JPH02142801A - 粉末状のヒアルロン酸ナトリウムの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、＄５）来状ヒアルロン酸ナトリウムの製造法
に関するものである。

ヒアルロン酸は、関節、硝子体、調帯、軟骨、皮膚、鳥
類のとさか等の結合ＡＭ　織中にその構成成分として存
在し、組織の柔軟性、構造維持、細胞の代謝調節等に重
要な機能を果たしている。またヒアルロン酸す１リパノ
１、は、高分子−物質であり、その溶液は強い粘弾性を
持ち、保水作用を有するとごろから、化粧品原料として
広く使用されるほか、眼科治療薬、目薬、関節症治療薬
としての用途がある。

（従来の技術） 従来、ヒアルロン酸ナトリウムは工業的には鶏のトサカ
、牛の眼の硝子体又は腕帯等からの抽出法か、或いはヒ
アルロン酸を生産する能力を持つ微生物を培地に培養し
て製造する方法（醗酵法）が行われている。

抽出法か或いは醗酵法で得られたヒアルロン酸ナトリウ
ムは、溶剤沈澱、イオン交換樹脂処理、分別沈澱、活性
炭処理等を行って精製した後、ヒアルロン酸ナトリウム
の水溶液を高速で覗拌しつつ、水に溶解し且つヒアルロ
ン酸ナトリウムを溶解しない有機溶剤を徐々に滴下して
、ヒアルロン酸ナトリウムを析出せしめる方法が行われ
ていた。

（発明が解決しようとする課題） 現在、ヒアルロン酸ナトリウムは主として乾燥した粉末
状のヒアルロン酸ナトリウｌいとして販売されている。

かかる粉末状のヒアルロン酸ナトリウムは先にも述べた
ように、精製したヒアルロン酸ナトリウムの水溶液を高
速で攪拌しつつ、水溶性で月つヒアルロン酸ナトリウム
を溶解しない有機溶剤を徐々に滴下して、ヒアルロン酸
す１−リウムを析出せしめる方法で製造されている。

他方、ヒアルロン酸ナトリウムは化粧品或いは医薬品（
眼科治療薬、関節症治療薬）としての用途がある。化粧
品原料として用いる場合、ヒアルロン酸ナトリウムの分
子量が大きいほど粘度が高く保湿性も良いので、この場
合は分子量の大きい方が商品価値が高い。医薬品（眼科
治療薬、関節症治療薬）として用いる場合も、ヒアルロ
ン酸す１ヘリウムの粘度が高いという性質を利用するた
め、分子量の高いものが用いられている。

しかしながら、ヒアルロン酸ナトリウムの分子量が高く
なるに従ってその水溶液の粘度は幾何級数的に増大し、
均一に攪拌することが非常に困難となる。殊に、装置が
人きくなると均一に撹拌することの困難さは非常に人き
（なる。粒度の揃った粉末状のヒアルロン酸すトリウ１
、を製造するには、ヒアルロン酸ナトリウムの水溶液を
攪拌して常に均一な状態を保ちつつ有機溶剤を徐々に滴
下して、ヒアルロン酸ナトリウムを析出せしめることが
必須である。かかる理由のため、ヒアルロン酸ナトリウ
ムの分子量が高くなるに従って、攪拌方式で粒度の揃っ
た粉末状ヒアルロン酸ナトリウムを製造することが困難
となっていた。

（課題を解決するだめの手段） 本発明者等は、操作が簡単で、コストが安く、粒度の揃
った粉末状のヒアルロン酸ナトリウムを製造する方法に
ついて鋭意研究を重ねた結果、本発明法を見出した。即
ち、本発明はヒアルロン酸ナトリウムの水溶液をポンプ
で循環している系に、水溶性で且つヒアルロン酸ナトリ
ウムを溶解しない有機溶剤を注入してヒアルロン酸ナト
リウムの沈澱を析出せしめ、しかる後、有機溶剤を除去
乾燥することを特徴とする。

本発明に用いるヒアルロン酸す１−リウムは、ヒアルロ
ン酸産生能を有する微生物を栄養培地に培養した培養液
より得ることができるが、生体より抽出したヒアルロン
酸ナトリウムも用いることができる。ヒアルロン酸を得
る為に使用できる微生物は、ヒアルロン酸を菌体外に分
泌する菌株であればいずれも使用可能であるが、ストレ
プトコ・ノカス属の菌種が好ましい。例えばストレプト
コ・ノカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・エクイ
、ストレプトコッカス・エクイシミリス、ストレプトコ
ッカス・ディスガラクチイエ、ストレプト二１ソカス・
ズーエピデミクス等が挙げられる。

これらの微生物を培養するための培地としては、ヒアル
ロン酸生産菌を培養するのに通常用いられる培地を用い
れば良く、例えばブドウ糖２．０〜３．０％、酵母エキ
ス０．５％、リン酸−・カリウム０．３％、リン酸二カ
リウＪ、０．２％、チオ硫酸すｉ・リウム０．０１％、
硫酸マグネシラ１．７水塩０．０１％、亜硫酸す１−リ
ウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マ
ンガン０．００１％、消泡剤０．５％を含む成分でｐＨ
６，０〜８．５の培養液を用いる事ができる。

（ただし％はいずれも、重量をｇ、容量をｌとした重量
／容量％を表す。） 培養は振の培養、通気培養等の好気的条件下で行う。培
養温度は２５°Ｃ〜４０’Ｃ１好ましくは３０℃〜３５
°Ｃの温度で、ｐＨは６．５〜８．０、好ましくは７．
０に制御して行う。培養は通常１〜３日間行い、ヒアル
ロン酸を培地に生成蓄積させる。

培養終了後、該培養液を遠心分離もしくは濾過によって
菌体を除去した後、該濾液を限外濾過もしくは透析する
ことによっ”Ｃ低分子量物質を除去する。低分子量物質
を除去した濾液は、水溶性有機溶剤による沈澱、臭化セ
チルトリメチルアンモニウム等による分画沈澱、イオン
交換クロマトグラフィー処理、活性炭脱色、ン農縮等の
公知の精製を行う。−ト記精製液について、本発明の次
の沈澱操作を行う。

ポンプ沈澱操作を行う装置は第１図の如く紺め立てる。

ヒアルロン酸ナトリウｌ、精製液を水で稀釈し、この水
溶液と有機溶剤を循環ポンプ１を用いて撹拌機２を備え
た沈澱槽３に循環させる。攪拌機２で攪拌しながら、有
機溶剤を有機溶剤２４人ポンプ４を介して有機溶剤タン
ク５から注入し、ヒアルロン酸ナトリウムを沈澱析出さ
ゼる。次いで、有機溶剤を除去し乾燥させてヒアルｌ」
ン酸す１〜リウムの粉末を得る。

本発明に用いるポンプは、ポンプに十分な流量があれば
基本的にはどのようなタイプのポンプでも良いが、好ま
しくは渦巻きポンプ、ギヤポンプが良い結果をもたらす
。

本発明に用いる有機溶剤は水に溶解し且つヒアルロン酸
ナトリウムを溶解しない、例えばエチルアルコ１−ル、
メチルアルコール、アセトン、ｎプロパツール、イソプ
ロパノール、アセ１〜ニトリル等を用いることができる
。

さらに、この装置を用いた具体例を説明する。

先ず、精製液中のヒアルし１ン酸ナトリウムの分子量が
１５０万程度の場合、水で稀釈して精製液中のヒアルロ
ン酸ナトリウム濃度を０．２％になるように調整する。

これに食塩を溶解して食塩の濃度が０．２Ｍになるよう
にする。この稀釈操作は沈澱槽で攪拌機で攪拌しつつ行
うことができる。均一に稀釈されたところで、攪拌機で
撹拌しつつエタノール’ｃ　０　、２％ヒアルロン酸す
１−リウム水溶液量の１．５倍Ｌｔ徐々に滴下する。こ
の間、ピアルＩ’ｌｌン酸ナトリウム水溶液の粘度低下
は認られるが、沈澱・白濁は認られない。次いでヒアル
ロン酸ナトリウム溶液のエタノール希釈液を攪拌機で攪
拌しつつ、渦巻きポンプを始動してエタノール稀釈液を
循環せしめる。循環速度（ポンプ流量）は配管内を流れ
るヒアルロン酸ナトリウム溶液のエタノル稀釈液が完全
な乱流状態で流れる速度が必要である。液の循環が安定
したところでエタノール注入ポンプを始動してエタノー
ルの注入を行う。

エタノールの注入位置は渦巻きポンプのザクンヨン側で
ポンプになるべく近い位置が良い。エタノールの１分間
当りの注入速度は、当初の０．２％ヒアルロン酸ナトリ
ウム水溶液量の１７３５〜ｌ／２５で行う。エタノール
の注入が進むにつれて、ヒアルロン酸ナトリウム溶液の
エタノール希釈液は白濁を生じ、やがてヒアルロン酸ナ
トリウムの微細沈澱物の生成が認られるようになる。エ
タノールの注入量が当初の０．２％ヒアルロン酸ナトリ
ウム水溶液量と同量から２倍量になった時点でエタノー
ルの注入を停止する。ポンプ循環及び液の攪拌を停止す
る。

上記白濁液を、約３０分間静置するとヒアルロン酸ナト
リウム微細沈澱物は下に沈降する。沈降したところで上
澄液を静かに抜き出す。抜き出し量は注入したエタノー
ル量の１〜２倍量とする。なるべく多くの上澄液を抜き
出した方がその後の操作を進める上で好ましい結果をも
たらす。

上澄液の抜き出しが終ね、ったところで、再び、液（ス
ラリー）のポンプ循環と攪拌を開始する。

液（スラリー）の循環が安定したところで、エタノール
注入ポンプを始動してエタノールの注入を再開する。エ
タノールの１分間当りの注入速度をやや速めて、当初の
０．２％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液量のｌ／１５〜
ｌ／１０で行う。エタノールの注入量が当初の０．２％
ヒアルロン酸ナトリウム水溶液量と同量になった時点で
エタノールの注入を停止する。ポンプ循環および液の撹
拌を停止する。

この白濁液を、約３０分間静置するとヒアルロン酸ナト
リウムの微細沈澱物は下に沈降する。沈降したところで
上澄液を静かに抜き出す。抜き出し量は注入したエタノ
ール量の１〜２倍量とする。

なるべく多（の上澄液を抜き出した方がその後の操作を
進める上で好ましい結果をもたらす。

上澄液の抜き出しが終わったところで、再び、液（スラ
リー）のポンプ循環と攪拌を開始する。

液（スラリー）の循環が安定したところで注入ポンプを
始動してアセトンの注入を再開する。アセトンの１分間
当りの注入速度をやや速めて、当初の０．２％ヒアルロ
ン酸ナトリウム水溶液量の約１７５で行う。アセトンの
注入量が当初の０．２％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液
量と同量になった時点でアセトンの注入を停止する。ポ
ンプ循環および液の攪拌を停止する。この状態で約１時
間静置する。

静置終了後、フィルタープレス或いは遠心分離機を用い
てヒアルロン酸ナトリウムの微細沈澱物を母液から分離
する。必要であれば分離したケキ状のヒアルロン酸ナト
リウムの微細沈澱物を再度アセトンで洗浄し濾別する。

これを減圧乾燥機で乾燥するとヒアルロン酸ナトリウム
の微細粉末が得られる。

精製液中のヒアルロン酸ナトリウムの分子量が１５０万
程度の場合は、水で希釈して精製液中のヒアルロン酸ナ
トリウム濃度を０．２％になるように調整するが、ヒア
ルロン酸ナトリウムの分子量が５０万程度と低い場合は
、希釈の比率を小さくしヒアルロン酸ナトリウム濃度を
０．４〜０．５％にしてポンプ沈澱を行うことが出来る
。逆にヒアルロン酸ナトリウムの分子量が２００万程度
と高い場合は、希釈の比率を大きくしヒアルロン酸ナト
リウム濃度を０．１　％程度にしてポンプ沈澱を行うこ
とが出来る。この場合、食塩をン容解した方が沈澱操作
はうまくいく。

均一に希釈したところで、攪拌機で攪拌しつつ、０．２
％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液量の１．５倍量のエタ
ノールを徐々に滴下するが、沈澱が析出しなければ１．
５倍以上のエタノールを滴下しても良い。またエタノー
ルの滴下は、希釈液を循環しつつエタノール注入ポンプ
を用いておこなっても良い。

エタノールの１分間当たりの注入速度は当初の０．２％
ヒアルロン酸ナトリウム水溶液量の１７３５〜１／１０
で行うが、エタノール希釈液の循環速度（ポンプ流量）
が大きければ、エタノールの１分間当たりの注入速度も
大きくすることが出来る。しかし、−ｉ的に言ってエタ
ノールの１分間当たりの注入速度が小さい方がポンプ沈
澱操作はうまくいく エタノールの注入を停止し、ポンプ循環及び液の攪拌を
停止した後、この白濁液を約３０分間静置すると、ヒア
ルロン酸ナトリウムの微細沈澱物は下に沈降する。沈降
したところで上澄液を静かに抜き出すが、抜き出し量は
なるべく多い方が次の段階のエタノール添加量を少なく
することが出来て経済的である。

アセトン洗浄は、必ずしも必要な操作ではないが、これ
を行うと水に対して溶解性の良いヒアルロン酸ナトリウ
ムが得られる。また、本発明の操作は低温度で行った方
が粒子形状の良いヒアルロン酸ナトリウムの微粉末が得
られる。

（発明の効果） 本発明によれば、水に溶解し且つヒアルロン酸ナトリウ
ムを溶解しない有機溶媒を用いてポンプを使って沈澱操
作を行うため、高分子量の粉末状ヒアルロン酸ナトリウ
ムを効率良く容易に製造し得る。しかもヒアルロン酸ナ
トリウムの分子量が大きく、水溶液の粘度が高い場合で
も、ポンプを使うので均一に撹拌することができ、粒度
の揃った粉末が得られる。

（実施例） 以下、実施例および比較例Ｇこ基づき本発明を具体的に
説明する。

実施例１ ０．２Ｍの食塩水５００　ｍｌにヒアルロン酸ナトリウ
ム（分子量−１２０万）１０００■を熔解する。この溶
液を沈澱槽に入れる。次いで、攪拌機で約１１００ｒｐ
の速度で撹拌しつつ、エタノール７５０ｍ１を徐々に滴
下する。エタノール滴下につれて粘度低下は認められる
が沈澱・白濁は認められない。

エタノール希釈液を攪拌機で攪拌しつつ、ギヤポンプを
始動してエタノール希釈液を循環せしめる。循環速度（
ポンプ流量）は約３．５Ｉｌ／分で行う。液の循環が安
定したところで、ペリスタ−ポンプ（エタノール注入ポ
ンプ）を始動し、エタノールの注入を行う。エタノール
の注入は約２０−７分の速度で行う。液は白濁を生じ、
やがて微細沈澱物の生成が認められるようになる。エタ
ノールの注入量が７５０−になった時点でエタノールの
注入を停止する。ポンプ循環及び液の攪拌を停止する。

約３０分間放置すると、ヒアルロン酸すトリウ１、の微
細沈澱物は下に沈降する。沈降したところで、上澄液を
１０１００Ｏ！抜き出す。

再び液のポンプ循環及び攪拌を開始する。液の循環が安
定したところで、ペリスタ−ポンプを始動し、エタノー
ルの注入を開始する。エタノールの注入は約４０−７分
で行う。エタノール注入量が５００　＋＋＋ｆになった
時点でエタノールの注入を停止する。ポンプ循環及び液
の攪拌を停止する。

約３０分間放置すると、ヒアルロン酸ナトリウムの微細
沈澱物は下に沈降する。沈降したところで、上澄液を５
００−抜き出す。

再び液のポンプ循環及び攪拌を開始する。液の循環が安
定したところで、ペリスタ−ポンプを始動し、アセトン
の注入を開始する。アセトンの注入は約８０−７分で行
う。アセトンの注入量が５００ｍ１になった時点でアセ
トンの注入を停止する。ポンプ循環及び液の攪拌を停止
し、約３０分間放置する。

上澄液を抜き出した後、ガラスフィルターを用いてヒア
ルロン酸す１−リウムの微細沈澱物を濾過する。アセト
ンで洗浄した後、再度、ガラスフィルターを用いてヒア
ルロン酸ナトリウムの微細沈澱物を濾過する。濾過後、
減圧乾燥機中で乾燥する。

ヒアルロン酸ナトリウムの微細粉末０．８４　ｇが得ら
れた。この微細粉末は、全て１００メツシユをパスする
ものであった。

実施例２ 醗酵法で得られたヒアルロン酸ナトリウム培養液を、通
常の方法で精製した後、ヒアルロン酸ナトリウム濃度を
０．２％（呵／νＯ１％）になるように調整する。この
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量−１５０万）精製水溶
液１０００βを沈澱槽に入れ、食塩１１　、７　ｋｇを
添加して溶解せしめる。次いで、攪拌機で約１１００ｒ
ｐの速度で水溶液を撹拌しつつ、エタノール１５００　
Ｎを徐々に滴下する。エタノール滴下につれて粘度低下
は認められるが沈澱・白濁は認められない。

エタノール希釈液を攪拌機で攪拌しつつ、渦巻きポンプ
を始動してエタノール希釈液を循環−〇しめる。循環速
度（ポンプ流量）は約８．０ｍ３／分で行う。液の循環
が安定したところで、エタノール注入ポンプを始動し、
エタノールの注入を行う。

エタノールの注入は約４０１／分の速度で行う。液は白
濁を生じ、やがて微細沈澱物の生成が認められるように
なる。エタノールの注入量が１５００　＋２になった時
点でエタノールの注入を停止する。ポンプ循環及び液の
攪拌を停止する。

約４０分間放置すると、ヒアルロン酸ナトリウムの微細
沈澱物は下に沈降する。沈降したところで、上澄液２０
００１１をポンプを用いて抜き出す。

再び、液のポンプ循環及び攪拌を開始する。液の循環が
安定したところで、エタノール注入ポンプを始動し、エ
タノールの注入を開始する。エタノールの注入は約８０
１／分で行う。エタノール注入量が１０００　Ｎになっ
た時点でエタノールの注入を停止する。ポンプ循環及び
液の攪拌を停止する。

約４０分間放置すると、ヒアルロン酸ナトリウムの微細
沈澱物は下に沈降する。沈降したところで、上澄液１０
００　ｐをポンプを用いて抜き出す。

再び液のポンプ循環及び撹拌を開始する。液の循環が安
定したところで、エタノール注入ポンプを始動し、アセ
トンの注入を開始する。アセトンの注入は約１５０７！
／分で行う。アセトンの注入量が１０００ｆｆになった
時点でアセトンの注入を停止する。ポンプ循環及び液の
攪拌を停止し、約３０分間放置する。

上澄液を抜き出した後、遠心分離機を用いてヒアルロン
酸ナトリウムの微細沈澱物を濾過する。

アセトンで洗浄した後、再度、遠心分離機を用いてヒア
ルロン酸ナトリウムの微細沈澱物を濾過する。濾過後、
減圧乾燥機中で乾燥する。

ヒアルロン酸ナトリウムの微細粉末１．５６ｋｇが得ら
れた。この微細粉末は、全゛ζ１００メソシュをパスす
るものであった。

比較例１ 実施例２で用いたヒアルロン酸ナトリウム（分子量−１
５０万）の精製水溶液（ヒアルロン酸ナトリウム濃度−
０，２％）１００ｏ７！を沈澱槽に入れ、食塩１１　、
７　ｋｇを添加して溶解せしめる。

ヒアルロン酸ナトリウム水溶液を冷却する。次いで、攪
拌機でヒアルロン酸すｌ−リウム水溶液を約１１００ｒ
ｐの速度で攪拌しつつ、エタノール１５００７！を３０
分かけて、徐々に滴下する。エタノール滴下につれて粘
度低下は認められるが、沈澱・白濁は認められない。

次いで、攪拌機の回転速度を２０Ｏｒｐｍに上げて撹拌
しつつ、エタノールを２Ｏｆ　／分の速度で徐々に滴下
する。液は白濁を生じ、やがて繊維状の沈澱物の生成が
認められるようになる。エタノールの注入量が１５００
　Ｎになった時点でエタノールの注入を停止する。攪拌
機の回転を停止する。

約４０分間放置すると、繊維状のヒアルロン酸ナトリウ
ムの沈澱物は下に沈降する。沈降したところで上澄液２
０００　＃を抜き出す。

再び、攪拌機で上記繊維状のヒアルロン酸ナトリウムス
ラリーを回転速度２００ｒｐｍで攪拌しつつ、エタノー
ルを４０１／分の速度で徐々に滴下する。

エタノールの滴下量が１０００１になった時点でエタノ
ールの滴下を停止する。攪拌機の回転を停止する。

約３０分間放置すると、繊維状のヒアルロン酸ナトリウ
ムの沈澱物は下に沈降する。沈降したところで上澄液１
０００βを抜き出す。

攪拌機で上記スラリーを回転速度１１００ｒｐで攪拌し
つつ、アセトンを１５０７！／分の速度で徐々に滴下す
る。アセトンの滴下量が１０００　ｐになった時点でア
セトンの滴下を停止する。攪拌機の回転を停止する。

遠心分離機を用いてヒアルロン酸ナトリウムの繊維状の
沈澱物を濾過する。アセトンで洗浄した後、再度、遠心
分離機を用いてヒアルロン酸ナトリウムの繊維状の沈澱
物を濾過する。濾過後、減圧乾燥機中で乾燥する。

ヒアルロン酸ナトリウムの繊維状の沈澱物１．６０ｋｇ
が得られた。しかし、このヒアルロン酸ナトリラムの繊
維状の沈澱物は大きさが不揃いで、しかも互いに付着し
た部分もあり１００メツシユをパスするものは０．０９
ｇシかなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例によるポンプ沈澱操作を行う
装置を示す概略線図である。 １・・・ヒアルロン−酸ナトリウム水溶液循環ポンプ２
・・・攪拌機 ３・・・沈澱槽 ４・・・有機溶剤注入ポンプ ５・・・有機溶剤タンク

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒアルロン酸ナトリウムの水溶液をポンプで循環
   している系に、水に溶解し且つヒアルロン酸ナトリウム
   を溶解しない有機溶剤を注入してヒアルロン酸ナトリウ
   ムの沈澱を析出せしめ、しかる後、有機溶剤を除去乾燥
   することを特徴とする、粉末状のヒアルロン酸ナトリウ
   ムの製造方法。
2. （２）有機溶剤がエチルアルコール、メチルアルコール
   、アセトン、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、又
   はアセトニトリルである請求項１記載の方法。
3. （３）ポンプが、渦巻きポンプ又はギヤポンプである請
   求項１記載の方法。
4. （４）有機溶剤の注入をポンプのサクション側の直前に
   行う請求項１記載の方法。