KR102301455B1 - 히알루론산 및/또는 그 염 및 그 제조 방법, 그리고, 그 히알루론산 및/또는 그 염을 포함하는 식품, 화장료, 및 의약품 - Google Patents

히알루론산 및/또는 그 염 및 그 제조 방법, 그리고, 그 히알루론산 및/또는 그 염을 포함하는 식품, 화장료, 및 의약품 Download PDF

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Abstract

히알루론산 및/또는 그 염은, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이며, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하이며, 또한, 부피 밀도가 0.25 g/㎤ 보다 크다.

Description

히알루론산 및/또는 그 염 및 그 제조 방법, 그리고, 그 히알루론산 및/또는 그 염을 포함하는 식품, 화장료, 및 의약품 {HYALURONIC ACID AND/OR SALT THEREOF, METHOD FOR PRODUCING SAME, AND FOOD, COSMETIC, AND PHARMACEUTICAL CONTAINING SAID HYALURONIC ACID AND/OR SALT THEREOF}
본 발명은, 히알루론산 및/또는 그 염 및 그 제조 방법, 그리고, 그 히알루론산 및/또는 그 염을 포함하는 식품, 화장료, 및 의약품에 관한 것이다.
히알루론산은, 계관, 탯줄, 피부, 연골, 초자체, 관절액 등의 생체 조직 중에 널리 분포되어 있고, 예를 들어, 화장료, 의약품, 식품의 성분으로서 널리 이용 되고 있다. 화장품이나 의약품, 식품의 성분으로서 히알루론산을 사용하는 경우, 제제화할 때의 타정 적성 등의 취급성이 요구된다.
그런데, 히알루론산의 정제는 통상적으로, 에탄올 첨가에 의한 침전이나 동결 건조에 의해 실시된다 (특허문헌 1 및 2).
그러나, 동결 건조에 의해 히알루론산을 정제하는 경우, 통상적으로, 밀도가 낮은 고체상 (예를 들어 면상) 의 히알루론산이 얻어진다. 이와 같은 밀도가 낮은 히알루론산은, 제제화할 때의 타정 적성이 열등한 경우가 있다.
또, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 이소프로판올, 헥산 등의 유기 용매를 첨가하는 것에 의한 침전에 의해 히알루론산을 정제하는 경우, 히알루론산의 분자량이 작아지면, 이들의 유기 용매에 대해, 침전 형성이 생기기 어려워지는 경향이 있기 때문에, 정제되는 히알루론산의 양이 적은 경우가 있다.
일본 공개특허공보 2006-265287호 일본 공개특허공보 2009-155486호
본 발명은, 타정 적성 등의 취급성이 우수한 히알루론산 및/또는 그 염 및 그 제조 방법, 그리고, 그 히알루론산 및/또는 그 염을 포함하는 식품, 화장료, 및 의약품을 제공한다.
본원 발명자는, 소정의 분자량 및 부피 밀도를 갖는 히알루론산 및/또는 그 염이, 우수한 특성 (예를 들어 취급성) 을 갖는 것을 알아냈다.
1. 본 발명의 일 양태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이며, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하이며, 또한, 부피 밀도가 0.25 g/㎤ 보다 크다.
2. 상기 1 에 기재된 히알루론산 및/또는 그 염에 있어서, 평균 입자경이 10 ㎛ 이상 35 ㎛ 이하일 수 있다.
3. 상기 1 또는 2 에 기재된 히알루론산 및/또는 그 염에 있어서, 입자경의 표준 편차가 0.1 이상 0.3 이하일 수 있다.
4. 본 발명의 일 양태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염의 제조 방법은, 저급 알코올과, 평균 분자량이 3,500 이상 10 만 이하의 원료 히알루론산 및/또는 그 염과, 산을 포함하는 산성 원료 히알루론산 용액을 조제하는 공정과,
상기 조제하는 공정에서 얻어진 상기 산성 원료 히알루론산 용액 중에서 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산 가수 분해하는 공정과,
상기 산 가수 분해에 의해 얻어진 가수 분해물을 포함하는 산성 용액을 음이온 교환 수지로 처리하는 공정과,
상기 수지 처리된 상기 가수 분해물을 분무 건조 또는 동결 건조시키는 공정을 포함하고,
상기 산성 원료 히알루론산 용액은, 15 질량％ 이상 35 질량％ 이하의 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 포함하고, 또한,
상기 산성 원료 히알루론산 용액은, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염 100 질량부에 대해, 5 질량부 이상 60 질량부 이하의 상기 저급 알코올을 포함한다.
5. 상기 4 에 기재된 히알루론산 및/또는 그 염의 제조 방법에 있어서, 상기 분무 건조시키는 공정은, 상기 가수 분해물을 포함하는 액을 분무 건조시키는 공정을 포함하고, 상기 가수 분해물을 포함하는 액의 질량에 대한 상기 가수 분해물의 질량이 8 질량％ 이상 35 질량％ 이하일 수 있다.
6. 본 발명의 일 양태에 관련된 식품은, 상기 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 및/또는 그 염을 포함한다.
7. 본 발명의 일 양태에 관련된 화장료는, 상기 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 및/또는 그 염을 포함한다.
8. 본 발명의 일 양태에 관련된 의약품은, 상기 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 및/또는 그 염을 포함한다.
상기 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 및/또는 그 염은, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이며, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하이며, 또한, 부피 밀도가 0.25 g/㎤ 보다 큼으로써, 타정 적성 등의 취급성이 우수하다. 상기 히알루론산 및/또는 그 염은, 예를 들어, 식품, 화장료 및 의약품의 성분으로서 사용할 수 있다.
또, 상기 4 또는 5 에 기재된 히알루론산 및/또는 그 염의 제조 방법은, 저급 알코올과, 평균 분자량이 3,500 이상 10 만 이하의 원료 히알루론산 및/또는 그 염과, 산을 포함하는 산성 원료 히알루론산 용액을 조제하는 공정과, 상기 조제하는 공정에서 얻어진 상기 산성 원료 히알루론산 용액 중에서 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산 가수 분해하는 공정과, 상기 산 가수 분해에 의해 얻어진 가수 분해물을 포함하는 산성 용액을 음이온 교환 수지로 처리하는 공정과, 상기 수지 처리된 상기 가수 분해물을 분무 건조 또는 동결 건조시키는 공정을 포함하고, 상기 산성 원료 히알루론산 용액은, 15 질량％ 이상 35 질량％ 이하의 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 포함하고, 또한, 상기 산성 원료 히알루론산 용액은, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염 100 질량부에 대해, 5 질량부 이상 60 질량부 이하의 상기 저급 알코올을 포함함으로써, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이며, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하이며, 또한, 부피 밀도가 0.25 g/㎤ 보다 큰 히알루론산 및/또는 그 염을 효율적으로 제조할 수 있다.
이하, 도면을 참조하면서, 본 발명을 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명에 있어서, 특별히 언급하지 않는 한 「부」 는 「질량부」 를 의미하고, 「％」 는 「질량％」 를 의미한다.
［히알루론산 및/또는 그 염］
본 발명의 일 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이며, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하이며, 또한, 부피 밀도 (bulk density) 가 0.25 g/㎤ 보다 크다.
(히알루론산의 정의)
본 발명에 있어서, 「히알루론산」 이란, 글루크론산과 N-아세틸글루코사민의 2 당으로 이루어지는 반복 구성 단위를 1 이상 갖는 다당류를 말한다. 또, 「히알루론산의 염」 으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 식품 또는 약학상 허용할 수 있는 염인 것이 바람직하고, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 아연염, 마그네슘염, 암모늄염 등을 들 수 있다.
히알루론산은, 기본적으로는 β-D-글루크론산의 1 위치와 β-D-N-아세틸-글루코사민의 3 위치가 결합한 2 당 단위를 적어도 1 개 포함하는 2 당 이상인 것이며 또한 β-D-글루크론산과 β-D-N-아세틸-글루코사민으로 기본적으로 구성되고, 2 당 단위가 1 개나 또는 복수개 결합한 것이다. 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 비환원 말단당 (예를 들어, 글루크론산의 4, 5 위치 탄소간이 불포화인 것) 을 실질적으로 포함하지 않을 (즉, 비환원 말단당의 함유량이 1 질량％ 이하) 수 있다.
본 발명에 있어서, 「2 당 (disaccharide)」 이란, β-D-글루크론산의 1 위치와 β-D-N-아세틸-글루코사민의 3 위치가 결합한 2 당 단위 1 개 (2 개의 당으로 구성된다) 를 말하며, 「4 당 (tetrasaccharide)」 이란, 당해 2 당 단위 2 개 (4 개의 당으로 구성된다) 를 말하며, 「6 당 (hexasaccharide)」 이란, 당해 2 당 단위 3 개 (6 개의 당으로 구성된다) 를 말하며, 「8 당 (octasaccharide))」 이란, 당해 2 당 단위 4 개 (8 개의 당으로 구성된다) 를 말한다. 또한, 본 발명에 있어서, 2 당, 4 당, 6 당 및 8 당은 모두, 비환원 말단당을 포함하지 않는 것 (포화당) 을 말한다.
(부피 밀도)
본 발명에 있어서, 「부피 밀도」 는, 「제 16 개정 일본 약국방, 3. 분체 물성 측정법, 3. 01 부피 밀도 및 탭 밀도 측정법」 에 기재된 방법에 준하여 측정된 값이다. 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 또한, 부피 밀도가 0.25 g/㎤ 보다 큼으로써, 저분자이면서, 타정 적성 (tableting adequacy) 등의 취급성 (handling ability) 이 우수하다.
(평균 분자량)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 순도를 보다 높게 할 수 있는 점에서, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 2,500 이하인 것이 바람직하고, 한편, 통상적으로 800 이상이며, 1,000 이상인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 히알루론산 및/또는 그 염의 평균 분자량은, 후술하는 HPLC 를 사용한 방법으로 측정할 수 있다.
보다 구체적으로는, 각 HPLC 측정에 의해 얻어진 히알루론산 및/또는 그 염의 각 피크의 분자량 (예를 들어 2 당이면 분자량 400) 에 피크 면적을 곱한 값을 산출하고, 이 피크마다 산출한 값을 적산한다. 또한, 이 적산한 값을 전체의 피크 면적으로 나눔으로써, 평균 분자량을 산출할 수 있다.
(순도)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 순도가 90 ％ 이상일 수 있고, 95 ％ 이상인 것이 바람직하고, 98 ％ 이상인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 「순도」 란, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염 중 히알루론산 및/또는 그 염 이외의 성분을 제외한 비율을 말한다. 히알루론산 및/또는 그 염 이외의 성분으로서는, 예를 들어, 단당 (예를 들어, 글루크론산, N-아세틸글루코사민, 및 이들에서 유래하는 단당), 비환원 말단당을 들 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염의 순도는, 예를 들어, 히알루론산 및/또는 그 염의 HPLC 의 스펙트럼 데이터로부터, 단당에 상당하는 피크를 나눔으로써 산출할 수 있다. 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염에 있어서, 단당의 비율은 통상적으로 3 질량％ 이하이며, 2 질량％ 이하인 것이 바람직하다.
(백색도)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 색의 색상을 나타내는 b 값 (이하, 간단히 「b 값」 이라고도 한다) 이 10 이하일 수 있고, 8 이하인 것이 바람직하고, 5 이하인 것이 보다 바람직하고, 통상적으로 0 이상이다.
b 값은, 물질이 갖는 색의 색상 (hue) 을 규정하는 값이며, b 값이 클수록 황색 기미가 강한 것을 나타내고, 한편, b 값이 작을수록 청색 기미가 강한 것을 나타낸다.
본 발명의 저분자 히알루론산 및/또는 그 염은, 색의 명도를 나타내는 L 값 (이하, 간단히 「L 값」 이라고도 한다) 이 90 이상이며, L 값이 92 이상인 것이 보다 바람직하고, L 값이 93 이상인 것이 더욱 바람직하다.
L 값은, 물질이 갖는 색의 명도 (lightness) 를 규정하는 값이며, 0 ∼ 100 사이의 수치로 나타낸다. L 값이 100 인 경우 가장 밝은 상태 (완전한 백색) 를 나타내고, 한편, L 값이 0 인 경우 가장 어두운 상태 (완전한 흑색) 를 나타낸다.
b 값 및 L 값은, JIS Z 8730-1995 에 의해 규정되는 색차 표시 방법에 의해, Lab 계 색도 좌표에서 표시될 수 있다. 또, b 값 및 L 값은, 시판되는 색차계에 의해 측정할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서는, 고체의 저분자 히알루론산 및/또는 그 염에 대해, b 값 및 L 값을 측정하는 것으로 한다.
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염의 b 값 및 L 값은, 예를 들어, 색차계 (상품명 「COLOR AND COLOR DIFFERENCE METER MODEL 1001 DP」, 닛폰 덴쇼쿠 공업 주식회사 제조) 에 10 Φ 렌즈를 장착하고, 유리 셀에 측정 시료 1 g 이상을 전면에 깔아 측정할 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염에 의하면, 색차계에 의해 측정된 색의 색상을 나타내는 b 값이 10 이하 (나아가서는 L 값이 90 이상) 임으로써, 높은 백색도를 갖기 때문에, 예를 들어, 화장료, 식품, 및 의약품의 원료로서 사용할 수 있다.
(황 함량 및 염소 함량)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염에 의하면, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하임으로써, 타정 적성이 우수하다. 히알루론산 및/또는 그 염 중의 염소 함량 또는 황 함량이 1 질량％ 를 초과하면, 염화나트륨 등의 염소의 금속염이나 황산나트륨 등의 금속염이 증가함으로써, 입자 형상의 불균일성이 커지고, 타정 시의 결착력을 약하게 한다고 추찰된다. 이에 대하여, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하이며, 염소의 함량 및 황의 함량이 적은 점에서, 입자 형상의 균일성이 커지고, 타정 시의 결착력을 높일 수 있기 때문에, 타정 적성이 향상된다.
또, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 후술하는 바와 같이, 식품을 비롯하여, 의약품, 화장료에 사용된다.
예를 들어, 염화나트륨을 비롯한 염류는, 계의 안정성을 저해할 가능성이 있다. 특히 유화계에 있어서는, 해유화(解乳化)의 요인이 될 수 있다. 또, 이들은 피부나 모발에 직접 도포하거나, 또는 섭식하는 것이기 때문에, 어느 이유에 의해서도, 염화나트륨 등의 할로겐화물이나 황산나트륨 등의 금속염, 그리고 염산이나 황산 등의 산에서 유래하는 염소나 황은 최대한 저감된 것이 요망된다.
따라서, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 부피 밀도가 높고, 또한, 유화 안정성 및 안전성을 높일 수 있는 점에서도, 염소 함량이 1 질량％ 이하일 수 있고, 0.8 질량％ 이하인 것이 바람직하고, 0.5 질량％ 이하인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염의 염소 함량 및 황 함량은, 공지된 방법 (예를 들어 원소 분석 (연소법, ICP 발광 분광 분석법, 원자 흡광법, 형광 X 선 분석법), 질량 분석) 에 의해 측정할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염의 염소 함량은, 몰법으로 측정한 값으로부터 산출함으로써 측정할 수 있다.
(평균 입자경)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 타정 적성이 보다 우수한 점에서, 평균 입자경이 10 ㎛ 이상 35 ㎛ 이하일 수 있고, 15 ㎛ 이상인 것이 바람직하고, 한편, 30 ㎛ 이하인 것이 바람직하다.
(입자경의 표준 편차)
입자경의 표준 편차 (standard deviation) 는, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염의 입자경의 편차를 나타내는 지표이다. 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 입자경의 편차가 적기 때문에, 밀도를 보다 높일 수 있음으로써, 타정 적성을 보다 높일 수 있는 점에서, 입자경의 표준 편차가 0.1 이상 0.3 이하일 수 있고, 0.15 이상인 것이 바람직하고, 한편, 0.25 이하인 것이 바람직하다.
(2 당의 비율)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 히알루론산 본래의 생리 기능을 발휘할 수 있는 점에서, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이며, 5 질량％ 이상인 것이 바람직하고, 8 질량％ 이상인 것이 보다 바람직하고, 한편, 25 질량％ 이하인 것이 바람직하고, 20 질량％ 이하인 것이 보다 바람직하다.
동물 또는 미생물 유래의 효소 (히알루론산 분해 효소) 를 사용하여 히알루론산 및/또는 그 염을 저분자화하는 경우, 통상적으로, 2 당 (포화 2 당) 을 얻는 것이 곤란하다. 이에 대하여, 후술하는 제조 방법을 사용함으로써, 2 당을 포함하는 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하인 점에서, 짧은 당사슬의 당을 소정량 포함한다. 이로써, 흡습성이 높아지고, 결착력이 늘어나기 때문에, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 부피가 큰 입자로서 얻을 수 있다. 또, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 단당의 비율이 1.5 질량％ 이상 3 질량％ 이하일 수 있다.
(히알루론산 분해 효소)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 항원성을 보다 저감할 수 있는 점에서, 히알루론산 분해 효소를 함유하지 않을 수 있다. 본 발명에 있어서, 「히알루론산 분해 효소를 함유하지 않는다」 란, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염에 있어서의 히알루론산 분해 효소의 함유량이 1 질량％ 이하인 것을 말한다. 항원성이 저감되어 있는 점에서, 예를 들어, 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 산 분해 (예를 들어 후술하는 본 실시 형태에 관련된 제조 방법) 에 의해 얻어진, 산 분해 히알루론산 및/또는 그 염인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는, 제조 방법의 어느 하나로 산 분해를 거쳐 얻어진 산 분해 히알루론산 및/또는 그 염인 것이 보다 바람직하다.
효소 (히알루로니다아제) 를 사용하여 히알루론산 및/또는 그 염을 저분자화하는 경우, 저분자화된 히알루론산 및/또는 그 염에 히알루론산 분해 효소가 잔존하는 경우가 있다.
이에 대하여, 후술하는 실시 형태에 관련된 제조 방법에 의해, 히알루론산 분해 효소를 사용하지 않고 얻어진 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 히알루론산 분해 효소를 함유하지 않기 때문에, 항원성이 보다 저감되어 있다.
(8 당의 비율)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 8 당에서 유래하는 생리 활성을 보다 확실하게 발휘할 수 있는 점에서, 8 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하일 수 있고, 5 질량％ 이상인 것이 보다 바람직하다.
(2 당, 4 당, 6 당 및 8 당의 합계)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 2 당, 4 당, 6 당 및 8 당의 합계가 5 질량％ 이상 80 질량％ 이하일 수 있고, 10 질량％ 이상인 것이 바람직하고, 한편, 70 질량％ 이하인 것이 바람직하다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 또한, 2 당, 4 당, 6 당 및 8 당의 합계가 5 질량％ 이상 80 질량％ 이하일 수 있고, 또한 20 질량％ 이상 60 질량％ 이하일 수 있다. 이 경우, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하일 수 있다. 또, 이 경우, 8 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 히알루론산 및/또는 그 염에 있어서의 2 당, 4 당, 6 당 및 8 당의 비율 (질량％) 은, 히알루론산 및/또는 그 염에 대한 HPLC 에 의해 동정할 수 있다. 보다 구체적으로는, 각 HPLC 측정에 의해 얻어진 히알루론산 및/또는 그 염의 각 피크 (예를 들어 2 당이면 분자량 400) 의 피크 면적을 전체의 피크 면적으로 나눔으로써, 히알루론산 및/또는 그 염에 있어서의 2 당, 4 당, 6 당 및 8 당의 비율 (질량％) 을 산출할 수 있다.
(동점도)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 그 히알루론산 및/또는 그 염의 5 질량％ 수용액의 동점도가 2.0 ㎟/s 이하 (바람직하게는, 1.5 ㎟/s 이하, 보다 바람직하게는 1.3 ㎟/s 이하) 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 히알루론산 및/또는 그 염의 5 질량％ 수용액의 동점도는, 우베로데 점도계 (시바타 과학 기계 공업 주식회사 제조) 를 사용하여 측정할 수 있다. 이 때, 유하 초수가 200 ∼ 1000 초가 되는 계수의 우베로데 점도계를 선택한다. 또, 측정은 30 ℃ 의 항온 수조 중에서 실시하여, 온도 변화가 없도록 한다. 우베로데 점도계에 의해 측정된 상기 수용액의 유하 초수와 우베로데 점도계의 계수의 곱에 의해, 동점도 (단위 ： ㎟/s) 를 구할 수 있다.
(작용 효과)
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염에 의하면, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이며, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하이며, 또한, 부피 밀도가 0.25 g/㎤ 보다 큼으로써, 예를 들어 타정 적성 등의 취급성이 우수하다.
［히알루론산 및/또는 그 염의 제조 방법］
본 발명의 일 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염의 제조 방법 (이하, 「제 1 제조 방법」 이라고도 한다.) 은, 저급 알코올 (lower alcohol) 과 평균 분자량이 3,500 이상 10 만 이하의 원료 히알루론산 및/또는 그 염과 산을 포함하는 산성 원료 히알루론산 용액을 조제하는 공정과, 상기 조제하는 공정에서 얻어진 상기 산성 원료 히알루론산 용액 중에서 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산 가수 분해하는 공정 (이하, 「액상 (liquid phase) 분해 공정」 이라고도 한다.) 과, 상기 산 가수 분해에 의해 얻어진 가수 분해물을 포함하는 산성 용액을 음이온 교환 수지로 처리하는 공정 (이하, 「음이온 교환 수지 처리 공정」 이라고도 한다.) 과, 상기 수지 처리된 상기 가수 분해물을 분무 건조 (spray-drying) 또는 동결 건조 (freeze-drying) 시키는 공정 (이하, 「분무 건조 공정」 또는 「동결 건조 공정」 이라고도 한다.) 을 포함하고, 상기 산성 원료 히알루론산 용액은, 15 질량％ 이상 35 질량％ 이하의 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 포함하고, 또한, 상기 산성 원료 히알루론산 용액은, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염 100 질량부에 대해, 5 질량부 이상 60 질량부 이하의 상기 저급 알코올을 포함한다.
＜산성 원료 히알루론산 용액을 조제하는 공정＞
산성 원료 히알루론산 용액을 조제하는 공정에서는, 저급 알코올과 평균 분자량이 3,500 이상 10 만 이하의 원료 히알루론산 및/또는 그 염과 산을 포함하는 산성 원료 히알루론산 용액을 조제한다.
(원료 히알루론산 및/또는 그 염의 분자량)
본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 있어서, 분자량이 3,500 이하이며 백색도가 높은 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있는 점에서, 산성 원료 히알루론산 용액에 포함되는 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 분자량은 5,000 이상인 것이 바람직하고, 6,000 이상인 것이 보다 바람직하고, 8,000 이상인 것이 더 바람직하고, 한편, 5 만 이하인 것이 바람직하고, 2 만 이하인 것이 보다 바람직하다.
((출발) 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 분자량의 측정 방법)
본 발명에 있어서, 원료 히알루론산 및/또는 그 염 (그리고, 후술하는 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염) 의 평균 분자량은, 하기의 방법으로 측정할 수 있다. 즉, 약 0.05 g 의 히알루론산 (본품) 을 정밀하게 재어, 0.2 mol/ℓ 농도의 염화나트륨 용액에 녹여, 정확하게 100 ㎖ 로 한 용액 및 이 용액 8 ㎖, 12 ㎖ 그리고 16 ㎖ 를 정확하게 재어, 각각에 0.2 mol/ℓ 농도의 염화나트륨 용액을 첨가하여 정확하게 20 ㎖ 로 한 용액을 시료 용액으로 한다. 이 시료 용액 및 0.2 mol/ℓ 농도의 염화나트륨 용액에 대해, 일본 약국방 (제 16 개정) 일반 시험법의 점도 측정법 (제 1 법 모세관 점도 측정법) 에 의해 30.0 ± 0.1 ℃ 에서 비점도를 측정하고 (식 (A)), 각 농도에 있어서의 환원 점도를 산출한다 (식 (B)). 환원 점도를 세로축에, 본품의 환산한 건조물에 대한 농도 (g/100 ㎖) 를 가로축에 취하여 그래프를 그리고, 각 점을 연결하는 직선과 세로축의 교점으로부터 극한 점도를 구한다. 여기서 구해진 극한 점도를 Laurent 의 식 (식 (C)) 에 대입하여, 평균 분자량을 산출한다 (Torvard C Laurent, Marion Ryan, and Adolph Pietruszkiewicz, ”Fractionation of hyaluronic Acid”, Biochemina et Biophysica Acta., 42, 476-485 (1960), 요모타 치카코, 「히알루론산나트륨 제제의 SEC-MALLS 에 의한 분자량 평가」, 국립위연보, 제 121 호, 030-033 (2003)).
(식 A)
비점도 = {시료 용액의 소요 유하 초수)/(0.2 mol/ℓ 염화나트륨 용액의 소요 유하 초수)} - 1
(식 B)
환원 점도 (㎗/g) = 비점도/(본품의 환산한 건조물에 대한 농도 (g/100 ㎖))
(식 C)
극한 점도 (㎗/g) = 3.6 × 10-4M0.78
M ： 평균 분자량
(원료 히알루론산 및/또는 그 염의 농도)
산성 원료 히알루론산 용액에서는, 원료 히알루론산 및/또는 그 염이 산성 원료 히알루론산 용액 중에 용해되는 농도로 하는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로는, 액상 분해 공정에 있어서, 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지하면서, 또한 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 저분자화 (예를 들어, 얻어지는 히알루론산 및/또는 그 염의 평균 분자량을 3,500 이하로 하는 것) 를 달성할 수 있고, 또한, 단당의 발생을 억제할 수 있는 점에서, 산성 원료 히알루론산 용액에 있어서의 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 농도 (그 산성 원료 히알루론산 용액의 질량에 대한 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 질량) 가 15 질량％ 이상이며, 16 질량％ 이상인 것이 바람직하고, 18 질량％ 이상인 것이 보다 바람직하고, 한편, 35 질량％ 이하이며, 32 질량％ 이하인 것이 바람직하다.
(용매)
원료 히알루론산 및/또는 그 염의 용해성이 우수한 점에서, 산성 원료 히알루론산 용액에 사용되는 용매는 함수 용매 (바람직하게는 물) 인 것이 바람직하지만, 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 용해시킬 수 있는 것이면, 그 용매는, 물, 또는, 물과 혼화되는 유기 용매를 30 질량％ 이하 포함하는 함수 용매여도 된다.
(저급 알코올)
본 발명에 있어서 「저급 알코올」 이란, 탄소 원자수 1, 2 또는 3 의 알코올을 말하며, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 및 2-프로판올을 들 수 있다. 이 중, 1 종 또는 2 종 이상을 저급 알코올로서 사용할 수 있다. 저급 알코올로서는, 예를 들어, 메탄올 및/또는 에탄올이 바람직하고, 에탄올이 보다 바람직하다.
최종적으로 얻어지는 히알루론산 및/또는 그 염의 분자량을 보다 확실하게 3,500 이하로 조정할 수 있는 점에서, 상기 산성 원료 히알루론산 용액은, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염 100 질량부에 대해, 10 질량부 이상, 또는, 50 질량부 이하의 상기 저급 알코올을 포함하는 것이 바람직하다.
(산)
상기 산성 원료 히알루론산 용액에 포함되는 산은, 그 산성 원료 히알루론산 용액의 pH 를 산성으로 조정할 수 있는 산이면, 어느 산을 사용할 수 있다. 산의 사용량을 저감할 수 있는 관점에서, 그 산은 예를 들어, 염산, 황산, 브롬화수소산, 질산, 인산 등의 무기산, 아세트산, 시트르산, 술폰기 함유 유기산 (예를 들어, 파라톨루엔술폰산, 트리플루오로메탄술폰산), 불소 원자 함유 유기산 (예를 들어, 트리플루오로아세트산) 등의 유기산을 사용할 수 있다.
(첨가 방법)
상기 산성 원료 히알루론산 용액을 조제하는 공정에서는, 상기 저급 알코올과, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 혼합물 (여기서, 상기 혼합물은, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염 100 질량부에 대해 5 질량부 이상 60 질량부 이하의 상기 저급 알코올을 포함한다.) 을, 산을 포함하는 액 (산성액) 에 첨가함으로써, 상기 산성 원료 히알루론산 용액을 조제할 수 있다.
혹은, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염 및 저급 알코올을 포함하는 용액에 산을 첨가함으로써, 상기 산성 원료 히알루론산 용액을 조제할 수도 있다.
상기 산성액에 상기 혼합물을 첨가하여, 상기 산성 원료 히알루론산 용액을 조제하는 경우, 상기 혼합물에서는, 원료 히알루론산 및/또는 그 염이 저급 알코올로 습윤되어 있을 수 있다. 이 경우, 후술하는 고상 분해 공정에 있어서 얻어진 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 사용하여 산성 원료 히알루론산 용액을 조제하는 경우, 그 고상 분해 공정을 실시한 후의 데칸테이션으로, 그 고상 분해 공정에서 사용한 저급 알코올이 원하는 비율이 되도록 조정함으로써, 상기 산성 원료 히알루론산 용액을 조제해도 된다.
본 발명에 있어서, 「원료 히알루론산 및/또는 그 염을 저급 알코올로 습윤시킨다」 란, 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 적어도 일부가 저급 알코올 중에서 고체로서 존재하고, 이 고체의 원료 히알루론산 및/또는 그 염이 저급 알코올에 의해 눅눅해져서 팽창된 상태를 말한다.
상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염이 저급 알코올로 습윤되어 있는 상태에서, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염과 저급 알코올의 혼합물을 상기 산성액 중에 첨가하여, 상기 산성 원료 히알루론산 용액을 조제함으로써, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염이 산성액 중에서 응어리가 되는 것 (즉, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염이 산성액 중에서 응집하여, 산 용액 중에서 균일하게 분산되지 않는 것) 을 방지하여, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 산성액에서의 분산성을 높일 수 있다.
저분자화의 진행을 보다 용이하게 할 수 있는 점에서, 상기 혼합물을 첨가하기 전의 상기 산성액의 질량을 100 질량부로 한 경우, 상기 혼합물을 첨가하기 전의 상기 산성액의 질량에 대한, 첨가하는 상기 혼합물의 질량 (상기 혼합물의 질량/상기 혼합물을 첨가하기 전의 상기 산성액의 질량) 이 10 질량부 이상 40 질량부 이하인 것이 바람직하고, 20 질량부 이상인 것이 보다 바람직하고, 한편, 30 질량부 이하인 것이 보다 바람직하다.
(산성 원료 히알루론산 용액의 pH)
또, 액상 분해 공정에 있어서, 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지하고, 또한 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 저분자화를 달성할 수 있는 점에서, 상기 산성 원료 히알루론산 용액의 pH 는 0.2 이상 2 이하일 수 있고, 0.3 이상인 것이 바람직하고, 0.5 이상인 것이 보다 바람직하고, 0.8 이상인 것이 더욱 바람직하고, 한편, 1.8 이하인 것이 바람직하고, 1.5 이하인 것이 보다 바람직하고, 1.0 이하인 것이 더욱 바람직하다.
＜액상 분해 공정＞
액상 분해 공정 (제 1 저분자화 공정) 에서는, 평균 분자량이 3,500 이상 10 만 이하의 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 15 질량％ 이상 35 질량％ 이하 포함하는 산성 원료 히알루론산 용액 중에 유지하여, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산 가수 분해한다. 이로써, 원료 히알루론산 및/또는 그 염이 산 가수 분해에 의해 저분자화되어, 분자량이 보다 작은 가수 분해물 (히알루론산 및/또는 그 염) 이 얻어진다.
(반응 온도)
액상 분해 공정에서는, 저분자화된 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지할 수 있는 점에서, 반응액의 온도는 통상적으로 85 ℃ 이하 (바람직하게는 80 ℃ 이하) 인 것이 바람직하고, 60 ℃ 이상 (바람직하게는 65 ℃ 이상) 인 것이 보다 바람직하다.
(반응 시간)
액상 분해 공정에서는, 저분자화된 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지할 수 있는 점에서, 반응 시간은 통상적으로 30 분 이상 10 시간 이하인 것이 바람직하고, 60 분 이상 8 시간 이하인 것이 보다 바람직하다.
(얻어지는 히알루론산 및/또는 염의 분자량)
액상 분해 공정에 의해, 평균 분자량이 3,500 이하 (바람직하게는 2,800 이하, 보다 바람직하게는 2,500 이하, 한편, 바람직하게는 1,000 이상, 보다 바람직하게는 1,200 이상) 의 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있다.
＜음이온 교환 수지 처리 공정＞
본 실시 형태에 관련된 제조 방법에서는, 상기 액상 분해 공정 후, 상기 산 가수 분해에 의해 얻어진 가수 분해물을 포함하는 산성 용액을 음이온 교환 수지로 처리한다. 여기서, 가수 분해물은, 원료 히알루론산 및/또는 그 염이 저분자화되어 얻어진, 원료 히알루론산 및/또는 그 염보다 분자량이 작은 히알루론산 및/또는 그 염이다.
음이온 교환 수지 처리 공정을 실시함으로써, 상기 산성 용액 중의 음이온 (예를 들어 염화물 이온, 브롬화물 이온, 불화물 이온, 요오드화물 이온 등의 할로겐화물 이온이나, 황산 이온 등의 황화물 이온) 을 제거할 수 있기 때문에, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 의해 최종적으로 얻어지는 히알루론산 및/또는 그 염에 포함되는, 음이온에서 유래하는 원소 (예를 들어, 염소나 황) 의 함량을 저감할 수 있다.
음이온 교환 수지 처리 공정에서는, 액상 분해 공정 후, 액상 분해 공정에 의해 얻어진 가수 분해물을 포함하는 상기 산성 용액을 음이온 교환 수지로 처리하기 때문에, 처리의 효율이 우수하다. 이 경우, 사용하는 음이온 교환 수지로서는, 예를 들어, 강염기성, 약염기성, 나아가서는 겔형이나 포러스형의 이온 교환 수지를 들 수 있다. 또한, 수지에 대한 데미지를 적게 하기 위해, 상기 산성 용액에 알칼리를 첨가하여, 그 산성 용액의 pH 를 높게 하고 나서 (pH 7 미만), 그 산성 용액을 음이온 교환 수지로 처리해도 된다.
또, 음이온 교환 수지 처리 공정에서는, 예를 들어, 상기 유지 (산 가수 분해) 후의 상기 산성 용액 중에 음이온 교환 수지를 첨가하여 교반해도 된다. 예를 들어, 음이온 교환 수지를 용기 내에 고정화시켜 두고, 그 용기 중에 상기 산성 용액을 넣고, 교반하여, 산성 용액 중의 히알루론산 및/또는 그 염을 음이온 교환 수지와 접촉시킴으로써, 음이온 (예를 들어, 상기에 예시되는 음이온) 을 제거할 수 있다. 이 경우, 음이온 교환 수지를 용기에 고정화시켜도 된다. 음이온 교환 수지를 고정화함으로써, 음이온 교환 수지와 산성 용액을 처리 후에 용이하게 분리할 수 있다. 혹은, 상기 유지 (산 가수 분해) 후의 상기 산성 용액을, 음이온 교환 수지를 충전한 칼럼에 통액해도 된다.
또한, 액상 분해 공정 (예를 들어, 음이온 교환 수지 처리 공정) 에서 얻어진 액의 pH 를 조정한 후에 분무 건조 또는 동결 건조를 실시해도 된다. 이 경우, 최종적으로 얻어지는 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지할 수 있고, 또한, 안정성을 높일 수 있는 점에서, 그 액의 pH 를 4 이상 8 이하 (바람직하게는 5 이상, 또는 7 이하) 로 조정하는 것이 바람직하다.
pH 의 조제는, 염기성 물질 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 등의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 수산화물, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘, 탄산마그네슘 등의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 탄산염, 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 중탄산칼슘, 중탄산마그네슘 등의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 중탄산염 등의 염기성 무기염, 혹은 염기성 유기염) 을 사용하여 실시할 수 있다.
＜분무 건조 공정 또는 동결 건조 공정＞
본 실시 형태에 관련된 제조 방법은, 음이온 교환 수지 처리 공정 후에, 상기 수지 처리 (음이온 교환 수지에 의한 처리) 된 상기 가수 분해물을 분무 건조 또는 동결 건조시키는 공정을 포함한다.
＜분무 건조 공정＞
분무 건조 공정에서는, 상기 가수 분해물을 포함하는 액을 분무 건조시켜, 고체의 히알루론산 및/또는 그 염을 얻는다. 즉, 상기 분무 건조 공정에 의해, 분자량이 3,500 이하이며, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이며, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하이며, 또한, 부피 밀도가 0.25 g/㎤ 보다 큰 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있다.
즉, 분무 건조 공정에 의해, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있다. 분무 건조 공정에 있어서, 상기 액상 분해 공정 및 음이온 교환 수지 처리 공정을 실시한 후에 얻어지는, 가수 분해물을 포함하는 액을 분무 건조시킴으로써, 최종적으로 얻어지는 히알루론산 및/또는 그 염의 음이온 함량을 저감할 수 있고, 또한, 부피가 크고 편차가 적은 히알루론산 및/또는 그 염의 입자를 얻을 수 있다.
(히알루론산 및/또는 그 염의 농도)
보다 구체적으로는, 분무 건조 공정에서는, 분무를 적절히 실시할 수 있는 점에서, 분무 건조시키는 액은, 가수 분해물을 8 질량％ 이상 35 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하고, 10 질량％ 이상 포함하는 것이 보다 바람직하고, 11 질량％ 이상 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 한편, 30 질량％ 이하인 것이 바람직하고, 28 질량％ 이하 포함하는 것이 보다 바람직하고, 26 질량％ 이하 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 24 질량％ 이하 포함하는 것이 특히 바람직하다.
여기서, 분무 건조시키는 액에 포함되는, 가수 분해물의 양은, 액상 분해 공정의 산성 원료 히알루론산 용액 중에 포함되는 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 함유량을, 가수 분해물의 함유량으로 간주하여 산출된 값이다.
(분무 건조 장치)
분무 건조 공정에서는, 시판되는 분무 건조 장치를 사용하여 분무 건조를 실시할 수 있다. 시판되는 분무 건조 장치로서는, 디스크형 스프레이 드라이어나 베인형 스프레이 드라이어를 들 수 있다.
(분무 온도)
분무 건조 공정에서는, 히알루론산 및/또는 그 염의 동결 및 갈변을 방지할 수 있는 점에서, 분무 건조 공정에 있어서의 히터 온도는 통상적으로 200 ℃ 이하 (바람직하게는 170 ℃ 이하) 인 것이 바람직하고, 150 ℃ 이상 (바람직하게는 100 ℃ 이상) 인 것이 보다 바람직하다.
평균 분자량이 3,500 이상의 히알루론산 및/또는 그 염은 점도가 높기 때문에, 분무 건조에 의해 정제를 실시하는 경우, 분무를 적절히 실시하기 위해서는, 통상적으로, 히알루론산 및/또는 그 염을 포함하는 액의 점도를 저감한 상태 (예를 들어, 히알루론산 및/또는 그 염의 농도가 통상적으로 1 질량％ 이상 8 질량％ 이하) 로 조정할 필요가 있다.
이에 대하여, 가수 분해물은 저점도이기 때문에, 음이온 교환 수지 처리 공정에서 얻어진 액을 희석하지 않고 (혹은 희석의 양이 적은 상태로), 분무 건조 공정에 있어서 분무를 실시할 수 있기 때문에, 효율적이다.
＜동결 건조 공정＞
보다 구체적으로는, 동결 건조 공정에서는, 동결을 적절히 실시할 수 있는 점에서, 동결 건조시키는 액은, 가수 분해물을 8 질량％ 이상 35 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하고, 10 질량％ 이상 포함하는 것이 보다 바람직하고, 11 질량％ 이상 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 한편, 28 질량％ 이하 포함하는 것이 보다 바람직하고, 26 질량％ 이하 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 24 질량％ 이하 포함하는 것이 특히 바람직하다.
여기서, 동결 건조시키는 액에 포함되는 가수 분해물의 양은, 액상 분해 공정의 산성 원료 히알루론산 용액 중에 포함되는 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 함유량 (또는, 액상 분해 공정의 산성 원료 히알루론산 용액 중에 포함되는 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 함유량) 을 가수 분해물의 함유량으로 간주하여 산출된 값이다.
(동결 건조 장치)
동결 건조 공정에서는, 시판되는 동결 건조 장치를 사용하여 동결 건조를 실시할 수 있다. 시판되는 동결 건조 장치로서는, 얼백사 동결 건조기 (DFR-5N-B) 를 들 수 있다.
(동결 건조 온도)
동결 건조 공정에서는, 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지할 수 있는 점에서, 동결 건조 공정에 있어서의 온도는 통상적으로 -20 ℃ 이하 (바람직하게는 -30 ℃ 이하) 인 것이 바람직하고, -80 ℃ 이상 (바람직하게는 -70 ℃ 이상) 인 것이 보다 바람직하다.
＜고상 분해 공정＞
본 실시 형태에 관련된 제조 방법에서는, 상기 액상 분해 공정 (제 1 저분자화 공정) 전에, 제 2 저분자화 공정으로서 평균 분자량이 3,000 이상 50 만 이하의 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산성 함수 매체 (medium) 중에 분산시켜, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 얻는 공정 (이하, 「고상 (solid phase) 분해 공정」 이라고도 한다.) 을 추가로 포함할 수 있다.
고상 분해 공정에서는, 그 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 저분자화하여, 상기 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 얻는다. 보다 구체적으로는, 고상 분해 공정에서는, 상기 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산성 함수 매체 중에 분산시킴으로써, 상기 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 적어도 일부를 산성 함수 매체에 용해시키지 않고, 상기 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 고체 상태 (보다 구체적으로는, 상기 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염이, 상기 산성 함수 매체 중에 현탁한 상태) 로 산과 반응시킬 수 있다. 이로써, 얻어지는 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지할 수 있고, 또한, 부생성물 (히알루론산의 분해물, 예를 들어 단당이나 비환원 말단당 등) 의 생성을 방지할 수 있기 때문에, 얻어지는 히알루론산 및/또는 그 염의 순도를 높일 수 있다.
또, 고상 분해 공정에 의하면, 상기 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 적어도 일부를 산성 함수 매체에 용해시키지 않고 고체 상태로 산과 반응시킬 수 있기 때문에, 저분자화된 히알루론산 및/또는 그 염이 반응액에 용해되어 산과 반응함으로써 단당이 생성되는 것을 억제할 수 있다. 그 결과, 계속되는 액상 분해 공정을 얻어 최종적으로 얻어지는 가수 분해물 (히알루론산 및/또는 그 염) 중의 2 당의 비율을 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하로 조정할 수 있고, 또한, 계속되는 액상 분해 공정을 거쳐 최종적으로 얻어지는 가수 분해물 (히알루론산 및/또는 그 염) 중의 8 당의 비율을 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하로 조정할 수 있고, 또한, 계속되는 액상 분해 공정을 얻어 최종적으로 얻어지는 가수 분해물 (히알루론산 및/또는 그 염) 중의 2 당, 4 당, 6 당 및 8 당의 합계를 5 질량％ 이상 80 질량％ 이하로 조정할 수 있다.
또한, 평균 분자량이 1 만 이상 50 만 이하의 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산성 함수 매체 중에 분산시켜, 평균 분자량 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염을 얻고자 한 경우, 보다 수용성이 높은, 저분자화된 히알루론산 및/또는 그 염이, 산성 함수 매체를 구성하는 물에 우선하여 용해되는 결과, 최종적으로 얻어지는 히알루론산 및/또는 그 염에 갈변이 생기거나, 부생성물 (예를 들어 단당) 의 생성량이 증가할 (예를 들어, 단당의 함유량이 3 질량％ 를 초과한다) 우려가 있다.
이에 대하여, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 있어서, 고상 분해 공정에 의해 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 어느 정도 저분자화한 후에, 액상 분해 공정에 의해 평균 분자량 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염을 얻음으로써, 갈변의 발생 및 부생성물의 발생을 억제할 수 있다.
(출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염)
출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염은, 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 출발 원료이며, 원료 히알루론산 및/또는 그 염보다 평균 분자량이 크다.
원료 히알루론산 및/또는 그 염의 평균 분자량의 3,500 이상 50 만 이하를 얻을 수 있는 점에서, 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 평균 분자량은 1 만 이상인 것이 바람직하고, 10 만 이상인 것이 보다 바람직하고, 한편, 200 만 이하인 것이 바람직하고, 100 만 이하인 것이 보다 바람직하다.
상기 고상 분해 공정에 있어서, 상기 산성 함수 매체의 질량에 대한 상기 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 질량 (산성 함수 매체의 질량 100 질량％ 로 한다) 이 3 질량％ 이상 20 질량％ 이하일 수 있고, 3 질량％ 이상인 것이 바람직하고, 한편, 15 질량％ 이하인 것이 바람직하다.
(산성 함수 매체)
본 실시 형태에 관련된 제조 방법에서는, 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 분산시키는 산성 함수 매체에 사용하는 용매로서는, 수용성 유기 용매를 들 수 있다. 수용성 유기 용매로서는, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등의 알코올계 용매 (그 중에서도, 저급 알코올), 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤계 용매, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴 등을 들 수 있고, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
(물의 비율)
산성 함수 매체 중에 있어서 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 용해를 방지하고, 수율 저하를 방지하는 점에서, 산성 함수 매체의 전체량에 대한 물의 비율은 40 용량％ 이하가 바람직하고, 30 용량％ 이하가 더욱 바람직하고, 통상적으로, 1 용량％ 이상이다.
(산성 함수 매체의 pH)
또, 고상 분해 공정에서는, 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지하고, 또한 원료 히알루론산 및/또는 그 염의 저분자화를 달성할 수 있는 점에서, 상기 산성 함수 매체의 pH 는 1 이하인 것이 바람직하고, 0 이상인 것이 보다 바람직하다.
(고상 분해 공정 이외의 제 2 저분자화 공정)
또한, 고상 분해 공정 대신에, 제 2 저분자화 공정으로서 예를 들어, 효소 분해, 열 분해, 원료 히알루론산 및/또는 그 염이 반응액에 용해된 상태에 있어서의 산 분해, 알칼리 분해, 전자선 조사에 의한 분해, 및 초음파에 의한 분해에서 선택되는 적어도 1 종의 방법에 의해 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 저분자화하여, 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있지만, 최종적으로 얻어지는 히알루론산 및/또는 그 염에 있어서의 단당, 2 당, 8 당의 비율을 컨트롤하기 쉬운 점에서, 고상 분해 공정 (즉, 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산성 함수 매체에 분산시켜, 그 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 고체 상태로 산과 반응시키는 방법) 에 의해 그 출발 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 가수 분해하는 방법이 바람직하다.
(반응 온도)
고상 분해 공정에서는, 저분자화된 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지할 수 있는 점에서, 반응액의 온도는 통상적으로 95 ℃ 이하 (바람직하게는 90 ℃ 이하) 인 것이 바람직하고, 55 ℃ 이상 (바람직하게는 60 ℃ 이상) 인 것이 보다 바람직하다.
(반응 시간)
고상 분해 공정에서는, 저분자화된 히알루론산 및/또는 그 염의 갈변을 방지할 수 있는 점에서, 반응 시간은 통상적으로 30 분 이상 10 시간 이하인 것이 바람직하고, 60 분 이상 2 시간 이하인 것이 보다 바람직하다.
＜작용 효과＞
본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 의하면, 액상 분해 공정과 음이온 교환 수지 처리 공정과 분무 건조 공정 또는 동결 건조 공정을 포함함으로써, 상기 음이온 교환 수지 처리 공정에서 얻어진 액을 사용하여 상기 분무 건조 공정 또는 동결 건조 공정을 실시할 수 있기 때문에, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 고체로서 효율적으로 얻을 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 의하면, 평균 분자량이 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염을 고농도 (예를 들어 8 질량％ 이상 35 질량％ 이하) 포함하는 액을 분무 건조 또는 동결 건조시킴으로써, 부피 밀도가 높은 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 있어서, 분무 건조 공정을 거쳐, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 또한, 부피 밀도가 높고 (0.25 g/㎤ 이상), 또한 입자경의 편차가 적은 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있는 이유로서는, 평균 분자량이 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염의 점도가 낮기 때문에, 분무 건조시킬 때의 농도를 높게 할 수 있기 때문에, 적절한 분무를 할 수 있는 것을 들 수 있다.
분무 건조에 의해 고체를 얻기 위해서는, 통상적으로, 분무 건조시킬 때에, 분무 건조의 대상이 되는 물질을 적당한 농도로 포함하고, 또한, 점도가 낮은 액을 사용하는 것이 필요하다. 분무 건조의 대상이 되는 물질의 농도가 너무 낮으면, 분무 건조의 대상이 되는 물질을 고체로서 얻는 것이 어려운 경우가 있다.
고분자의 히알루론산 및/또는 그 염 (예를 들어, 평균 분자량이 3,500 을 초과하는 것, 특히, 평균 분자량이 10 만 이상 200 만 이하인 것) 은 점도가 높기 때문에, 분무 건조를 실시하기 위해서는, 점도를 내리기 위해서 그 히알루론산 및/또는 그 염의 농도를 낮게 해야 한다. 그러나, 이와 같은 농도가 낮은 액을 사용하여 분무 건조를 실시한 경우, 히알루론산을 고체로서 회수할 수 없다는 문제가 생기는 경우가 있다.
이에 대하여, 본 발명자들은, 평균 분자량 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염에 대해, 분무 건조의 대상이 되는 액 중의 농도를 8 질량％ 이상 35 질량％ 이하로 함으로써, 분무 건조를 실시할 수 있다는 새로운 지견을 알아내어, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법을 창출했다.
즉, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 의해, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있다.
또, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법은, 이하의 특징 (1) 내지 (5) 를 갖는다.
(1) 효소를 사용한 히알루론산 및/또는 그 염의 저분자화 방법과 비교해서, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 의하면, 순도 및 백색도가 높은 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있고, 항원성을 보다 저감할 수 있고, 또한, 제조 비용을 저감할 수 있다.
(2) 에탄올의 첨가에 의한 침전에 의해 히알루론산 및/또는 그 염을 정제하는 방법과 비교해서, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 의하면, 불순물 (예를 들어 염화물 이온) 의 함유량이 적은 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있고, 또한, 히알루론산 및/또는 그 염의 수율이 우수하다.
(3) 평균 분자량이 10 만을 초과하는 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산성 또는 알칼리성의 원료 히알루론산 용액 중에 용해시킨 상태로 저분자화하여, 평균 분자량 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염을 얻는 방법과 비교해서, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 의하면, 백색도가 높고, 또한, 부생성물 (예를 들어 단당) 의 함유량이 적은 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있다.
(4) 평균 분자량이 10 만을 초과하는 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산성 함수 매체 중에 고체인 채 분산시키는 방법 (여기서, 원료 히알루론산 및/또는 그 염을 산성 함수 매체 중에 고체인 채 분산시키는 방법으로서는, 예를 들어, 상기 고상 분해 공정으로서 기재된 방법을 들 수 있다.) 에 의해, 평균 분자량 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염을 얻고자 하면, 조건에 따라서는, 생성된 저분자화물 (평균 분자량이 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염) 이, 그 산성 함수 매체를 구성하는 산성수에 용해되는 결과, 회수가 어려워지는 데다, 그 저분자화물이, 그 산성수에 포함되는 산에 의해 갈변하거나, 산에 의해 그 저분자화물이 분해되어 단당 등의 부생성물이 생기거나 하는 경우가 있다. 이에 대하여, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 의하면, 백색도가 높고, 또한, 부생성물 (예를 들어 단당) 의 함유량이 적은 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있다.
(5) 특히, 분무 건조 공정을 거쳐 얻어진 히알루론산 및/또는 그 염은, 동결 건조 공정을 거쳐 얻어진 히알루론산 및/또는 그 염 (통상적으로, 푹신푹신한 면상의 고체가 얻어진다) 과 비교해서, 입자경의 편차가 보다 적고, 또한, 미량의 불순물의 함유량이 보다 적다.
［저분자 히알루론산의 분무 건조·동결 건조］
본 발명의 일 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염의 제조 방법은, 평균 분자량이 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염을 8 질량％ 이상 35 질량％ 이하 포함하는 액을 분무 건조 또는 동결 건조시켜, 고체의 히알루론산 및/또는 그 염을 얻는 공정을 포함한다.
본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 있어서, 부피 밀도가 보다 높고, 입자경의 편차가 적은 입자가 얻어지는 점에서, 분무 건조시켜, 고체의 히알루론산 및/또는 그 염을 얻는 것이 보다 바람직하다. 이 경우, 분무 건조의 대상이 되는 히알루론산 및/또는 그 염의 평균 분자량은, 3,500 이하인 것이 바람직하고, 2,800 이하인 것이 보다 바람직하고, 한편, 1,000 이상인 것이 바람직하고, 1,200 이상인 것이 보다 바람직하다.
즉, 평균 분자량 3,500 이하의 히알루론산 및/또는 그 염은, 고분자의 히알루론산 및/또는 그 염보다 점도가 낮기 때문에, 본 실시 형태에 관련된 제조 방법에 있어서, 분무 건조의 대상이 되는 액 중의 히알루론산 및/또는 그 염의 농도를 높게 함 (8 질량％ 이상 35 질량％ 이하로 한다) 으로써, 부피 밀도가 높고, 또한, 입자경의 편차가 적은 입자상의 히알루론산 및/또는 그 염을 얻을 수 있다.
［식품］
본 발명의 일 실시 형태에 관련된 식품은, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 포함한다. 보다 구체적으로는, 본 실시 형태에 관련된 식품은, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 0.1 질량％ 이상 100 질량％ 이하 함유할 수 있다.
상기 히알루론산 및/또는 그 염을 함유하는 식품의 양태는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 주식인 미반 가공 식품, 제빵류 등, 부식인 리토르트 통조림, 냉동 식품, 반찬, 건조 식품 등, 마요네즈 등 조미료, 음료, 과자, 디저트류, 액상, 겔상 또는 소프트 캡슐상 등의 서플리먼트류 등의 일반 식품 전반 외에, 생리 기능을 표현하는 것이 허가된 특정 보건용 식품 전반을 들 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 식품의 양태는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 껌, 캔디, 젤리 캔디, 트로치형 식품, 젤리 음료, 미반 가공 식품, 제빵류, 리토르트 통조림, 냉동 식품, 반찬, 건조 식품, 마요네즈 등 조미료, 음료, 과자, 디저트류, 서플리먼트류 등의 일반 식품 전반, 생리 기능을 표현하는 것이 허가된 특정 보건용 식품 전반을 들 수 있고, 이 중, 편리성이 우수한 점에서, 서플리먼트류가 바람직하다.
또, 서플리먼트류의 형태로서는, 예를 들어, 정제상, 산제상, 세립상, 과립상, 캡슐상 (하드 캡슐, 소프트 캡슐) 등의 고형상, 액상, 현탁 액상, 젤리상, 시럽상 등의 유동상을 들 수 있다.
히알루론산 및/또는 그 염은 생체 물질이기 때문에, 다량으로 섭취해도 부작용이 없거나, 또는 극히 낮다고 생각되지만, 식품으로서 섭취하는 본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염의 양은, 하루당 1 mg 이상 1000 mg 이하, 바람직하게는 15 mg 이상 300 mg 이하를 기준으로 할 수 있다.
［화장료］
본 발명의 일 실시 형태에 관련된 화장료는, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 포함한다.
본 실시 형태에 관련된 화장료의 사용 양태는 특별히 한정되지 않지만, 생체 조직의 표면에 도포 또는 접촉하여 섭취시키는 것이 바람직하고, 특히, 얼굴, 팔, 손가락, 발, 관절 등의 피부에 도포 또는 접촉시키는 것이 바람직하다.
본 실시 형태에 관련된 화장료로서는, 예를 들어, 피부용 화장료를 들 수 있다. 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 피부용 화장료에 사용함으로써, 적당한 점도를 가지며, 또한, 보수 효과가 높기 때문에, 피부에 윤기를 부여하여, 피부의 버석거림감을 개선할 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 피부용 화장료의 양태로서는, 예를 들어, 세안료, 세정료, 화장수 (예를 들어, 미백 화장수), 크림 (예를 들어, 배니싱 크림, 콜드 크림), 유액, 미용액, 팩 (예를 들어, 젤리상 필오프 타입, 페이스트상 닦아내는 타입, 분말상 씻어내는 타입), 클렌징, 파운데이션, 립스틱, 립 크림, 립 글로스, 립 라이너, 볼연지, 셰이빙 로션, 애프터 선로션, 데오도런트 로션, 보디 로션 (핸드 케어 로션, 풋 케어 로션을 포함한다), 보디 오일, 비누, 입욕제를 들 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 화장료에는 추가로 이하의 성분이 배합되어 있어도 된다. 상기 성분으로서는, 예를 들어, 카티온화 다당류 (예를 들어, 카티온화 히알루론산, 카티온화 하이드록시에틸셀룰로오스, 카티온화 구아검, 카티온화 전분, 카티온화 로카스트빈검, 카티온화 덱스트란, 카티온화 키토산, 카티온화 봉밀 등), 아니온 계면 활성제 (예를 들어, 알킬벤젠술폰산염, 폴리옥시알킬렌알킬에테르황산에스테르염, 알킬황산에스테르염, 올레핀술폰산염, 지방산염, 디알킬술포숙신산염 등), 비이온 계면 활성제 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 유도체 등), 양이온 계면 활성제 (예를 들어, 알킬트리메틸암모늄염, 디알킬디메틸암모늄염, 알킬피리디늄염, 염화스테아릴트리메틸암모늄 등), 양쪽성 계면 활성제 (예를 들어, 알킬베타인, 알킬아미드프로필베타인, 이미다졸리늄베타인, 난황 레시틴, 대두 레시틴 등), 유분 (예를 들어, 실리콘, 실리콘 유도체, 유동 파라핀, 스쿠알란, 밀랍, 카르나바로우, 올리브유, 아보가드유, 동백유, 호호바유, 마유 등), 보습제 (예를 들어, 히알루론산나트륨, 가수 분해 히알루론산, 아세틸화히알루론산, 히알루론산디메틸실란올, 세라미드, 라우로일글루타민산디피트스테릴옥틸도데실, 피트글리코겐, 가수 분해 난각막, 트레할로스, 글리세린, 아테로콜라겐, 소르비톨, 멀티톨, 1,3-부틸렌글리콜 등), 고급 지방산 (예를 들어, 라우르산, 베헤닌산, 팔미트산, 스테아르산, 이소스테아르산, 올레산 등), 고급 알코올 (예를 들어, 세틸알코올, 스테아릴알코올, 베헤닐알코올, 이소스테아릴알코올, 바틸알코올 등), 다가 알코올 (예를 들어, 글리세린, 디글리세린, 1,3-프로판디올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜 등), 증점제 (예를 들어, 셀룰로오스에테르, 카르복시비닐폴리머, 잔탄검, 팔미트산덱스트린 등), 양쪽성 고분자 수지 화합물 (예를 들어, 베타인화 디알킬아미노알킬아크릴레이트 공중합체 등), 카티온성 고분자 수지 화합물 (예를 들어, 비닐피롤리돈/디메틸아미노에틸메타크릴레이트 공중합체 카티온화물, 폴리디메틸디알릴암모늄할라이드형 카티온성 폴리머 등), 방부제 (예를 들어, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올 등), 산화 방지제 (예를 들어, 토코페놀, BHT 등), 금속 봉쇄제 (예를 들어, 에데토산염, 에티드론산염 등), 자외선 흡수제 (예를 들어, 벤조페논 유도체, 파라아미노벤조산 유도체, 메톡시계피산 유도체 등), 자외선 반사제 (예를 들어, 산화티탄, 산화아연 등), 단백질 가수 분해물 (예를 들어, 케라틴펩티드, 콜라겐펩티드, 대두 펩티드, 소맥 펩티드, 밀크펩티드, 실크펩티드, 난백 펩티드 등), 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 글루타민산, 글리신, 알라닌, 하이드록시프롤린, 시스테인, 세린, L-테아닌 등), 천연물 엑기스 (고삼 엑기스, 카모밀 엑기스, 해초 엑기스, 유칼리 엑기스, 로열제리 엑기스, 로즈마리 엑기스, 너도밤나무 엑기스 등), 그 밖의 기능성 성분 (코엔자임 Q10, 알부틴, 폴리쿼터늄 51, 엘라스틴, 백금 나노콜로이드, 팔미트산레티놀, 판테놀, 알란토인, 디라우로일글루타민산리신나트륨, 인산아스코르빌마그네슘, L-아스코르브산2-글루코시드, 엘라그산, 코지산, 리놀산, 트라넥삼산 등), 인지질 폴리머, 향료, 색소를 들 수 있다.
［의약품］
본 발명의 일 실시 형태에 관련된 의약품은, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 포함한다. 보다 구체적으로는, 본 실시 형태에 관련된 의약품은, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염을 5 질량％ 이상 100 질량％ 이하 함유할 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 의약품은, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염 이외에, 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위에서, 그 밖의 원료를 포함할 수 있다. 그러한 원료의 예로서는 물, 부형제, 항산화제, 방부제, 습윤제, 점조제, 완충제, 흡착제, 용제, 유화제, 안정화제, 계면 활성제, 활택제, 수용성 고분자, 감미료, 교미제, 산미료, 알코올류 등을 들 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 의약품의 제형은 특별히 한정되지 않지만, 그 의약품을 경구 섭취하는 경우, 예를 들어 정제, 산제, 세립제, 과립제, 캡슐제, 환제 등의 고형 제제, 수제, 현탁제, 시럽제, 유제 등의 액제 등의 경구 투여제를 들 수 있다.
본 실시 형태에 관련된 의약품으로서 섭취하는 히알루론산 및/또는 그 염의 양은, 1 일당 10 mg 이상 1,000 mg 이하, 바람직하게는 100 mg 이상 500 mg 이하를 기준으로 할 수 있다. 투여 횟수는, 증상에 따라 1 일당 1 회 혹은 복수회를 선택할 수 있다.
또한, 본 실시 형태에 관련된 의약품에는, 필요에 따라, 증량제, 결합제, 활택제, 보존제, 산화 방지제, 향료, 감미료, 산미료, 부형제 등을 배합할 수 있다. 또, 비타민 C, 비타민 B2, 비타민 B12, 비타민 E 등의 비타민류, 핵산, 콘드로이틴황산, 콜라겐 등의 영양 성분, 철, 아연 등의 미네랄 성분 등의 각종 영양 성분을 배합할 수도 있다.
［히알루론산 및/또는 그 염의 일례］
본 발명의 일 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염은, 평균 분자량이 3,500 이하이며, 또한, 이하의 특징 (1) 내지 (13) 중 1 개 또는 그 이상 (2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개 또는 13 개) 을 갖는다.
(1) 부피 밀도가 0.25 g/㎤ 보다 크다.
(2) 순도가 90 ％ 이상이다.
(3) 색의 색상을 나타내는 b 값이 10 이하이다.
(4) 평균 입자경이 10 ㎛ 이상 35 ㎛ 이하이다.
(5) 입자경의 표준 편차가 0.1 이상 0.3 이하이다.
(6) 염소 함량이 1 질량％ 이하이다.
(7) 황 함량이 1 질량％ 이하이다.
(8) 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이다.
(9) 히알루론산 분해 효소를 함유하지 않는다.
(10) 8 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이다.
(11) 2 당, 4 당, 6 당 및 8 당의 합계가 5 질량％ 이상 80 질량％ 이하이다.
(12) 5 질량％ 수용액의 동점도가 2.0 ㎟/s 이하이다.
(13) 단당의 비율이 3 질량％ 이하이다.
본 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염에 의하면, 상기 실시 형태에 관련된 히알루론산 및/또는 그 염과 동일한 작용 효과를 갖는다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 한층 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 실시예로 한정되지 않는다.
＜실시예 1 ： 히알루론산의 조제＞
분자량 1 만의 원료 히알루론산 약 5 kg 을 에탄올 1 kg 으로 습윤시켜, 교반기 및 재킷을 장비한 50 ℓ 들이 탱크에서 2 ％ 염산 25 ℓ (pH 1.0, 25 kg) 에 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 16 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 이것을 70 ℃ 에서 5 시간 유지하여, 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 8 ℓ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 2 kg 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조정했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 12 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 분무 건조 (히터 온도 ： 180 ℃) 에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산 4.5 kg (수율 약 90 ％) 을 얻었다.
얻어진 히알루론산은, HPLC 의 측정으로부터 환산한 분자량이 2,200 이며, b 값이 2.2 이며, L 값이 95 였다. 또, 이 히알루론산의 부피 밀도, 입자경, 입도 분포, 및 염소 함량을 측정한 결과를 표 1 에 나타낸다.
또, 실시예 1 의 히알루론산, 후술하는 실시예 2 내지 8 그리고 비교예 2 내지 4, 7 및 8 의 히알루론산에 대해 HPLC 의 측정을 실시했다. 또한, HPLC 의 측정 조건은 이하와 같다. HPLC 의 측정 결과로부터, 상기 실시 형태의 난에서 설명한 방법에 따라, 실시예 1 내지 8 의 히알루론산 및 후술하는 비교예 2 내지 4, 7 및 8 의 히알루론산의 평균 분자량 및 2 당, 4 당, 6 당 및 8 당의 비율을 각각 산출했다.
(HPLC 측정 조건)
HPLC 분석 장치 ： 상품명 「얼라이언스 PDA 시스템」, 닛폰 워터즈 주식회사 제조
사용 칼럼 ： 겔 여과 칼럼 (상품명 「Diol-120」, 주식회사 와이엠시이 제조)
분석 샘플 ： 히알루론산의 0.1 ％ (w/v) 수용액
칼럼 온도 ： 40 ℃
유속 ： 1 ㎖/분
히알루론산의 0.1 ％ (w/v) 수용액의 주입량 ： 20 ㎕
이동상 ： 0.003 M 인산 버퍼 (0.15 M NaCl 함유, pH 7.0)
본 실시예에 관련된 겔 여과 칼럼을 사용한 액체 크로마토그래피에서는, 유지 시간이 느린 것일수록 저분자이다. 따라서, 히알루론산의 HPLC 의 측정 결과에서는, 유지 시간이 긴 순으로, N-아세틸글루코사민, D-글루크론산, 히알루론산 (2 당 ： 반복 구조 단위 1 개), 히알루론산 (4 당 ： 반복 구조 단위 2 개), 히알루론산 (6 당 ： 반복 구조 단위 3 개), 히알루론산 (8 당 ： 반복 구조 단위 4 개) … 의 피크를 얻을 수 있었다. 각 피크의 분자량 (예를 들어 2 당이면 분자량 400) 에 피크 면적을 곱한 값을 산출하고, 피크마다 산출한 값을 적산한다. 또한, 그것을 전체의 피크 면적으로 나눔으로써, 평균 분자량을 산출할 수 있다.
＜비교예 1 ： 히알루론산의 조제＞
건조시킨 분자량 1 만의 원료 히알루론산 약 2 kg 을 교반기 및 재킷을 장비 한 50 ℓ 들이 탱크로 2 ％ 염산 25 ℓ (pH 1.0, 25 kg) 에 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 7 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 이것을 70 ℃ 에서 5 시간 유지하여, 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물에 25 질량％ 수산화나트륨 수용액 2 kg 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제한 다음 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 18 ℓ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 4 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 분무 건조 (히터 온도 ： 180 ℃) 에 의해 건조시킨 결과, 무상(霧狀)이 되어, 히알루론산을 회수할 수 없었다.
＜비교예 2 ： 히알루론산의 조제＞
분무 건조를 실시하는 대신에 동결 건조를 실시한 것 이외는 비교예 1 과 동일하게 하여, 비교예 2 의 백색 미분말의 히알루론산 1.9 kg 을 얻었다.
＜실시예 2 ： 히알루론산의 조제＞
교반기 및 재킷을 장비한 200 ℓ 들이 탱크에, 8 ％ 염산 28 ℓ (28 kg) 와 에탄올 100 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 5 kg 을 탱크에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 1 kg 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 6 kg 에 2 ％ 염산 25 ℓ (pH 1.0, 25 kg) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 16 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하여, 70 ℃ 에서 5 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 12 ℓ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 2 kg 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 11 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 분무 건조 (히터 온도 ： 180 ℃) 에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산 4.5 kg (수율 약 90 ％) 을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
＜실시예 3 ： 히알루론산의 조제＞
실시예 2 에 있어서 주로, 사용하는 탱크의 용량, 출발 원료 히알루론산의 질량, 염산의 질량, 에탄올의 질량, 수산화나트륨의 질량을 모두 100 분의 1 로 변경하여 스케일 다운하고, 분무 건조시킬 때의 히알루론산 용액의 농도를 14 질량％ 로 한 것 이외는, 동일한 방법으로, 실시예 3 의 히알루론산을 얻었다.
보다 구체적으로는, 2 ℓ 들이 비커에, 8 ％ 염산 280 ㎖ (280 g) 와 에탄올 1 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 탕욕에서 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 50 g 을 비커에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 10 g 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 60 g 에 2 ％ 염산 150 ㎖ (pH 1.0, 150 g) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 24 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 70 ℃ 에서 5 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 120 ㎖ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 20 g 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 14 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 분무 건조 (히터 온도 ： 180 ℃) 에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산 46 g (수율 약 92 ％) 을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
＜실시예 4 ： 히알루론산의 조제＞
실시예 3 에 있어서 주로, 수지를 제거한 후에 얻어진 용액에 물을 첨가하여 히알루론산의 농도를 조정한 것 이외는, 동일한 방법으로, 실시예 4 의 히알루론산 11 질량％ 를 포함하는 용액을 얻었다. 이 용액을 동결 건조시켜, 실시예 4 의 히알루론산을 얻었다.
보다 구체적으로는, 2 ℓ 들이 비커에, 8 ％ 염산 280 ㎖ (280 g) 와 에탄올 1 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 탕욕에서 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 50 g 을 비커에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 10 g 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 60 g 에 2 ％ 염산 150 ㎖ (pH 1.0, 150 g) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 24 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 70 ℃ 에서 5 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 120 ㎖ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 20 g 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액의 일부를 1.25 배 희석한 것 (히알루론산의 농도 ： 11 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 동결 건조에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
＜비교예 3 ： 히알루론산의 조제＞
실시예 2 에 있어서 주로, 수지를 제거한 후에 얻어진 용액에 물을 첨가하여 히알루론산의 농도를 조정한 것 이외는, 동일한 방법으로, 비교예 3 의 히알루론산 약 1 질량％ (0.6 질량％) 를 포함하는 용액을 얻었다. 이 용액을 동결 건조시켜, 비교예 3 의 히알루론산을 얻었다.
보다 구체적으로는, 2 ℓ 들이 비커에, 8 ％ 염산 280 ㎖ (280 g) 와 에탄올 1 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 탕욕에서 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 50 g 을 비커에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 10 g 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 60 g 에 2 ％ 염산 150 ㎖ (pH 1.0, 150 g) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 24 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 70 ℃ 에서 5 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 120 ㎖ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 20 g 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액의 일부를 22 배 희석한 것 (히알루론산의 농도 ： 0.6 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 동결 건조에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
＜비교예 4 ： 히알루론산의 조제＞
비교예 3 에 있어서 주로, 수지를 제거한 후에 얻어진 용액에 첨가하는 물의 양을 변경한 것 외에는 비교예 3 과 동일한 방법으로, 비교예 4 의 히알루론산 6 질량％ 를 포함하는 용액을 얻었다. 이 용액을 동결 건조시켜, 비교예 4 의 히알루론산을 얻었다.
보다 구체적으로는, 2 ℓ 들이 비커에, 8 ％ 염산 280 ㎖ (280 g) 와 에탄올 1 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 탕욕에서 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 50 g 을 비커에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 10 g 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 60 g 에 2 ％ 염산 150 ㎖ (pH 1.0, 150 g) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 24 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 70 ℃ 에서 5 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 120 ㎖ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 20 g 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액의 일부를 2.5 배 희석한 것 (히알루론산의 농도 ： 6 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 동결 건조에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
＜비교예 5 ： 히알루론산의 조제＞
실시예 2 에 있어서 주로, 수지를 제거한 후에 얻어진 용액에 첨가하는 물의 양을 변경한 것 외에는 실시예 2 과 동일한 방법으로, 비교예 5 의 히알루론산 6 질량％ 를 포함하는 용액을 얻었다. 이 용액을 실시예 2 와 동일한 분무 건조시킨 결과, 무상이 되어, 히알루론산을 회수할 수 없었다.
보다 구체적으로는, 2 ℓ 들이 비커에, 8 ％ 염산 280 ㎖ (280 g) 와 에탄올 1 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 탕욕에서 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 50 g 을 비커에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 10 g 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 60 g 에 2 ％ 염산 150 ㎖ (pH 1.0, 150 g) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 24 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 70 ℃ 에서 5 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 120 ㎖ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 20 g 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액의 일부를 2.5 배 희석한 것 (히알루론산의 농도 ： 6 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 분무 건조시킨 결과, 무상이 되어, 히알루론산을 회수할 수 없었다.
＜비교예 6 ： 히알루론산의 조제＞
2 ℓ 들이 비커에, 8 ％ 염산 280 ㎖ (280 g) 와 에탄올 1 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 탕욕에서 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 50 g 을 비커에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물을 감압 건조에 의해 건조시켰다. 건조 후의 히알루론산 약 50 g 에 2 ％ 염산 150 ㎖ (pH 1.0, 150 g) 를 첨가한 결과 히알루론산이 응어리가 되어 완전하게는 용해할 수 없었지만, 그대로 원료 히알루론산을 약 25 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 70 ℃ 에서 5 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 120 ㎖ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 20 g 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 15 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 분무 건조에 의해 건조시킨 결과, 갈변한 히알루론산이 얻어지고, 얻어진 히알루론산은 b 값이 10 이상이었다. 또, 단당의 비율은 4 ％ 였다.
＜비교예 7 ： 히알루론산의 조제＞
실시예 2 에 있어서 주로, 고상 분해 공정의 가수 분해 시간을 2 시간으로 하고, 음이온 교환 수지로 처리를 하기 전에, 수산화나트륨을 첨가하여 중화한 후, 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 침전시킨 것 이외는 실시예 2 와 동일한 방법으로, 비교예 7 의 히알루론산을 얻었다.
보다 구체적으로는, 교반기 및 재킷을 장비한 500 ℓ 들이 탱크에, 8 ％ 염산 28 ℓ (28 kg) 와 에탄올 100 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 5 kg 을 탱크에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 1 kg 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 6 kg 에 2 ％ 염산 25 ℓ (pH 1.0, 25 kg) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 16 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 70 ℃ 에서 2 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 에탄올 240 ℓ 를 첨가하여 현탁 상태로 하고, 이어서 25 ％ 수산화나트륨 수용액으로 현탁액의 pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조정함으로써 히알루론산을 침전시켰다. 얻어진 침전물을 감압 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산 4.5 kg (수율 약 90 ％) 을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
비교예 7 의 히알루론산은, 음이온 교환 수지 처리 공정을 거치지 않고 얻어진 것이기 때문에, 염소 함량이 1 질량％ 를 초과하는 데다, 침전에 의해 얻어진 것이기 때문에, 입자경의 표준 편차가 0.3 을 크게 초과하여, 입자 형상이 불균일성인 것을 이해할 수 있다.
＜비교예 8 ： 히알루론산의 조제＞
교반기 및 재킷을 장비한 200 ℓ 들이 탱크에, 8 ％ 염산 28 ℓ (28 kg) 와 에탄올 100 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 5 kg 을 탱크에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 1 kg 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 6 kg 에 2 ％ 염산 25 ℓ (pH 1.0, 25 kg) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 16 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하여, 70 ℃ 에서 5 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 25 ％ 수산화나트륨 수용액 2 kg 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 15 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 분무 건조에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산 4.5 kg (수율 약 90 ％) 을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
비교예 8 의 히알루론산은, 음이온 교환 수지 처리 공정을 거치지 않고 얻어진 것이기 때문에, 염소 함량이 1 질량％ 를 초과하므로, 입자경의 표준 편차가 0.3 을 초과하여, 입자 형상이 불균일성인 것을 이해할 수 있다.
＜실시예 5 ： 히알루론산의 조제＞
교반기 및 재킷을 장비한 200 ℓ 들이 탱크에, 8 ％ 염산 14 ℓ (14 kg) 와 에탄올 53 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 5 kg 을 탱크에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 1.5 kg 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 6.5 kg 에 2 ％ 염산 25 ℓ (pH 1.0, 25 kg) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 16 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하여, 70 ℃ 에서 3 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 8 ℓ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 2 kg 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 12 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 동결 건조에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산 4.5 kg (수율 약 90 ％) 을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
＜실시예 6 ： 히알루론산의 조제＞
교반기 및 재킷을 장비한 200 ℓ 들이 탱크에, 8 ％ 염산 14 ℓ (14 kg) 와 에탄올 53 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 5 kg 을 탱크에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 1.5 kg 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 6.5 kg 에 2 ％ 염산 25 ℓ (pH 1.0, 25 kg) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 16 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하여, 70 ℃ 에서 6 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하고, 물 8 ℓ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 2 kg 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 12 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 동결 건조에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산 4.5 kg (수율 약 90 ％) 을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
＜실시예 7 ： 히알루론산의 조제＞
실시예 3 에 있어서 주로, 수지를 제거한 후에 얻어진 용액을 물 압출하여 희석하지 않고 그대로 사용한 것 이외는, 동일한 방법으로, 실시예 7 의 히알루론산 22 질량％ 를 포함하는 용액을 얻었다. 이 용액을 분무 건조시켜, 실시예 7 의 히알루론산을 얻었다.
보다 구체적으로는, 2 ℓ 들이 비커에, 8 ％ 염산 280 ㎖ (280 g) 와 에탄올 1 ℓ 를 채우고, 교반하면서 액 온도가 70 ℃ 가 되도록 탕욕에서 가열했다. 70 ℃ 에 온도 도달 후, 교반하면서, 평균 분자량 30 만의 출발 원료 히알루론산 50 g 을 비커에 투입했다. 염산 함유 함수 에탄올 (pH 0.2) 의 온도를 70 ℃ 로 유지하도록 가열을 실시하면서, 히알루론산 미분말이 분산 상태가 되도록 교반하여, 교반을 1 시간 실시했다 (고상 분해 공정). 이어서, 염산 함유 함수 에탄올을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 잔존하는 고형물 (에탄올 10 g 으로 습윤한 상태의 원료 히알루론산) 약 60 g 에 2 ％ 염산 150 ㎖ (pH 1.0, 150 g) 를 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 24 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 1.0) 을 조제하여, 70 ℃ 에서 5 시간 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 를 실시하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 20 g 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 22 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 출발 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 분무 건조에 의해 건조시켜, 백색 미분말의 히알루론산 45 g (수율 ： 90 ％) 을 얻었다. 또한, 고상 분해 공정에서 얻어진 원료 히알루론산의 평균 분자량을 별도 측정한 결과 약 1 만이었다.
＜실시예 8 ： 히알루론산의 조제＞
실시예 7 에 있어서, 고상 분해 공정에 있어서 사용한 에탄올을 메탄올로 치환한 것 이외는 동일한 방법으로, 실시예 8 의 히알루론산 22 질량％ 를 포함하는 용액을 얻었다. 이 용액을 분무 건조시켜, 실시예 8 의 히알루론산을 얻었다.
실시예 8 의 히알루론산은 분자량, 히알루론산의 순도, b 값, 부피 밀도, 입도 분포 (평균 입자경 및 입자경의 표준 편차를 포함한다), 염소 함량, 2 당의 비율, 그리고, 2 당, 4 당, 6 당, 8 당의 합계의 비율에 있어서, 실시예 7 과 동등했다.
＜비교예 9 ： 히알루론산의 조제＞
분자량 11 만의 원료 히알루론산 약 5 kg 을 에탄올 1 kg 으로 습윤시켜, 교반기 및 재킷을 장비한 50 ℓ 들이 탱크로 2 ％ 염산 25 ℓ (pH 1.0, 25 kg) 에 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 16 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고자 한 결과, 히알루론산 용액이 매우 고점도가 되어, 교반할 수 없었다.
＜비교예 10 ： 히알루론산의 조제＞
분자량 11 만의 원료 히알루론산 약 0.2 kg 을 에탄올 0.05 kg 으로 습윤시켜, 교반기 및 재킷을 장비한 50 ℓ 들이 탱크로 2 ％ 염산 25 ℓ (pH 1.0, 25 kg) 에 첨가하고, 원료 히알루론산을 약 0.8 질량％ 포함하는 산성 원료 히알루론산 수용액 (pH 약 1) 을 조제하고, 이것을 70 ℃ 에서 10 시간 유지하여, 가수 분해를 실시했다 (액상 분해 공정). 또한, 얻어진 가수 분해물을 포함하는 액을 음이온 교환 수지 처리 (상품명 ： 다이어 이온 혹은 세파비즈, 미츠비시 화학 제조) 하고, 물 8 ℓ 로 압출함과 함께 희석하여, 80 메시 필터에 의해 수지를 제거했다. 25 ％ 수산화나트륨 수용액 2 kg 첨가하여, pH 를 4.0 이상 6.5 이하로 조제했다. 얻어진 용액 (히알루론산의 농도 ： 약 0.6 질량％, 여기서, 히알루론산의 농도는, 원료 히알루론산의 첨가량을 히알루론산의 함유량으로 간주하여 산출했다.) 을 분무 건조 (히터 온도 ： 180 ℃) 에 의해 건조시킨 결과, 무상이 되어, 히알루론산을 회수할 수 없었다.
실시예 2 내지 7 그리고 비교예 2 내지 4, 7 및 8 의 히알루론산의 순도, b 값, 부피 밀도, 입도 분포 (평균 입자경 및 입자경의 표준 편차를 포함한다), 염소 함량, 2 당의 비율, 그리고, 2 당, 4 당, 6 당, 8 당의 합계의 비율을 실시예 1 의 히알루론산과 동일하게 측정했다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다. 또한, 실시예 1 내지 8 그리고 비교예 2 내지 4, 7 및 8 의 히알루론산의 염소 함량 및 황 함량을 측정한 결과, 모두 1 질량％ 이하였다.
Figure 112016068359956-pct00001
표 1 에 나타내는 바와 같이, 실시예 1 내지 7 의 히알루론산은, 부피 밀도가 0.25 g/㎤ 보다 크고, 입자경의 편차가 적고, 염소 함량 및 황 함량이 모두 1 질량％ 이하이며, 2 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이다. 또, 실시예 1 내지 7 의 히알루론산은, 8 당의 비율이 1 질량％ 이상 30 질량％ 이하이며, 또한, 2 당, 4 당, 6 당 및 8 당의 합계가 5 질량％ 이상 80 질량％ 이하인 것을 이해할 수 있다.
또, 실시예 1 내지 7, 그리고 비교예 2 내지 4, 7, 8 의 200 mg 을 각각 타정하여 정제를 제작하고, 타정 적성을 비교해 본 결과, 실시예 1 내지 7 의 히알루론산은, 비교예 2 내지 4, 7, 8 의 히알루론산에 비해, 결착력이 높고, 타정 적성이 높았다. 특히, 염소 함량이 낮은 실시예 3 내지 7 의 히알루론산을 함유하는 정제에서 타정 적성이 높았다. 또, 평균 입자경이 가장 작고, 입자경의 표준 편차가 작은 실시예 1, 3 및 7 의 히알루론산을 함유하는 정제는, 분말이 잘 흩날리지 않아 특히 취급성도 우수했다.
＜배합예 1 ： 미용액＞
본 배합예에서는, 이하에 기재하는 처방에서, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산을 배합한 미용액 (미백 보습 엣센스) 을 조제했다. 본 배합예에서 사용한, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산은 적당한 결착성을 가지며, 분말이 잘 흩날리지 않아 본 배합예에서는 제제화가 용이했다.
히알루론산 (실시예 1) 1.0 ％
가수 분해 히알루론산 0.1 ％
1,3-부틸렌글리콜 5.0 ％
글리세린 1.5 ％
POE 소르비탄모노스테아르산에스테르 1.0 ％
소르비탄모노스테아르산에스테르 0.5 ％
잔탄검 0.2 ％
알긴산나트륨 0.2 ％
카르복시비닐폴리머 0.2 ％
수산화칼륨 0.1 ％
올리브유 0.2 ％
토코페롤 0.1 ％
EDTA-2 나트륨 0.02 ％
아르기닌 0.15 ％
글리틸리틴산디칼륨 0.05 ％
알부틴 0.2 ％
팔미트산레티놀 0.2 ％
고삼 엑기스 0.2 ％
해조 엑기스 0.2 ％
트라넥삼산 0.1 ％
엘라스틴 0.1 ％
콜라겐 0.1 ％
인산아스코르브산마그네슘 0.1 ％
시트르산나트륨 1.0 ％
시트르산 0.1 ％
프로필파라벤 0.1 ％
메틸파라벤 0.15 ％
향료 적당량
정제수 잔량
＜배합예 2 ： 소프트 캡슐＞
본 배합예에서는, 이하에 기재하는 처방에서, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산을 배합한 소프트 캡슐을 조제했다. 본 배합예에서 사용한, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산은 적당한 결착성을 가지며, 캡슐에 대한 충전율이 높고, 본 배합예에서는 제제화가 용이했다.
히알루론산 (실시예 1) 20 ％
올리브유 35 ％
밀랍 5 ％
중사슬 지방산 트리글리세리드 5 ％
젤라틴 25 ％
글리세린 10 ％
＜배합예 3 ： 산제＞
본 배합예에서는, 이하에 기재하는 처방에서, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산을 배합한 산제 (과립제) 를 조제했다. 본 배합예에서 사용한, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산은 적당한 결착성을 가지며, 분말이 잘 흩날리지 않아 본 배합예에서는 제제화가 용이했다.
히알루론산 (실시예 1) 10 ％
젖당 60 ％
옥수수 전분 25 ％
히프로멜로스 5 ％
＜배합예 4 ： 정제＞
본 배합예에서는, 이하에 기재하는 처방에서, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산을 배합한 정제를 조제했다. 본 배합예에서 사용한, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산은 적당한 결착성을 가지며, 타정 적성이 우수하기 때문에, 본 배합예에서는 제제화가 용이했다.
히알루론산 (실시예 1) 25 ％
젖당 24 ％
결정 셀룰로오스 20 ％
옥수수 전분 15 ％
덱스트린 15 ％
이산화규소 1 ％
＜배합예 5 ： 젤리 음료＞
본 배합예에서는, 이하에 기재하는 처방에서, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산을 배합한 스파우트 파우치에 넣은 백도 젤리 음료를 조제했다. 본 배합예에서 사용한, 실시예 1 에서 얻어진 히알루론산은 적당한 결착성을 가지며, 분말이 잘 흩날리지 않아 본 배합예에서는 조제가 용이했다.
히알루론산 (실시예 1) 0.20 ％
잔탄검 1.00 ％
카라기난 0.5 ％
덱스트린알코올 3.0 ％
수크랄로스 1 ％
4 배 농축 백도 과즙 5.00 ％
시트르산 0.60 ％
시트르산나트륨 0.20 ％
L-아스코르브산 0.10 ％
피치 향료 0.20 ％
정제수 잔량

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  1. 삭제
  2. 삭제
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  4. 저급 알코올과, 평균 분자량이 3,500 이상 10 만 이하의 원료 히알루론산, 그 염, 또는 원료 히알루론산 및 그 염과, 산을 포함하는 산성 원료 히알루론산 용액을 조제하는 공정과,
    상기 조제하는 공정에서 얻어진 상기 산성 원료 히알루론산 용액 중에서 상기 원료 히알루론산, 그 염, 또는 원료 히알루론산 및 그 염을 산 가수 분해하는 공정과,
    상기 산 가수 분해에 의해 얻어진 가수 분해물을 포함하는 산성 용액을 음이온 교환 수지로 처리하는 공정과,
    상기 수지 처리된 상기 가수 분해물을 분무 건조 또는 동결 건조시키는 공정을 포함하고,
    상기 산성 원료 히알루론산 용액은, 15 질량％ 이상 35 질량％ 이하의 상기 원료 히알루론산, 그 염, 또는 원료 히알루론산 및 그 염을 포함하고, 또한,
    상기 산성 원료 히알루론산 용액은, 상기 원료 히알루론산, 그 염, 또는 원료 히알루론산 및 그 염 100 질량부에 대해, 5 질량부 이상 60 질량부 이하의 상기 저급 알코올을 포함하는, 히알루론산, 그 염, 또는 히알루론산 및 그 염의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 분무 건조시키는 공정은, 상기 가수 분해물을 포함하는 액을 분무 건조시키는 공정을 포함하고,
    상기 가수 분해물을 포함하는 액의 질량에 대한 상기 가수 분해물의 질량이 8 질량％ 이상 35 질량％ 이하인, 히알루론산, 그 염, 또는 히알루론산 및 그 염의 제조 방법.
  6. 삭제
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  8. 삭제
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