TWI653987B - Hyaluronic acid and/or a salt thereof, a method for producing the same, and a food, a cosmetic, and a pharmaceutical containing the hyaluronic acid and/or a salt thereof - Google Patents

Hyaluronic acid and/or a salt thereof, a method for producing the same, and a food, a cosmetic, and a pharmaceutical containing the hyaluronic acid and/or a salt thereof

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Abstract

本發明之玻尿酸及/或其鹽，其係平均分子量為3,500以下，二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下，氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，且容積密度較0.25g/cm3大。

Description

玻尿酸及/或其鹽以及其製造方法、以及包含該玻尿酸及/或其鹽之食品、化妝料以及醫藥品
本發明為關於一種玻尿酸及/或其鹽以及其製造方法、以及包含該玻尿酸及/或其鹽之食品、化妝料、以及醫藥品。
玻尿酸廣泛地分布在雞冠、臍帶、皮膚、軟骨、玻璃體、關節液等生物組織中，並且廣泛地被利用於作為例如化妝料、醫藥品、食品之成分。使用玻尿酸作為化妝品或醫藥品、食品之成分時，製劑化時的打錠適性等之操作性即為所求。
另外，玻尿酸的純化通常是以添加乙醇所造成的沉澱或凍結乾燥來進行(專利文獻1以及2)。
然而，以凍結乾燥來純化玻尿酸時，通常會得到密度較低的固體狀(例如綿狀)玻尿酸。如此之密度較低的玻尿酸，有時在製劑化時的打錠適性會較差。
且，以添加乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇、已烷等之有機溶劑所造成的沉澱來純化玻尿酸時，若玻尿酸 的分子量變小，則會有對於此等有機溶劑較難產生沉澱形成的傾向，故經純化的玻尿酸量會有較少的情況。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本特開2006-265287號公報
專利文獻2：日本特開2009-155486號公報
本發明為提供一種打錠適性等之操作性優異之玻尿酸及/或其鹽以及其製造方法、以及包含該玻尿酸及/或其鹽之食品、化妝料、以及醫藥品。
本案發明者發現具有特定分子量以及容積密度的玻尿酸及/或其鹽會具有優異的特性(例如操作性)。
1.本發明之一形態相關之玻尿酸及/或其鹽，其係平均分子量為3,500以下，二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下，氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，且容積密度較0.25g/cm3大。
2.上述1所記載之玻尿酸及/或其鹽中，平均粒子徑能夠為10μm以上且35μm以下。
3.上述1或2所記載之玻尿酸及/或其鹽中，粒子徑的標準偏差能夠為0.1以上且0.3以下。
4.本發明之一形態相關之玻尿酸及/或其鹽之製造方法包含下述步驟：調製包含低級醇、與平均分子量為3,500以上且10萬以下的原料玻尿酸及/或其鹽、與酸之酸性原料玻尿酸溶液之步驟、與在前述調製的步驟所得之前述酸性原料玻尿酸溶液中，將前述原料玻尿酸及/或其鹽酸水解之步驟、與將包含由前述酸水解所得的水解物之酸性溶液以陰離子交換樹脂處理之步驟、與使經前述樹脂處理的前述水解物噴霧乾燥或凍結乾燥之步驟，前述酸性原料玻尿酸溶液包含15質量%以上且35質量%以下之前述原料玻尿酸及/或其鹽，且前述酸性原料玻尿酸溶液中包含相對於前述原料玻尿酸及/或其鹽100質量份為5質量份以上且60質量份以下之前述低級醇。
5.上述4所劑記載玻尿酸及/或其鹽之製造方法中，前述使其噴霧乾燥之步驟中包含：將包含前述水解物之液體噴霧乾燥之步驟、相對於包含前述水解物之液體的質量，前述水解物的質量能夠為8質量%以上且35質量%以下。
6.本發明之一形態相關之食品包含上述1至3中任1項記載之玻尿酸及/或其鹽。
7.本發明之一形態相關之化妝料包含上述1至3中任1項記載之玻尿酸及/或其鹽。
8.本發明之一形態相關之醫藥品包含上述1至3中任1項記載之玻尿酸及/或其鹽。
上述1至3中任1項記載之玻尿酸及/或其鹽，其平均分子量為3,500以下，二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下，氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，且容積密度較0.25g/cm3大，藉此打錠適性等之操作性較優異。上述玻尿酸及/或其鹽能夠作為例如食品、化妝料以及醫藥品之成分來使用。
且，上述4或5記載之玻尿酸及/或其鹽之製造方法具有下述步驟：調製包含低級醇、與平均分子量為3,500以上且10萬以下的原料玻尿酸及/或其鹽、與酸之酸性原料玻尿酸溶液之步驟、與在前述調製的步驟所得之前述酸性原料玻尿酸溶液中，將前述原料玻尿酸及/或其鹽酸水解之步驟、與將包含由前述酸水解所得的水解物之酸性溶液以陰離子交換樹脂處理之步驟、與使經前述樹脂處理的前述水解物噴霧乾燥或凍結乾燥之步驟，前述酸性原料玻尿酸溶液包含15質量%以上且35質 量%以下之前述原料玻尿酸及/或其鹽，且前述酸性原料玻尿酸溶液中包含相對於前述原料玻尿酸及/或其鹽100質量份為5質量份以上且60質量份以下之前述低級醇，藉此能夠有效率地來製造平均分子量為3,500以下，二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下，氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，且容積密度較0.25g/cm3大之玻尿酸及/或其鹽。
實施發明之形態
以下一邊參照圖示，一邊詳細說明本發明。且，在本發明中，在沒有特別的阻礙之下，「份」意指「質量份」，「%」意指「質量%」。
[玻尿酸及/或其鹽]
本發明之一實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，其平均分子量為3,500以下，二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下，氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，且容積密度(bulk density)較0.25g/cm3大。
(玻尿酸之定義)
本發明中，「玻尿酸」意指具有1個以上葡萄醣醛酸與N-乙醯葡萄胺糖之二糖所構成之重複構成單位的多糖類。且，作為「玻尿酸之鹽」，雖無特別限定，但以在食品或藥學上可容許之鹽較佳，並有舉例如，鈉鹽、鉀鹽、 鈣鹽、鋅鹽、鎂鹽、銨鹽等。
玻尿酸基本上為包含至少1個β-D-葡萄糖醛酸的1位與β-D-N-乙醯-葡萄糖胺的3位有鍵結之二糖單位之二糖以上者，且基本上由β-D-葡萄糖醛酸與β-D-N-乙醯-葡萄糖胺所構成，並鍵結1個或複數個二糖單位者。本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽實質上能夠不包含非還原末端糖(例如葡萄醣醛酸的4、5位碳間為不飽和者)(亦即，非還原末端糖之含量為1質量%以下)。
本發明中，「二糖(disaccharide)」意指1個β-D-葡萄醣醛酸的1位與β-D-N-乙醯-葡萄糖胺的3位有鍵結的二糖單位(由2個糖所構成)，「四糖(tetrasaccharide)」意指2個該二糖單位(由4個糖所構成)，「六糖(hexasaccharide)」意指3個該二糖單位(由6個糖所構成)，「八糖(octasaccharide))」意指4個該二糖單位(由8個糖所構成)。且，本發明中，二糖、四糖、六糖以及八糖皆意指不包含非還原末端糖者(飽和糖)。
(容積密度)
本發明中，「容積密度」是根據「第十六改正日本藥局方、3.粉體物性測定法、3.01容積密度以及敲緊密度測定法」所記載之方法所測定出的值。本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，其平均分子量為3,500以下，且容積密度較0.25g/cm3大，藉此在低分子的同時，打錠適性 (tableting adequacy)等之操作性(handling ability)也較優異。
(平均分子量)
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，以能夠更提高純度之觀點來看，平均分子量為3,500以下，為2,500以下較佳，另一方面，通常為800以上，為1,000以上較佳。且，本發明中，玻尿酸及/或其鹽之平均分子量能夠以後述之使用HPLC之方法來測定。
更具體來說，算出各個HPLC測定所得之玻尿酸及/或其鹽的各個波峰之分子量(例如若為二糖則分子量為400)乘以波峰面積之值，積算每個波峰所算出之值。進而，藉由將此積算之值除以全體的波峰面積，能夠算出平均分子量。
(純度)
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，其純度能夠為90%以上，為95%以上較佳，為98%以上更佳。
本發明中，「純度」意指本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽中除去玻尿酸及/或其鹽以外之成分的比例。作為玻尿酸及/或其鹽以外之成分，能夠舉例如單糖(例如葡萄醣醛酸、N-乙醯葡萄糖胺、以及來自此等之單糖)、非還原末端糖。
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽的純度 能夠藉由例如自玻尿酸及/或其鹽之HPLC的光譜數據除去相當於單糖之波峰所算出。在本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽中，單糖的比例通常為3質量%以下，且為2質量%以下較佳。
(白色度)
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，其表示顏色的色相之b值(以下單純稱作「b值」)能夠為10以下，為8以下較佳，為5以下更佳，通常為0以上。
b值為規定物質所具有之顏色的色相(hue)之值，b值越大表示微黃色越強，另一方面，b值越小表示藍色越強。
本發明之低分子玻尿酸及/或其鹽，表示顏色的明度之L值(以下單純稱作「L值」)為90以上，為L值為92以上更佳，L值為93以上再更佳。
L值為規定物質所具有之顏色的亮度(lightness)之值，並以0~100之間的數值來表示。L值為100時，表示最明亮之狀態(完全的白色)，另一方面，L值為0時，表示最暗之狀態(完全的黑色)。
b值以及L值能夠以JIS Z 8730-1995所規定的色差表示方法，並以Lab系色度座標來表示。且，b值以及L值能夠以市售之色差計來測定。且，本發明中，針對固體之低分子玻尿酸及/或其鹽，是將b值以及L值當作測定者。
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽之b值以及L值能夠例如在色差計(商品名「COLOR AND COLOR DIFFERENCE METER MODEL 1001 DP」，日本電色工業股份公司製)上裝載10Φ透鏡，並在玻璃光槽塗滿測定試料1g以上來測定。
由本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，藉由色差計所測定出之表示顏色的色相之b值為10以下(進而L值為90以上)，由於具有較高的白色度，故能夠作為例如化妝料、食品以及醫藥品之原料來使用。
(硫含量以及氯含量)
由本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，藉由氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，打錠適性較優異。玻尿酸及/或其鹽中之氯含量或硫含量若超過1質量%，則氯化鈉等氯的金屬鹽或硫酸鈉等的金屬鹽會增加，因此觀察到粒子形狀的不均一性會增加，打錠時的結著力會較弱。相對於此，本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，由於其氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，氯的含量以及硫的含量較少，粒子形狀的均一性會增加，打錠時的結著力會提高，故打錠適性會提升。
且，本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽如後述，使用在以食品為首的醫藥品、化妝料中。
例如，以氯化鈉為首的鹽類，會有損及系統安定性的可能性。尤其是在乳化系統中，會成為解乳化的 要因。且，由於此等會直接塗布於肌膚或毛髮上或攝食，不管是任何理由，都期望氯化鈉等之鹵化物或硫酸鈉等之金屬鹽以及來自鹽酸或硫酸等酸之氯或硫被極力降低者。
因此，本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，其容積密度較高，且能夠提高乳化安定性以及安全性的點來說，氯含量也能夠為1質量%以下，為0.8質量%以下較佳，為0.5質量%以下更佳。
本發明中，本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽之氯含量以及硫含量能夠以習知的方法(例如元素分析(燃燒法、ICP發光分光分析法、原子吸光法、螢光X線分析法)、質量分析)來測定。另外，本發明中，本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽之氯含量能夠由Mohr’s法所測定之值來算出而測定。
(平均粒子徑)
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，以打錠適性更優異之點來看，平均粒子徑能夠為10μm以上且35μm以下，15μm以上較佳，另一方面，為30μm以下較佳。
(粒子徑之標準偏差)
粒子徑之標準偏差(standard deviation)是表示本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽之粒子徑的不均之指標。本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽由於其粒子徑的不均較少，能夠將密度更加提高，藉此能夠更加提高打錠適性 之點來看，粒子徑的標準偏差能夠為0.1以上且0.3以下，為0.15以上較佳，另一方面，為0.25以下較佳。
(二糖之比例)
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，以能夠發會玻尿酸原本的生理機能之點來看，二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下，為5質量%以上較佳，為8質量%以上更佳，另一方面，為25質量%以下較佳，為20質量%以下更佳。
使用來自動物或微生物的酵素(玻尿酸分解酵素)來將玻尿酸及/或其鹽低分子化時，通常要得到二糖(飽和二糖)較為困難。相對於此，藉由使用後述之製造方法，能夠得到包含二糖之本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽。
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽由於二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下，故包含特定量之較短糖鏈的糖。藉此，吸濕性會變高，結著力增加，故能夠將本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽以體積較大的粒子來得到。且，本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，其單糖的比例能夠為1.5質量%以上且3質量%以下。
(玻尿酸分解酵素)
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，以能夠更降低抗原性之點來看，能夠不含有玻尿酸分解酵素。本發明 中，「不含有玻尿酸分解酵素」意指本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽中的玻尿酸分解酵素之含量為1質量%以下。以降低抗原性之點來看，例如本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽為酸分解(例如後述之本實施形態相關之製造方法)所得之酸分解玻尿酸及/或其鹽較佳，更具體來說，以任一者製造方法來經歷酸分解所得的酸分解玻尿酸及/或其鹽更佳。
使用酵素(玻尿酸酶)將玻尿酸及/或其鹽低分子化時，有時玻尿酸分解酵素會殘存在經低分子化的玻尿酸及/或其鹽中。
相對於此，以後述之實施形態相關之製造方法，不使用玻尿酸分解酵素所得之本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，由於不含有玻尿酸分解酵素，故抗原性更加被降低。
(八糖之比例)
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，以更能夠確實發揮來自八糖的生理活性之點來看，八糖之比例能夠為1質量%以上且30質量%以下，為5質量%以上更佳。
(二糖、四糖、六糖以及八糖之合計)
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽中，二糖、四糖、六糖以及八糖之合計能夠為5質量%以上且80質量%以下，為10質量%以上較佳，另一方面，為70質量%以 下較佳。
例如本發明之一實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，其平均分子量為3,500以下，且二糖、四糖、六糖以及八糖之合計能夠為5質量%以上且80質量%以下，另外，能夠為20質量%以上且60質量%以下。此時，二糖的比例能夠為1質量%以上且30質量%以下。且，此時，八糖之比例能夠為1質量%以上且30質量%以下。
且，本發明中，玻尿酸及/或其鹽中的二糖、四糖、六糖以及八糖之比例(質量%)能夠由對於玻尿酸及/或其鹽之HPLC來鑑定。更具體來說，藉由各個HPLC測定所得之玻尿酸及/或其鹽的各波峰(例如若為二糖則分子量為400)之波峰面積除以全體之波峰面積，能夠算出玻尿酸及/或其鹽中的二糖、四糖、六糖以及八糖之比例(質量%)。
(動黏度)
本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，該玻尿酸及/或其鹽之5質量%水溶液的動黏度為2.0mm2/s以下(較佳為1.5mm2/s以下，更佳為1.3mm2/s以下)。
本發明中，玻尿酸及/或其鹽之5質量%水溶液的動黏度能夠使用Ubbelohde黏度計(柴田科學器械工業股份公司製)來測定。此時，選擇流下秒數會成為200~1000秒之係數的Ubbelohde黏度計。且，測定是在30℃的恆溫水槽中來進行，並使其沒有溫度變化。由 Ubbelohde黏度計所測定的前述水溶液之流下秒數與Ubbelohde黏度計之係數的積，能夠求出動黏度(單位：mm2/s)。
(作用效果)
由本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，藉由平均分子量為3,500以下，二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下，氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，且容積密度較0.25g/cm3大，例如打錠適性等之操作性較優異。
[玻尿酸及/或其鹽之製造方法]
本發明之一實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽之製造方法(以下亦稱作「第1製造方法」)包含下述步驟：調製包含低級醇(lower alcohol)、與平均分子量為3,500以上且10萬以下之原料玻尿酸及/或其鹽、與酸之酸性原料玻尿酸溶液之步驟、與在前述調製的步驟所得之前述酸性原料玻尿酸溶液中，將前述原料玻尿酸及/或其鹽酸水解之步驟(以下亦稱作「液相(liquid phase)分解步驟」)、與將包含由前述酸水解所得的水解物之酸性溶液以陰離子交換樹脂處理之步驟(以下亦稱作「陰離子交換樹脂處理步驟」)、與使經前述樹脂處理之前述水解物進行噴霧乾燥(spray-drying)或凍結乾燥(freeze-drying)之步驟(以下亦稱作「噴霧乾燥步驟」或「凍結乾燥步驟」)，前述酸性原料玻尿酸溶液包含15質量%以上且 35質量%以下之前述原料玻尿酸及/或其鹽，且前述酸性原料玻尿酸溶液中包含相對於前述原料玻尿酸及/或其鹽100質量份為5質量份以上且60質量份以下之前述低級醇。
<調製酸性原料玻尿酸溶液之步驟>
調製酸性原料玻尿酸溶液之步驟中，調製包含低級醇、與平均分子量為3,500以上且10萬以下之原料玻尿酸及/或其鹽、與酸之酸性原料玻尿酸溶液。
(原料玻尿酸及/或其鹽之分子量)
本實施形態相關之製造方法中，以能夠得到分子量為3,500以下且白色度較高的玻尿酸及/或其鹽之點來看，酸性原料玻尿酸溶液中所包含之原料玻尿酸及/或其鹽的分子量為5,000以上較佳，為6,000以上更佳，為8,000以上再較佳，另一方面，為5萬以下較佳，為2萬以下更佳。
((出發)原料玻尿酸及/或其鹽之分子量的測定方法)
本發明中，原料玻尿酸及/或其鹽(以及後述之出發原料玻尿酸及/或其鹽)之平均分子量能夠由下述方法來測定。亦即，精準地測量約0.05g的玻尿酸(本品)，溶解於0.2mol/L濃度的氯化鈉溶液，正確地測量正確成為100mL之溶液以及此溶液8mL、12mL以及16mL，分別 添加0.2mol/L濃度之氯化鈉溶液，並將正確地成為20mL之溶液作為試料溶液。對於此試料溶液以及0.2mol/L濃度之氯化鈉溶液，由日本藥局方(第十六改正)一般試驗法之黏度測定法(第1法毛細管黏度測定法)於30.0±0.1℃下測定比黏度(式(A))，算出各個濃度中的還原黏度(式(B))。將還原黏度作為縱軸，將本品所換算之相對於乾燥物的濃度(g/100mL)作為橫軸，描繪出圖表，由連接各個點的直線與縱軸之交點求出極限黏度。將於此所求出的極限黏度代入Laurent之式(式(C))，算出平均分子量(Torvard C Laurent,Marion Ryan，and Adolph Pietruszkiewicz,“Fractionation of hyaluronic Acid”,Biochemina et Biophysica Acta.,42,476-485(1960)、四方田千佳子，「玻尿酸鈉製劑之SEC-MALLS之分子量評估」，國立衛研報，第121號，030-033(2003))。
(式A)比黏度={試料溶液所需要的流下秒數)/(0.2mol/L氯化鈉溶液所需要的流下秒數)}-1
(式B)還原黏度(dL/g)=比黏度/(本品所換算之相對於乾燥物的濃度(g/100mL))
(式C)極限黏度(dL/g)=3.6×10-4M0.78 M：平均分子量
(原料玻尿酸及/或其鹽之濃度)
酸性原料玻尿酸溶液中，作為原料玻尿酸及/或其鹽溶解於酸性原料玻尿酸溶液中之濃度較佳。
更具體來說，在液相分解步驟中，在防止原料玻尿酸及/或其鹽之褐變色的同時，也能夠達成原料玻尿酸及/或其鹽的低分子化(例如將所得之玻尿酸及/或其鹽的平均分子量成為3,500以下)，且，以能夠抑制單糖的發生之點來說，酸性原料玻尿酸溶液中的原料玻尿酸及/或其鹽之濃度(相對於該酸性原料玻尿酸溶液的質量之前述原料玻尿酸及/或其鹽的質量)為15質量%以上，為16質量%以上較佳，為18質量%以上更佳，另一方面，為35質量%以下，為32質量%以下較佳。
(溶劑)
以原料玻尿酸及/或其鹽之溶解性較優異之點來說，酸性原料玻尿酸溶液所使用的溶劑為含水溶劑(較佳為水)較佳，但只要是能夠使原料玻尿酸及/或其鹽溶解，該溶劑亦可為水、或包含30質量%以下之與水混和的有機溶劑之含水溶劑。
(低級醇)
本發明中，「低級醇」意指碳原子數為1、2或3的醇，有舉例如甲醇、乙醇、1-丙醇以及2-丙醇。其中，能 夠將1種或2種以上作為低級醇來使用。作為低級醇，例如以甲醇以及/或乙醇較佳，以乙醇更佳。
以能夠將最後所得之玻尿酸及/或其鹽的分子量更確實地調整至3,500以下之點來說，前述酸性原料玻尿酸溶液中包含相對於前述原料玻尿酸及/或其鹽100質量份為10質量份以上、或50質量份以下之前述低級醇較佳。
(酸)
前述酸性原料玻尿酸溶液中所包含之酸只要是能夠將該酸性原料玻尿酸溶液的pH值調整成酸性的酸，能夠使用任一者之酸。以能夠降低酸的使用量之觀點來看，該酸能夠使用例如鹽酸、硫酸、溴氫酸、硝酸、磷酸等之無機酸、乙酸、檸檬酸、含有磺基之有機酸(例如對甲苯磺酸、三氟甲磺酸)、含有氟原子之有機酸(例如三氟乙酸)等之有機酸。
(添加方法)
調製前述酸性原料玻尿酸溶液之步驟中，藉由將前述低級醇、與前述原料玻尿酸及/或其鹽之混合物(於此，前述混合物包含相對於前述原料玻尿酸及/或其鹽100質量份為5質量份以上且60質量份以下之前述低級醇)添加於包含酸的液體(酸性液)中，能夠調製前述酸性原料玻尿酸溶液。
或藉由於包含前述原料玻尿酸及/或其鹽以及低級醇之溶液中添加酸，也能夠調製前述酸性原料玻尿酸溶液。
於前述酸性液中添加前述混合物來調製前述酸性原料玻尿酸溶液時，前述混合物中原料玻尿酸及/或其鹽能夠以低級醇來進行濕潤。此時，使用後述固相分解步驟中所得之前述原料玻尿酸及/或其鹽來調製酸性原料玻尿酸溶液時，在進行該固相分解步驟之後的傾析時，亦可藉由將於該固相分解步驟中所使用的低級醇調整成為所期望之比例來調製前述酸性原料玻尿酸溶液。
本發明中，「以低級醇使原料玻尿酸及/或其鹽濕潤」意指原料玻尿酸及/或其鹽之至少一部份在低級醇中是以固體存在，此固體之原料玻尿酸及/或其鹽會因為低級醇而濕潤並膨脹膨之狀態。
前述原料玻尿酸及/或其鹽以低級醇而經濕潤之狀態下，將前述原料玻尿酸及/或其鹽與低級醇之混合物添加於前述酸性液中，來調製前述酸性原料玻尿酸溶液，藉此來防止前述原料玻尿酸及/或其鹽在酸性液中成團(亦即前述原料玻尿酸及/或其鹽在酸性液中會凝集，且在酸溶液中無法均勻分散)，並能夠提高前述原料玻尿酸及/或其鹽在酸性液中的分散性。
以低分子化的進行能夠更加容易之點來說，將添加前述混合物之前的前述酸性液之質量設為100質量 份時，相對於添加前述混合物之前的前述酸性液之質量，所添加的前述混合物之質量(前述混合物之質量/添加前述混合物之前的前述酸性液之質量)為10質量份以上且40質量份以下較佳，為20質量份以上更佳，另一方面，為30質量份以下更佳。
(酸性原料玻尿酸溶液之pH值)
且，在液相分解步驟中，以防止原料玻尿酸及/或其鹽的褐變色，且能夠達成原料玻尿酸及/或其鹽的低分子化之點來說，前述酸性原料玻尿酸溶液之pH值能夠為0.2以上且2以下，為0.3以上較佳，為0.5以上更佳，為0.8以上再更佳，另一方面，為1.8以下較佳，為1.5以下更佳，為1.0以下再更佳。
<液相分解步驟>
液相分解步驟(第1低分子化步驟)中，保持在包含15質量%以上且35質量%以下平均分子量為3,500以上且10萬以下之原料玻尿酸及/或其鹽之酸性原料玻尿酸溶液中，並將前述原料玻尿酸及/或其鹽進行酸水解。藉此，原料玻尿酸及/或其鹽會因酸水解而被低分子化，得到分子量更小的水解物(玻尿酸及/或其鹽)。
(反應溫度)
液相分解步驟中，以能夠防止經低分子化之玻尿酸及 /或其鹽的褐變色之點來說，反應液的溫度通常為85℃以下(較佳為80℃以下)較佳，為60℃以上(較佳為65℃以上)更佳。
(反應時間)
液相分解步驟中，以能夠防止經低分子化之玻尿酸及/或其鹽的褐變色之點來說，反應時間通常為30分鐘以上且10小時較佳，為60分鐘以上且8小時以下更佳。
(所得之玻尿酸及/或其鹽的分子量)
藉由液相分解步驟能夠得到平均分子量為3,500以下(較佳為2,800以下，更佳為2,500以下，另一方面，較佳為1,000以上，更佳為1,200以上)之玻尿酸及/或其鹽。
<陰離子交換樹脂處理步驟>
本實施形態相關之製造方法中，將包含前述液相分解步驟後之前述酸水解所得的水解物之酸性溶液以陰離子交換樹脂進行處理。於此，水解物是原料玻尿酸及/或其鹽經低分子化後所得，且分子量比原料玻尿酸及/或其鹽更小的玻尿酸及/或其鹽。
藉由進行陰離子交換樹脂處理步驟，能夠去除前述酸性溶液中的陰離子(例如氯化物離子、溴化物離子、氟化物物離子、碘化物離子等鹵化物離子、或硫酸離 子等硫化物離子)，因此能夠降低本實施形態相關之製造方法最終所得的玻尿酸及/或其鹽中所包含的來自陰離子之元素(例如氯或硫)的含量。
陰離子交換樹脂處理步驟中，由於將包含液相分解步驟後之液相分解步驟所得的水解物之前述酸性溶液以陰離子交換樹脂進行處理，故處理效率較優異。此時，作為所使用之陰離子交換樹脂，例如強鹼性、弱鹼性，進而有舉出凝膠型或多孔型之離子交換樹脂。且，由於降低了對樹脂的損壞，亦可於前述酸性溶液中添加鹼，並提高該酸性溶液的pH值(未滿pH7)之後，再以陰離子交換樹脂處理該酸性溶液。
且，在陰離子交換樹脂處理步驟中，亦可例如於前述保持(酸水解)後之前述酸性溶液中添加陰離子交換樹脂並攪拌。例如先在容器內使陰離子交換樹脂固定化，將前述酸性溶液倒入其容器中並攪拌，使酸性溶液中的玻尿酸及/或其鹽與陰離子交換樹脂接觸，藉此能夠去除陰離子(例如上述所例示之陰離子)。此時，亦可於容器中使陰離子交換樹脂固定化。藉由將陰離子交換樹脂固定化，能夠在處理後輕易地將陰離子交換樹脂與酸性溶液分離。或亦可將前述保持(酸水解)後之前述酸性溶液通液於填充有陰離子交換樹脂之管柱。
且，亦可在調整液相分解步驟(例如、陰離子交換樹脂處理步驟)所得之液體的pH值之後再進行噴霧乾燥或凍結乾燥。此時，能夠防止最後所得的玻尿酸及 /或其鹽之褐變色，且以能夠提高安定性之點來說，將該液體的pH值調整至4以上且8以下(較佳為5以上或7以下)較佳。
pH值的調製能夠使用鹼性物質(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂、氫氧化鈣等之鹼金屬或鹼土類金屬之氫氧化物、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、碳酸鎂等之鹼金屬或鹼土類金屬之碳酸鹽、重碳酸鈉、重碳酸鉀、重碳酸鈣、重碳酸鎂等之鹼金屬或鹼土類金屬之重碳酸鹽等之鹼性無機鹽、或鹼性有機鹽)來進行。
<噴霧乾燥步驟或凍結乾燥步驟>
本實施形態相關之製造方法包含在陰離子交換樹脂處理步驟之後，將經前述樹脂處理(以陰離子交換樹脂之處理)之前述水解物進行噴霧乾燥或凍結乾燥之步驟。
<噴霧乾燥步驟>
噴霧乾燥步驟中，使包含前述水解物之液體進行噴霧乾燥，得到固體之玻尿酸及/或其鹽。亦即，以前述噴霧乾燥步驟，能夠得到分子量為3,500以下，二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下，氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，且容積密度較0.25g/cm3大之玻尿酸及/或其鹽。
亦即，藉由噴霧乾燥步驟能夠得到上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽。在噴霧乾燥步驟中，使進 行前述液相分解步驟以及陰離子交換樹脂處理步驟之後所得，且包含水解物之液體進行噴霧乾燥，藉此能夠降低最後所得之玻尿酸及/或其鹽的陰離子含量，且能夠得到體積較大且不均較少的玻尿酸以及/或其鹽之粒子。
(玻尿酸及/或其鹽之濃度)
更具體來說，在噴霧乾燥步驟中，以能夠適當地進行噴霧之點來說，使其噴霧乾燥之液體中包含8質量%以上且35質量%以下之水解物較佳，包含10質量%以上更佳，包含11質量%以上再更佳，另一方面，包含30質量%以下較佳，包含28質量%以下更佳，包含26質量%以下再更佳，包含24質量%以下特別佳。
且，使其噴霧乾燥之液體中所包含之水解物的量是將液相分解步驟的酸性原料玻尿酸溶液中所包含之原料玻尿酸及/或其鹽的含量當作水解物的含量所算出的值。
(噴霧乾燥裝置)
噴霧乾燥步驟中，能夠使用市售之噴霧乾燥裝置來進行噴霧乾燥。作為市售之噴霧乾燥裝置，有舉出圓盤型噴霧式乾燥器或葉片型噴霧式乾燥器。
(噴霧溫度)
噴霧乾燥步驟中，以能夠防止玻尿酸及/或其鹽的凍 結以及褐變色之點來說，噴霧乾燥步驟中的加熱器溫度通常為200℃以下(較佳為170℃以下)較佳，為150℃以上(較佳為100℃以上)更佳。
平均分子量為3,500以上之玻尿酸及/或其鹽由於黏度較高，以噴霧乾燥來進行純化時，為了要適當地進行噴霧，通常必須調整到將包含玻尿酸及/或其鹽之液體的黏度降低之狀態(例如玻尿酸及/或其鹽之濃度通常為1質量%以上且8質量%以下)。
相對於此，由於水解物為低黏度，不需稀釋陰離子交換樹脂處理步驟中所得之液體(或以稀釋量較少之狀態)，即能在噴霧乾燥步驟中進行噴霧，故較有效率。
<凍結乾燥步驟>
更具體來說，在凍結乾燥步驟中，以能夠適當地進行凍結之點來說，使其凍結乾燥之液體中包含8質量%以上且35質量%以下之水解物較佳，包含10質量%以上更佳，包含11質量%以上再更佳，另一方面，包含28質量%以下更佳，包含26質量%以下再更佳，包含24質量%以下特別佳。
於此，使其凍結乾燥之液體中所包含的水解物的量是將液相分解步驟的酸性原料玻尿酸溶液中所包含之原料玻尿酸及/或其鹽的含量(或液相分解步驟的酸性原料玻尿酸溶液中所包含之出發原料玻尿酸及/或其鹽的 含量)當作水解物之含量所算出的值。
(凍結乾燥裝置)
凍結乾燥步驟中，能夠使用市售的凍結乾燥裝置來進行凍結乾燥。作為市售的凍結乾燥裝置，有舉出ULVAC公司的凍結乾燥機(DFR-5N-B)。
(凍結乾燥溫度)
凍結乾燥步驟中，以能夠防止玻尿酸及/或其鹽的褐變色之點來說，凍結乾燥步驟中的溫度通常為-20℃以下(較佳為-30℃以下)較佳，為-80℃以上(較佳為-70℃以上)更佳。
<固相分解步驟>
本實施形態相關之製造方法中，在前述液相分解步驟(第1低分子化步驟)之前，能夠進一步包含作為第2低分子化步驟之使平均分子量為3,000以上且50萬以下的出發原料玻尿酸及/或其鹽分散於酸性含水媒體(medium)中，而得到前述原料玻尿酸及/或其鹽之步驟(以下亦稱作「固相(solid phase)分解步驟」)。
固相分解步驟中，將該出發原料玻尿酸及/或其鹽低分子化後而得到前述原料玻尿酸及/或其鹽。更具體來說，固相分解步驟中，藉由使前述出發原料玻尿酸及/或其鹽分散於酸性含水媒體中，前述出發原料玻尿酸 及/或其鹽之至少一部分不會溶解於酸性含水媒體中，能夠使前述出發原料玻尿酸及/或其鹽以固體狀態(更具體來說，前述出發原料玻尿酸及/或其鹽懸浮在前述酸性含水媒體中之狀態)與酸進行反應。藉此，能夠防止所得之玻尿酸及/或其鹽的褐變色，且能夠防止副產物(玻尿酸之分解物、例如單糖或非還原末端糖等)的生成，故能夠提高所得之玻尿酸及/或其鹽的純度。
且，藉由固相分解步驟，前述出發原料玻尿酸及/或其鹽之至少一部分不會溶解於酸性含水媒體中，能夠以固體狀態與酸進行反應，故能夠抑制經低分子化之玻尿酸及/或其鹽溶解於反應液後與酸反應所生成的單糖。其結果，經過持續的液相分解步驟後，能夠將最後所得之水解物(玻尿酸及/或其鹽)中的二糖比例調整到1質量%以上且30質量%以下，且，經過持續的液相分解步驟後，能夠將最後所得之水解物(玻尿酸及/或其鹽)中的八糖比例調整至1質量%以上且30質量%以下，且經過持續的液相分解步驟後，能夠將最後所得之水解物(玻尿酸及/或其鹽)中的二糖、四糖、六糖以及八糖的合計調整至5質量%以上且80質量%以下。
且，欲將平均分子量為1萬以上且50萬以下之出發原料玻尿酸及/或其鹽分散於酸性含水媒體中，而得到平均分子量為3,500以下之玻尿酸及/或其鹽時，水溶性更高且經低分子化的玻尿酸及/或其鹽會優先溶解於構成酸性含水媒體的水中，其結果會有最後所得之玻尿酸 及/或其鹽產生褐變色，或副產物(例如單糖)的生成量增加之虞(例如單糖的含量超過3質量%)。
相對於此，本實施形態相關之製造方法中，以固相分解步驟將出發原料玻尿酸及/或其鹽進行某程度的低分子化後，以液相分解步驟得到平均分子量為3,500以下之玻尿酸及/或其鹽，藉此能夠抑制褐變色的發生以及副產物的發生。
(出發原料玻尿酸及/或其鹽)
出發原料玻尿酸及/或其鹽為原料玻尿酸及/或其鹽的出發原料，原料玻尿酸及/或其鹽較平均分子量大。
以能夠得到原料玻尿酸及/或其鹽的平均分子量為3,500以上且50萬以下之點來說，出發原料玻尿酸及/或其鹽的平均分子量為1萬以上較佳，為10萬以上更佳，另一方面，為200萬以下較佳，為100萬以下更佳。
前述固相分解步驟中，相對於前述酸性含水媒體之質量的前述出發原料玻尿酸及/或其鹽之質量(作為酸性含水媒體之質量100質量%)能夠為3質量%以上且20質量%以下，為3質量%以上較佳，另一方面，為15質量%以下較佳。
(酸性含水媒體)
本實施形態相關之製造方法中，作為分散出發原料玻 尿酸及/或其鹽的酸性含水媒體所使用之溶劑，有舉出水溶性有機溶劑。作為水溶性有機溶劑，能夠舉例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇等醇系溶劑(其中為低級醇)、丙酮、丁酮等酮系溶劑、四氫呋喃、乙腈等，亦能夠單獨或組合來使用。
(水的比例)
酸性含水媒體中，以防止原料玻尿酸及/或其鹽之溶解，且防止收率降低之點來說，相對於酸性含水媒體的全量，水的比例為40容量%以下較佳，為30容量%以下再更佳，通常為1容量%以上。
(酸性含水媒體之pH值)
且，在固相分解步驟中，以防止原料玻尿酸及/或其鹽之褐變色，且能夠達成原料玻尿酸及/或其鹽的低分子化之點來說，前述酸性含水媒體之pH值為1以下較佳，為0以上更佳。
(固相分解步驟以外的第2低分子化步驟)
且，取代固相分解步驟而作為第2低分子化步驟，有例如能夠藉由選自酵素分解、熱分解、原料玻尿酸及/或其鹽溶解於反應液之狀態中的酸分解、鹼分解、電子線照射所造成的分解、以及超音波所造成的分解中至少1種方法，將出發原料玻尿酸及/或其鹽低分子化而得到原料玻 尿酸及/或其鹽，但以容易控制最後所得之玻尿酸及/或其鹽中的單糖、二糖、八糖的比例之點來說，藉由固相分解步驟(亦即，將出發原料玻尿酸及/或其鹽分散於酸性含水媒體中，並將該出發原料玻尿酸及/或其鹽以固體狀態與酸反應之方法)來將該出發原料玻尿酸及/或其鹽水解之方法較佳。
(反應溫度)
固相分解步驟中，以能夠防止經低分子化之玻尿酸及/或其鹽的褐變色之點來說，反應液的溫度通常為95℃以下(較佳為90℃以下)較佳，為55℃以上(較佳為60℃以上)更佳。
(反應時間)
固相分解步驟中，以能夠防止經低分子化之玻尿酸及/或其鹽的褐變色之點來說，反應時間通常為30分鐘以上且10小時以下較佳，為60分鐘以上且2小時以下更佳。
<作用效果>
由本實施形態相關之製造方法，藉由包含液相分解步驟、與陰離子交換樹脂處理步驟、與噴霧乾燥步驟或凍結乾燥步驟，能夠使用前述陰離子交換樹脂處理步驟中所得之液體來進行前述噴霧乾燥步驟或凍結乾燥步驟，因此能夠有效率地得到將上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽 作為固體。
更具體來說，由本實施形態相關之製造方法，藉由將包含高濃度(例如8質量%以上且35質量%以下)之平均分子量為3,500以下的玻尿酸及/或其鹽之液體進行噴霧乾燥或凍結乾燥，能夠得到容積密度較高的玻尿酸及/或其鹽。
本實施形態相關之製造方法中，作為經過噴霧乾燥步驟，能夠得到平均分子量為3,500以下且容積密度較高(0.25g/cm3以上)，且粒子徑之不均較少的玻尿酸及/或其鹽之理由，有舉出由於平均分子量為3,500以下的玻尿酸及/或其鹽其黏度較低，能夠提高噴霧乾燥時的濃度，故能夠進行適當的噴霧。
為了藉由噴霧乾燥得到固體，通常在進行噴霧乾燥時，以適度的濃度包含成為噴霧乾燥對象的物質，且必須使用黏度較低的液體。成為噴霧乾燥對象的物質之濃度若過低，有時難以得到作為固體之成為噴霧乾燥對象的物質。
由於高分子之玻尿酸及/或其鹽(例如平均分子量超過3,500者，尤其是平均分子量為10萬以上且200萬以下者)其黏度過高，為了進行噴霧乾燥，且為了降低黏度，必須將該玻尿酸及/或其鹽之濃度降低。然而，使用如此之濃度較低的液體來進行噴霧乾燥時，會有產生無法將玻尿酸以固體回收之問題。
相對於此，本發明者們發現以下新知，針對 平均分子量為3,500以下之玻尿酸及/或其鹽，藉由將成為噴霧乾燥對象的液體中之濃度設在8質量%以上且35質量%以下，能夠進行噴霧乾燥，並創造出本實施形態相關之製造方法。
亦即，藉由本實施形態相關之製造方法能夠得到上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽。
且，本實施形態相關之製造方法具有以下特徵(1)至(5)。
(1)與使用酵素之玻尿酸及/或其鹽的低分子化方法進行比較，由本實施形態相關之製造方法，能夠得到純度以及白色度較高的玻尿酸及/或其鹽，且能夠將抗原性更加低減，且能夠降低製造成本。
(2)與藉由乙醇之添加所造成的沉澱來將玻尿酸及/或其鹽純化之方法進行比較，由本實施形態相關之製造方法，能夠得到雜質(例如氯化物離子)之含量較少的玻尿酸及/或其鹽，且玻尿酸及/或其鹽的收率較優異。
(3)與將平均分子量超過10萬的原料玻尿酸及/或其鹽溶解於酸性或鹼性的原料玻尿酸溶液中，以此狀態進行低分子化，而得到平均分子量為3,500以下的玻尿酸及/或其鹽之方法進行比較，由本實施形態相關之製造方法，能夠得到白色度較高，且副產物(例如單糖)的含量較少的玻尿酸及/或其鹽。
(4)欲藉由將平均分子量超過10萬的原料 玻尿酸及/或其鹽以固體之狀態直接分散於酸性含水媒體中之方法(於此，作為將原料玻尿酸及/或其鹽以固體之狀態直接分散於酸性含水媒體中之方法，有舉例如作為上述固相分解步驟所記載之方法。)，而得到平均分子量為3,500以下的玻尿酸及/或其鹽的話，依照不同的條件，所生成的低分子化物(平均分子量為3,500以下之玻尿酸及/或其鹽)會溶解於構成該酸性含水媒體的酸性水中，其結果，回收變得較為困難，故有時該低分子化物會因為該酸性水中所包含的酸而褐變色，或因為酸而使該低分子化物被分解，而產生單糖等副產物。相對於此，由本實施形態相關之製造方法，能夠得到白色度較高且副產物(例如單糖)的含量較少的玻尿酸及/或其鹽。
(5)尤其是經過噴霧乾燥步驟所得到的玻尿酸及/或其鹽，與經過凍結乾燥步驟所得到的玻尿酸及/或其鹽(通常能得到柔軟的綿狀固體)進行比較，粒子徑的不均更少，且微量雜質的含量也更少。
[低分子玻尿酸之噴霧乾燥‧凍結乾燥]
本發明之一實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽的製造方法中包含：使包含8質量%以上且35質量%以下的平均分子量為3,500以下的玻尿酸及/或其鹽之液體進行噴霧乾燥或凍結乾燥，而得到固體之玻尿酸及/或其鹽之步驟。
在本實施形態相關之製造方法中，以得到容 積密度更高，且粒子徑的不均較少的粒子之點來說，使其噴霧乾燥來得到固體的玻尿酸及/或其鹽更佳。此時，成為噴霧乾燥對象的玻尿酸及/或其鹽之平均分子量為3,500以下較佳，為2,800以下更佳，另一方面，為1,000以上較佳，為1,200以上更佳。
亦即，平均分子量為3,500以下的玻尿酸及/或其鹽，由於黏度比高分子的玻尿酸及/或其鹽更低，在本實施形態相關之製造方法中，藉由提高成為噴霧乾燥對象的液體中之玻尿酸及/或其鹽之濃度(設在8質量%以上且35質量%以下)，能夠得到容積密度較高，且粒子徑的不均較少的粒子狀玻尿酸及/或其鹽。
[食品]
本發明之一實施形態相關之食品包含上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽。更具體來說，本實施形態相關之食品能夠含有0.1質量%以上且100質量%以下之上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽。
含有上述玻尿酸及/或其鹽之食品的形態並無特別限定，但除了例如主食的米飯加工食品、製麵包類等、副食品之真空罐頭、冷凍食品、熟食、乾燥食品等、美乃滋等調味料、飲料、甜食、點心類、液狀、膠狀或軟膠囊狀等補充劑類等一般食品全部之外，也能夠舉出被許可表現生理機能的特定保健用食品全部。
本實施形態相關之食品之形態並無特別限 定，可舉例如口香糖、糖果、軟糖、錠劑般之食品、果凍飲料、米飯加工食品、製麵包類、真空罐頭、冷凍食品、熟食、乾燥食品、美乃滋等調味料、飲料、甜食、點心類、補充劑類等之一般食品全部、被許可表現生理機能的特定保健用食品全部，其中以利便性優異之點來說，為補充劑類較佳。
且，作為補充劑類的形態，有舉例如錠劑狀、散劑狀、細粒狀、顆粒狀、膠囊狀(硬膠囊、軟膠囊)等之固形狀、液狀、懸濁液狀、果凍狀、糖漿狀等流動狀。
由於玻尿酸及/或其鹽為生體物質，故認為即使攝取多量也沒有副作用，或非常得低，但作為食品所攝取的本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽之量，能夠以每一天為1mg以上且1000mg以下，較佳為15mg以上且300mg以下作為標準。
[化妝料]
本發明之一實施形態相關之化妝料包含上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽。
本實施形態相關之化妝料的使用形態並無特別限定，但使其塗佈或接觸於生體組織表面來攝取較佳，尤其是使其塗佈或接觸於臉部、手腕、手指、腳、關節等皮膚較佳。
作為本實施形態相關之化妝料，有舉例如皮 膚用化妝料。藉由將上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽使用於皮膚用化妝料，由於具有適度的黏度，且保水效果較高，能夠賦予皮膚滋潤，並改善皮膚的乾燥感。
作為本實施形態相關之皮膚用化妝料的形態，有舉例如洗顏料、洗淨料、化妝水(例如美白化妝水)、乳霜(例如光澤乳霜、冷霜)、乳液、美容液、面膜(例如、果凍狀脫落型、膏狀擦去型、粉末狀洗去型)、清潔液、粉底液、口紅、護唇膏、唇膏、唇線筆、腮紅、刮鬍乳霜、防曬乳、除臭劑、身體乳液(包含護手霜、護腳霜)、身體油、肥皂、入浴劑。
本實施形態相關之化妝料中亦可進一步摻混以下成分。作為前述成分，有舉例如陽離子化多糖類(例如陽離子化玻尿酸、陽離子化羥乙基纖維素、陽離子化古亞膠、陽離子化澱粉、陽離子化玉米糊劑、陽離子化葡聚糖、陽離子化丁聚醣、陽離子化蜂蜜等)、負離子界面活性劑(例如烷基苯磺酸鹽、聚氧伸烷基烷基醚硫酸酯鹽、烷基硫酸鹽、烯烴磺酸鹽、脂肪酸鹽、二烷基磺基丁二酸酯等)、非離子界面活性劑(例如聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油衍生物等)、陽離子界面活性劑(例如烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、烷基吡啶陽離子鹽、氯化硬脂醯三甲基銨等)、兩性界面活性劑(例如烷基甜菜鹼、烷基醯胺丙基甜菜鹼、咪唑啉甜菜鹼、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂等)、油分(例如矽、矽衍生物、流動石蠟、鯊烷、蜜蠟、棕櫚蠟、橄欖油、酪梨油、苦茶油、 荷荷芭油、馬油等)、保濕劑(例如玻尿酸鈉、水解玻尿酸、乙醯化玻尿酸、玻尿酸二甲基矽醇、神經醯胺、月桂醯基麩胺酸二植物甾醇辛基十二烷酯、植物肝醣、水解蛋殼膜、海藻糖、甘油、去端肽膠原蛋白、山梨醇、麥芽糖醇、1,3-丁二醇等)、高級脂肪酸(例如月桂酸、廿二酸、棕櫚酸、硬脂酸、異硬脂酸、油酸等)、高級醇(例如十六醇、十八醇、二十二醇、異十八醇、鯊肝醇等)、多價醇(例如甘油、二甘油、1,3-丙二醇、甲甘醇、聚乙二醇、戊烯甘油等)、增黏劑(例如纖維素酯、羧乙烯聚合物、黃原膠、棕櫚酸糊精等)、兩性高分子樹脂化合物(例如甜菜鹼化二烷氨基丙烯酸烷基酯共聚物等)、陽離子性高分子樹脂化合物(例如乙烯吡咯啶酮/二甲基氨基甲基丙烯酸乙酯共聚物陽離子化物、聚二甲基二烯丙基鹵化銨型陽離子性聚合物等)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯氧乙醇等)、抗氧化劑(例如生育酚、BHT等)、金屬封閉劑(例如依地酸鹽、艾提壯酸鹽等)、紫外線吸收劑(例如二苯甲酮衍生物、對氨安息香酸衍生物、甲氧基肉桂酸衍生物等)、紫外線反射劑(例如氧化鈦、氧化鋅等)、蛋白質水解物(例如角蛋白胜肽、膠原胜肽、大豆胜肽、小麥胜肽、牛奶胜肽、蠶絲胜肽、蛋白胜肽等)、胺基酸(例如左旋精胺酸、麩胺酸、甘胺酸、丙胺酸、羥脯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、L-茶胺酸等)、天然物萃取物(苦參萃取物、洋甘菊萃取物、海草萃取 物、尤加利樹萃取物、蜂王漿萃取物、迷迭香萃取物、櫸樹萃取物等)、其他機能性成分(輔酶Q10、熊果素、聚季銨鹽51、彈力蛋白、鉑奈米膠質、棕櫚酸視黃醇、泛醇、尿囊素、二月桂醯基麩胺酸離胺酸鈉、磷酸抗壞血酸鎂、L-抗壞血酸2-配醣體、土耳其鞣酸、麴酸、亞油酸、傳明酸等)、磷脂質聚合物、香料、色素。
[醫藥品]
本發明之一實施形態相關之醫藥品包含上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽。更具體來說，本實施形態相關之醫藥品能夠含有5質量%以上且100質量%以下之上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽。
本實施形態相關之醫藥品除了上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽以外，在不損及本發明之效果的範圍下，能夠包含其他原料。作為如此之原料的例示，有舉出水、賦形劑、抗氧化劑、防腐劑、濕潤劑、黏稠劑、緩衝劑、吸著劑、溶劑、乳化劑、安定化劑、界面活性劑、潤滑劑、水溶性高分子、甘味料、矯味劑、酸味料、酒精類等。
本實施形態相關之醫藥品的劑形並無特別限定，將該醫藥品以經口攝取時，有舉例如錠劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑等固形製劑、水劑、懸濁劑、糖漿劑、乳劑等之液劑等經口投予劑。
作為本實施形態相關之醫藥品所攝取之玻尿 酸及/或其鹽的量，能夠以每一天為10mg以上且1,000mg以下，較佳為100mg以上且500mg以下作為標準。投予次數因應症狀能夠選擇每一天一次或複數次。
且，本實施形態相關之醫藥品中能夠因應必要，摻混增量劑、鍵結劑、潤滑劑、保存劑、抗氧化劑、香料、甘味料、酸味料、賦形劑等。且，亦能夠摻混維他命C、維他命B2、維他命B12、維他命E等之維他命類、核酸、軟骨素硫酸、膠原蛋白等營養成分、鐵、鋅等礦物質成分等各種營養成分。
[玻尿酸及/或其鹽之一例]
本發明之一實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，其平均分子量為3,500以下，且具有以下特徵(1)至(13)中的1個或其以上(2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或13個)。
(1)容積密度較0.25g/cm3大。
(2)純度為90%以上。
(3)表示顏色之色相的b值為10以下。
(4)平均粒子徑為10μm以上且35μm以下。
(5)粒子徑的標準偏差為0.1以上且0.3以下。
(6)氯含量為1質量%以下。
(7)硫含量為1質量%以下。
(8)二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下。
(9)不含有玻尿酸分解酵素。
(10)八糖的比例為1質量%以上且30質量%以下。
(11)二糖、四糖、六糖以及八糖的合計為5質量%以上且80質量%以下。
(12)5質量%水溶液的動黏度為2.0mm2/s以下。
(13)單糖的比例為3質量%以下。
由本實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽，具有與上述實施形態相關之玻尿酸及/或其鹽相同的作用效果。
[實施例]
以下，以實施例進一步詳細地說明本發明，但本發明不限定於實施例。
<實施例1：玻尿酸之調製>
將分子量1萬的原料玻尿酸約5kg以乙醇1kg濕潤，以裝備攪拌機及加熱套之50L容槽添加於2%鹽酸25L(pH值為1.0、25kg)中，調製包含約16質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，將此於70℃下保持5小時，實施水解(液相分解步驟)。進一步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)，以水8L在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去 除。添加25%的氫氧化鈉水溶液2kg，將pH值調整在4.0以上且6.5以下。將所得之溶液(玻尿酸之濃度：12質量%，於此玻尿酸的濃度是將原料玻尿酸的添加量當作玻尿酸的含量來算出)以噴霧乾燥(加熱器溫度：180℃)使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸4.5kg(收率約90%)。
所得之玻尿酸以HPLC之測定所換算的分子量為2,200，b值為2.2，L值為95。且，將測定此玻尿酸的容積密度、粒子徑、粒度分布以及氯含量的結果表示於表1。
且，針對實施例1之玻尿酸、後述之實施例2至8以及比較例2至4、7以及8的玻尿酸進行HPLC之測定。且，HPLC之測定條件如以下所述。由HPLC之測定結果並根據上述實施形態之欄所說明之方法，分別算出實施例1至8之玻尿酸以及後述之比較例2至4、7以及8之玻尿酸的平均分子量以及二糖、四糖、六糖以及八糖的比例。
(HPLC測定條件)
HPLC分析裝置：商品名「Alliance PDA系統」，日本Waters股份公司製
使用管柱：膠體濾過管柱(商品名「Diol-120」，股份公司YMC製)
分析樣品：玻尿酸之0.1%(w/v)水溶液
管柱溫度：40℃
流速：1mL/分鐘
玻尿酸之0.1%(w/v)水溶液之注入量：20μL
移動相：0.003M磷酸緩衝液(含有0.15M NaCl，pH7.0)
使用本實施例相關之膠體濾過管柱的液相色層分析法中，保持時間較慢的為低分子。因此，玻尿酸之HPLC測定結果中，依照保持時間的長短順序，得到N-乙醯葡萄糖胺、D-葡萄醣醛酸、玻尿酸(二糖：重複構造單位1個)、玻尿酸(四糖：重複構造單位2個)、玻尿酸(六糖：重複構造單位3個)、玻尿酸(八糖：重複構造單位4個)...之波峰。
算出各波峰之分子量(例如為二糖的話則分子量為400)乘上波峰面積之值，積算每個波峰所算出的值。進一步藉由將此等除以全體波峰面積，能夠算出平均分子量。
<比較例1：玻尿酸之調製>
將乾燥且分子量1萬的原料玻尿酸約2kg以裝備攪拌機及加熱套的50L容槽添加於2%鹽酸25L(pH值為1.0、25kg)內，調製包含約7質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，將此保持在70℃下5小時，實施水解(液相分解步驟)。進一步，在所得之水解物中添加25質量%之氫氧化鈉水溶液2kg，將pH值調 製在4.0以上且6.5以下之後，進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)，以水18L在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。將所得之溶液(玻尿酸之濃度：4質量%，於此，玻尿酸的濃度是將原料玻尿酸的添加量當作玻尿酸的含量來算出。)以噴霧乾燥(加熱器溫度：180℃)進行乾燥時，會成為霧狀，且無法回收玻尿酸。
<比較例2：玻尿酸之調製>
除了進行凍結乾燥來取代進行噴霧乾燥以外，其餘與比較例1相同，得到比較例2之白色微粉末的玻尿酸1.9kg。
<實施例2：玻尿酸之調製>
於裝備攪拌機及加熱套的200L容槽中，加滿8%鹽酸28L(28kg)與乙醇100L，一邊攪拌一邊加熱至液體溫度成70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸5kg置入容器中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇1kg濕潤之狀態的原料玻尿酸)約6kg中添加2%之鹽酸25L(pH值為1.0、25kg)，調製包含約16質量%之原料玻尿酸的酸性 原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，於70℃下實施水解5小時(液相分解步驟)。進一步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)，以水12L在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%的氫氧化鈉水溶液2kg，將pH值調製在4.0以上且6.5以下。將所得之溶液(玻尿酸之濃度：11質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸的添加量當作玻尿酸的含量來算出)以噴霧乾燥(加熱器溫度：180℃)使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸4.5kg(收率約90%)。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測定時，約為1萬。
<實施例3：玻尿酸之調製>
將實施例2中主要使用的容器之容量、出發原料玻尿酸之質量、鹽酸之質量、乙醇之質量、氫氧化鈉之質量全部變更成100分之1進行縮小比例，除了將噴霧乾燥時的玻尿酸溶液之濃度設為14質量%以外，其餘以相同方法，得到實施例3之玻尿酸。
更具體來說，在2L容量的燒杯中加滿8%鹽酸280mL(280g)與乙醇1L，一邊攪拌，一邊以熱水浴加熱使液體溫度成為70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸50g置入燒杯中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇 (pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇10g濕潤之狀態的原料玻尿酸)約60g中添加2%鹽酸150mL(pH值為1.0、150g)，調製包含約24質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，於70℃下實施水解5小時(液相分解步驟)。進一步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)，以水120mL在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%氫氧化鈉水溶液20g，並將pH值調製成4.0以上且6.5以下。將所得之溶液(玻尿酸之濃度：14質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出)以噴霧乾燥(加熱器溫度：180℃)使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸46g(收率約92%)。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測定時，約為1萬。
<實施例4：玻尿酸之調製>
除了於實施例3中主要去除樹脂後所得之溶液中添加水來調整玻尿酸的濃度以外，其餘以相同方法，得到包含11質量%的實施例4之玻尿酸之溶液。使此溶液凍結乾燥，得到實施例4之玻尿酸。
更具體來說，在2L容量的燒杯中加滿8%鹽 酸280mL(280g)與乙醇1L，一邊攪拌，一邊以熱水浴加熱使液體溫度成為70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸50g置入燒杯中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇10g濕潤之狀態的原料玻尿酸)約60g中添加2%鹽酸150mL(pH值為1.0、150g)，調製包含約24質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，於70℃下實施水解5小時(液相分解步驟)。進一步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)，以水120mL在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%氫氧化鈉水溶液20g，並將pH值調製成4.0以上且6.5以下。將所得之溶液的一部分稀釋1.25倍者(玻尿酸之濃度：11質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出)以凍結乾燥使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測定時，約為1萬。
<比較例3：玻尿酸之調製>
除了於實施例2中主要去除樹脂後所得之溶液中添加 水來調整玻尿酸之濃度以外，其餘以相同之方法，得到包含約1質量%(0.6質量%)之比較例3的玻尿酸之溶液。使此溶液凍結乾燥，得到比較例3之玻尿酸。
更具體來說，在2L容量的燒杯中加滿8%鹽酸280mL(280g)與乙醇1L，一邊攪拌，一邊以熱水浴加熱使液體溫度成為70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸50g置入燒杯中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇10g濕潤之狀態的原料玻尿酸)約60g中添加2%鹽酸150mL(pH值為1.0、150g)，調製包含約24質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，於70℃下實施水解5小時(液相分解步驟)。進一步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)、以水120mL在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%氫氧化鈉水溶液20g，並將pH值調製成4.0以上且6.5以下。將所得之溶液的一部分稀釋22倍者(玻尿酸之濃度：0.6質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出)以凍結乾燥使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測 定時，約為1萬。
<比較例4：玻尿酸之調製>
除了變更比較例3中主要去除樹脂後所得之溶液中所添加的水量之外，其他與比較例3相同之方法，得到包含6質量%之比較例4的玻尿酸之溶液。使此溶液凍結乾燥，得到比較例4之玻尿酸。
更具體來說，在2L容量的燒杯中加滿8%鹽酸280mL(280g)與乙醇1L，一邊攪拌，一邊以熱水浴加熱使液體溫度成為70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸50g置入燒杯中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇10g濕潤之狀態的原料玻尿酸)約60g中添加2%鹽酸150mL(pH值為1.0、150g)，調製包含約24質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，於70℃下實施水解5小時(液相分解步驟)。進一步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)，以水120mL在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%氫氧化鈉水溶液20g，並將pH值調製成4.0以上且6.5以下。將所得之溶液的一部分稀釋2.5 倍者(玻尿酸之濃度：6質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出)以凍結乾燥使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測定時，約為1萬。
<比較例5：玻尿酸之調製>
除了改變實施例2中主要去除樹脂後所得之溶液中所添加之水量之外，其餘以與實施例2相同之方法，得到包含6質量%之比較例5的玻尿酸之溶液。將此溶液進行與實施例2相同的噴霧乾燥時，會成為霧狀，且無法回收玻尿酸。
更具體來說，在2L容量的燒杯中加滿8%鹽酸280mL(280g)與乙醇1L，一邊攪拌，一邊以熱水浴加熱使液體溫度成為70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸50g置入燒杯中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇10g濕潤之狀態的原料玻尿酸)約60g中添加2%鹽酸150mL(pH值為1.0、150g)，調製包含約24質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，於70℃下實施水解5小時(液相分解步驟)。進一 步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)，以水120mL在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%氫氧化鈉水溶液20g，並將pH值調製成4.0以上且6.5以下。將所得之溶液的一部分稀釋2.5倍者(玻尿酸之濃度：6質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出)進行噴霧乾燥時，會成為霧狀，且無法回收玻尿酸。
<比較例6：玻尿酸之調製>
在2L容量的燒杯中加滿8%鹽酸280mL(280g)與乙醇1L，一邊攪拌，一邊以熱水浴加熱使液體溫度成為70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸50g置入燒杯中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，將殘存之固形物以減壓乾燥使其乾燥。於乾燥後之玻尿酸約50g中添加2%鹽酸150mL(pH值為1.0、150g)時，玻尿酸會成團，且無法完全溶解，但直接調製包含約25質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，並於70℃下實施水解(液相分解步驟)5小時。進一步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三 菱化學製)，以水120mL在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%氫氧化鈉水溶液20g，並將pH值調製成4.0以上且6.5以下。將所得之溶液(玻尿酸之濃度：15質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出)以噴霧乾燥使其乾燥，得到褐變色的玻尿酸，所得之玻尿酸的b值為10以上。且，單糖之比例為4%。
<比較例7：玻尿酸之調製>
除了將實施例2中主要固相分解步驟的水解時間設為2小時，在以陰離子交換樹脂處理之前，添加氫氧化鈉中和後，添加乙醇使玻尿酸沉澱以外，其餘以與實施例2相同之方法，得到比較例7之玻尿酸。
更具體來說，於裝備攪拌機及加熱套的500L容槽中加滿8%鹽酸28L(28kg)與乙醇100L，一邊攪拌，一邊加熱至液體溫度成為70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸5kg置入容器中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇1kg濕潤狀態的原料玻尿酸)約6kg中添加2%鹽酸25L(pH值為1.0、25kg)，調製包含約16質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為 1)，於70℃下實施水解(液相分解步驟)2小時。添加乙醇240L作為懸濁狀態，接著以25%氫氧化鈉水溶液將懸濁液之pH值調整成4.0以上且6.5以下，藉此使玻尿酸沉澱。將所得之沉澱物減壓乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸4.5kg(收率約90%)。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測定時，約為1萬。
由於比較例7之玻尿酸是不經由陰離子交換樹脂處理步驟所得者，故能理解氯含量在超過1質量%時，因沉澱所得者，其粒子徑的標準偏差會大幅超過0.3，且粒子形狀會有不均一性。
<比較例8：玻尿酸之調製>
於裝備攪拌機及加熱套的200L容槽中，加滿8%鹽酸28L(28kg)與乙醇100L，一邊攪拌一邊加熱至液體溫度至70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸5kg置入容器中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇1kg濕潤之狀態的原料玻尿酸)約6kg中添加2%之鹽酸25L(pH值為1.0、25kg)，調製包含約16質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，於70℃下實施水解5小時(液相分解步驟)。添加25%的氫氧化鈉水溶液2kg，將pH值調製在4.0以上且6.5以下。將所得之溶液 (玻尿酸之濃度：15質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出)以噴霧乾燥使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸4.5kg(收率約90%)。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測定時，約為1萬。
由於比較例8之玻尿酸是不經由陰離子交換樹脂處理步驟所得者，故能夠理解由於氯含量超過1質量%，粒子徑的標準偏差會超過0.3，且粒子形狀會有不均一性。
<實施例5：玻尿酸之調製>
於裝備攪拌機及加熱套之200L容槽中加滿8%鹽酸14L(14kg)與乙醇53L，一邊攪拌，一邊加熱至液體溫度至70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸5kg置入容器中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇1.5kg濕潤狀態之原料玻尿酸)約6.5kg中添加2%鹽酸25L(pH值為1.0、25kg)，調製包含約16質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，於70℃下實施水解3小時(液相分解步驟)。進一步，將包含所得之水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或 Sepabeads，三菱化學製)，以水8L在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%的氫氧化鈉水溶液2kg，將pH值調製在4.0以上且6.5以下。將所得之溶液(玻尿酸之濃度：12質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出)進行凍結乾燥使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸4.5kg(收率約90%)。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測定時，約為1萬。
<實施例6：玻尿酸之調製>
於裝備攪拌機以及加熱套之200L容槽中，加滿8%鹽酸14L(14kg)與乙醇53L，一邊攪拌，一邊加熱至液體溫度至70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸5kg置入容器中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇1.5kg濕潤狀態之原料玻尿酸)約6.5kg中添加2%鹽酸25L(pH值為1.0、25kg)，調製包含約16質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，於70℃下實施水解6小時(液相分解步驟)。進一步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)，以水8L在壓出的同時進行稀 釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%的氫氧化鈉水溶液2kg，將pH值調製在4.0以上且6.5以下。將所得之溶液(玻尿酸之濃度：12質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出)以凍結乾燥使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸4.5kg(收率約90%)。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測定時，約為1萬。
<實施例7：玻尿酸之調製>
除了將在實施例3中主要去除樹脂後所得之溶液進行水加壓，且不經稀釋直接使用以外，其餘以相同之方法，得到包含22質量%之實施例7的玻尿酸之溶液。將此溶液噴霧乾燥，得到實施例7之玻尿酸。
更具體來說，在2L容量的燒杯中加滿8%鹽酸280mL(280g)與乙醇1L，一邊攪拌，一邊以熱水浴加熱使液體溫度成為70℃。溫度到達70℃後，一邊攪拌，一邊將平均分子量為30萬的出發原料玻尿酸50g置入燒杯中。一邊進行加熱使含有鹽酸的含水乙醇(pH0.2)之溫度維持在70℃，一邊攪拌使玻尿酸微粉末成為分散狀態，進行攪拌1小時(固相分解步驟)。接著，將含有鹽酸的含水乙醇以傾析去除後，於殘存的固形物(經乙醇10g濕潤狀態之原料玻尿酸)約60g中添加2%鹽酸150mL(pH值為1.0、150g)，調製包含約24質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值為 1.0)，於70℃下實施水解5小時(液相分解步驟)。進一步，將所得之包含水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads，三菱化學製)，以80篩網過濾器去除樹脂。添加25%氫氧化鈉水溶液20g，並將pH值調製成4.0以上且6.5以下。將所得之溶液(玻尿酸之濃度：22質量%，於此，玻尿酸之濃度是將出發原料玻尿酸之添加量當作玻尿酸之含量來算出。)以噴霧乾燥使其乾燥，得到白色微粉末之玻尿酸45g(收率：90%)。且，將固相分解步驟所得之原料玻尿酸的平均分子量以其他方法測定時，約為1萬。
<實施例8：玻尿酸之調製>
除了將實施例7中固相分解步驟所使用之乙醇換成甲醇以外，其餘以相同之方法，得到包含22質量%之實施例8的玻尿酸之溶液。將此溶液噴霧乾燥，得到實施例8之玻尿酸。
實施例8之玻尿酸在分子量、玻尿酸之純度、b值、容積密度、粒度分布(包含平均粒子徑以及粒子徑的標準偏差)、氯含量、二糖之比例、以及二糖、四糖、六糖、八糖之合計比例方面，與實施例7相同。
<比較例9：玻尿酸之調製>
將分子量為11萬之原料玻尿酸約5kg以乙醇1kg濕潤，並於裝備攪拌機以及加熱套的50L容槽中添加於2% 鹽酸25L(pH值為1.0、25kg)，調製包含約16質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)時，玻尿酸溶液變得非常高黏度，且無法攪拌。
<比較例10：玻尿酸之調製>
將分子量為11萬之原料玻尿酸約0.2kg以乙醇0.05kg濕潤，並於裝備攪拌機以及加熱套的50L容槽中添加於2%鹽酸25L(pH值為1.0、25kg)，調製包含0.8質量%之原料玻尿酸的酸性原料玻尿酸水溶液(pH值約為1)，將此在70℃下保持10小時，實施水解(液相分解步驟)。進一步，將包含所得之水解物的液體進行陰離子交換樹脂處理(商品名：DIAION或Sepabeads、三菱化學製)，以水8L在壓出的同時進行稀釋，並以80篩網過濾器將樹脂去除。添加25%的氫氧化鈉水溶液2kg，將pH值調製在4.0以上且6.5以下。將所得之溶液(玻尿酸之濃度：約0.6質量%，於此，玻尿酸的濃度是將原料玻尿酸的添加量當作玻尿酸的含量來算出)以噴霧乾燥(加熱器溫度：180℃)使其乾燥，變為霧狀，且無法回收玻尿酸。
與實施例1之玻尿酸同樣地測定實施例2至7以及比較例2至4、7以及8之玻尿酸的純度、b值、容積密度、粒度分布(包含平均粒子徑以及粒子徑之標準偏差)、氯含量、二糖的比例以及二糖、四糖、六糖、八糖的合計比例。將其結果表示於表1。且，測定實施例1至 8以及比較例2至4、7以及8之玻尿酸的氯含量以及硫含量時，皆為1質量%以下。
如表1所示，實施例1至7之玻尿酸，其容積密度較0.25g/cm3大，且粒子徑的不均較少，氯含量以及硫含量皆為1質量%以下，二糖的比例為1質量%以上且30質量%以下。且能夠理解實施例1至7之玻尿酸，其八糖的比例為1質量%以上30質量%以下，且二糖、四糖、六糖以及八糖的合計為5質量%以上80質量%以下。
且，分別將實施例1至7以及比較例2至4、7、8之200mg打錠並製作錠劑，比較打錠適性，此時實施例1至7之玻尿酸與比較例2至4、7、8之玻尿酸相比，結著力較高，打錠適性較高。尤其是含有氯含量較低的實施例3至7之玻尿酸之錠劑，打錠適性較高。且，含有平均粒子徑最小且粒子徑之標準偏差較小的實施例1、3以及7之玻尿酸之錠劑，粉末難以飄起，尤其是操作性也較優異。
<配合例1：美容液>
本配合例中，依照以下所記載之配方，調製配合有實施例1所得之玻尿酸的美容液(美白保濕精華液)。本配合例所使用之實施例1所得之玻尿酸具有適度的結著性，粉末難以飄起，在本配合例中製劑化較為容易。
玻尿酸(實施例1) 1.0%
水解玻尿酸 0.1%
1,3-丁二醇 5.0%
甘油 1.5%
POE去水山梨醇單硬脂酸酯 1.0%
去水山梨醇單硬脂酸酯 0.5%
三仙膠 0.2%
海藻酸鈉 0.2%
羧基乙烯聚合物 0.2%
氫氧化鉀 0.1%
橄欖油 0.2%
生育酚 0.1%
EDTA-2鈉 0.02%
左旋精胺酸 0.15%
甘草酸二鉀 0.05%
熊果素 0.2%
視網醇棕櫚酸 0.2%
苦參萃取物 0.2%
海藻萃取物 0.2%
傳明酸 0.1%
彈力蛋白 0.1%
膠原蛋白 0.1%
磷酸抗壞血酸鎂 0.1%
檸檬酸鈉 1.0%
檸檬酸 0.1%
對羥苯甲酸丙酯 0.1%
對羥苯甲酸甲酯 0.15%
香料 適量
純化水 殘量
<配合例2：軟膠囊>
本配合例中，依照以下所記載之配方，調製配合有實施例1所得之玻尿酸的軟膠囊。本配合例中所使用之實施例1所得之玻尿酸具有適度的結著性，對膠囊的充填率高，且本配合例中製劑化較為容易。
玻尿酸(實施例1) 20%
橄欖油 35%
蜂蠟 5%
中鏈脂肪酸三甘油酯 5%
明膠 25%
甘油 10%
<配合例3：散劑>
本配合例中，依照以下所記載之配方，調製配合有實施例1所得之玻尿酸的散劑(顆粒劑)。本配合例所使用之實施例1所得之玻尿酸具有適度的結著性，粉末難以飄起，且本配合例中製劑化較為容易。
玻尿酸(實施例1) 10%
乳糖 60%
玉米澱粉 25%
羥丙甲纖維素 5%
<配合例4：錠劑>
本配合例中，依照以下所記載之配方，調製配合有實施例1所得之玻尿酸的錠劑。本配合例所使用之實施例1所得之玻尿酸具有適度的結著性，打錠適性較優異，故本配合例中製劑化較為容易。
玻尿酸(實施例1) 25%
乳糖 24%
結晶纖維素 20%
玉米澱粉 15%
糊精 15%
二氧化矽 1%
<配合例5：果凍飲料>
本配合例中，依照以下所記載之配方，調製配合有實施例1所得之玻尿酸的有導管袋之白桃果凍飲料。本配合例所使用之實施例1所得之玻尿酸具有適度的結著性，粉末難以飄起，在本配合例中調製較為容易。
玻尿酸(實施例1) 0.20%
三仙膠 1.00%
紅藻膠 0.5%
糊精醇 3.0%
蔗糖素 1%
4倍濃縮白桃果汁 5.00%
檸檬酸 0.60%
檸檬酸鈉 0.20%
L-抗壞血酸 0.10%
水蜜桃香料 0.20%
純化水 殘量

Claims (5)

  1. 一種玻尿酸及/或其鹽之製造方法，其係包含下述步驟：調製包含低級醇、與平均分子量為3,500以上且5萬以下的原料玻尿酸及/或其鹽、與酸之酸性原料玻尿酸溶液之步驟、與在前述調製的步驟所得之前述酸性原料玻尿酸溶液中，將前述原料玻尿酸及/或其鹽酸水解，得到平均分子量為800以上且3,500以下之玻尿酸及/或其鹽之步驟、與將包含由前述酸水解所得的水解物之酸性溶液以陰離子交換樹脂處理之步驟、與使經前述樹脂處理的前述水解物噴霧乾燥或凍結乾燥之步驟，前述噴霧乾燥或凍結乾燥之步驟中玻尿酸溶液之濃度為8質量%以上且35質量%以下，前述酸性原料玻尿酸溶液包含15質量%以上且35質量%以下之前述原料玻尿酸及/或其鹽，且前述酸性原料玻尿酸溶液中包含相對於前述原料玻尿酸及/或其鹽100質量份為5質量份以上且60質量份以下之前述低級醇。
  2. 如請求項1之玻尿酸及/或其鹽之製造方法，其中，前述使其噴霧乾燥之步驟中包含：將包含前述水解物之液體噴霧乾燥之步驟，且相對於包含前述水解物之液體的質量，前述水解物的質量為8質量%以上且35質量%以下。
  3. 一種食品，其係包含如請求項1或2之製造方法所得之玻尿酸及/或其鹽。
  4. 一種化妝料，其係包含如請求項1或2之製造方法所得之玻尿酸及/或其鹽。
  5. 一種醫藥品，其係包含如請求項1或2之製造方法所得之玻尿酸及/或其鹽。
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