대수증식기 생장초기(즉, 배양시작후 5 내지 7시간)에 가한다.
그 배양 진행상태는 제1도에 나타내는데 배양시간 경과에 따른 히알우론산의 생산량(g/ℓ)의 변화(×-×), 글루코오즈의 양(%) (●-●)과 균체 증식(OD660)(○-○)를 도해적으로 표시하였다.
이들 변화의 측정은 하기와 같이 실시한다:
(1) 히알우론산의 생산량은 샘플로부터 분리되는 정제된 히알우론산을 칭량하여 측정한다.
(2) 글루코오즈의 양은 YSI model 27당분 분석기(Yellow Springs Instrument Co., U.S.A.에서 제작)로 측정한다.
(3) 균체 증식은 스펙트로포토 메타에서 샘플의 660nm에서의 흡광도에 의해 측정한다.
목적의 히알우론산의 생산량은 시간경과와 함께 증가하고 배양 혼합물의 점도는 증가한다. 그러므로 배양 혼합물의 점도가 거의 최대에 달할때(배양시작으로부터 1 내지 2일후) 그 배양을 정지시킨다. 배양혼합물을 원심분리하고 그 혼합물로부터 불용성 성분을 제거한다.
그 산출혼합물에 존재하는 단백질 성분을 클로로포름과 이소아밀알콜(5:1)의 혼합물로 제거하고 그 산출혼합물에 함유 된 저분자량 물질을 초여과로 제거한다. 마지막으로 냉동 건조법에 의해 1리터의 배양액으로부터 3.6g의 목적 히알우론산을 회수한다.
백색섬유 형태로 산출된 히알우론산 생산물은 물에는 용해성이지만 메탄올, 에탄올, 아세톤, 클로로포름, 에테르와 같은 유기용매에는 불용성이며 아무맛도 냄새도 없다. 그생산물은 적외선 흡수스펙트럼, 전기영동과 진균의 히알우로니다제에 의한 분해테스트에 의해 히알우론산으로 증명 되었다.
산출된 히알우론산의 적외선 흡수 스펙트럼은 제2도에 나타낸다.

Claims (1)

  1. (i) 비용혈성이며 배양배지에 히알우론산을 생산할 수 있는 미생물, 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 NH131 (FERM BP-784)를 배양하며 (ii) 그 배양산물로 스트렙토리신이 혼입되어 있지않은 히알우론산을 채취하는 단계를 특징으로 하는 발효법에 의한 히알우론산의 제조방법.
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