JPH01265970A - ヒアルロン酸を含有させたコラーゲン水溶液又は水分散液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒアルロン酸を含有したコラーゲン水溶液又は
水分散液に関する。本水溶液又は水分散液は体内注入用
として使用が可能であり、例えば交通事故や手術などの
結果により欠損した組織を切開することなく充填するた
め、すなわち軟組織陥凹部補正修復剤として用いること
ができる。

［従来の技術］ コラーゲンは動物の皮膚、血管、角膜、股、骨、歯など
に多く分布する蛋白質であり、分子量が約３０万、３本
のポリペプチド鎖からなる螺旋構造を有している。分子
の長さは約３０００人、直径が約１５人の棒状である。

コラーゲンの用途は現在医療分野の多岐にわたっており
、精製されたコラーゲンが局所止血剤、人工皮膚、人工
鼓膜、コンタクトレンズなどに利用されている。

コラーゲンは又交通事故や手術などの結果欠損した組織
に注入充填して線維芽細胞等による組織の修復を促進す
るために用いることができる。かかる体内注入用コラー
ゲンは、従来コラーゲン単独で用いられており、水溶液
タイプ（特公昭６２−３７０２０）、線維を形成させた
コラーゲンを水系に分散させたタイプ、線維形成後架橋
剤で架橋処理したコラーゲンを水系に分散させたタイプ
（特開昭５８−１７０７９６　、特願昭６１−２７３１
５６）などがある。

具体的には水溶液タイプとして高研アテロコラーゲンイ
ンブラント、線維化タイプとしてコラーゲンコーポレー
ションのザイダムＩ、■、架橋タイプとしてコラーゲン
コーポレーションのザイプラストが挙げられる。水溶液
タイプは注射針からの流動性は非常に良いが、体内に吸
収されやすくこれに伴い、抗原性に対しての懸念や（皮
肉テストを行った場合２〜３％の人に反応が見られ、反
応のなかった人に対して連続投与した場合さらに２〜３
％の人に反応が現れる）。皮膚の隆起効果を維持するた
めに注入を繰返す必要があった。架橋タイプは、吸収さ
れにくくなっているので抗原性の抑制と皮膚の隆起効果
維持の面で多少のメリットを持つが、残存する架橋剤の
毒性の他に流動性が水溶液タイプに比し劣り、水溶液タ
イプはどスムースな注入を行えない、などの問題点があ
った。

また線維化タイプは特性が両者の中間に位置するもので
、架橋剤による残存毒性を除き架橋タイプと同様のメリ
ット、デメリットを有するが、架橋タイプに比し吸収さ
れやすい。

一方、ヒアルロン酸は生体のあらゆる部分に存在する成
分でムコ多糖と称せられる物質の一種である。非常に大
きな直鎖状の高分子でその分子量は数十万から数百万に
及ぶとされている。ヒアルロン酸はＮ−アセチルグルコ
サミンとグルクロン酸とが結合した三糖の繰り返し連鎖
からなり、他のムコ多糖と異なり硫酸基を含ますムコ多
糖中で最も単純な構造が想定されている。

その水溶液は極めて特徴ある粘弾性を示し、保水力が絶
大で希薄な溶液でも粘稠なゲル状である。

また、どの様な結合組織にも共通した基質成分の一つで
あることから、結合ｍｌ内でのヒアルロン酸機能として
細胞間隙に水を保持する。そして、組織内にシェリー様
マトリックスを形成して細胞を保持したり、細胞間物質
の移動を制御したり、さらに外からの機械的衝撃とか細
菌感染を防止することが知られている。これらの性質を
医学的に応用しようという試みが古くからなされている
。

例えば、関節疾患の治療薬や眼科領域では、硝子体置換
剤として、その他皮膚創傷面の被膜剤などに応用されて
いる。また、この特有な保水性においては、ヒアルロン
酸分子が個々の分子を区別できない連続的な高重合性の
Ｎｅｔ−Ｗａｒｋを作るインタングルメントという現象
が寄与している。

又、ヒアルロン酸を共存させた特定のコラーゲン水溶液
については人工臓器１２　（１）　、　３２７−３３０
（１９８３）に記載がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者らは、体内注入用に使用された場合に隆起効果
を長期に亘り維持でき、抗原性のさらに低下したコラー
ゲン水溶液又は水分散液について種々検討した結果、化
学薬品ではなく生体になしみ易い生体成分であるヒアル
ロン酸を含有させたコラーゲン水溶液又は水分散液がこ
の課題を解決しうろことを見いだし、本発明を完成する
に至った。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明はｐＨが約６．５〜８．０および重量
浸透圧濃度が約２３０〜３２０ｍ　Ｏｓｍ／ＫｇＨｚ　
Ｏである、ヒアルロン酸を含有させたコラーゲン水溶液
又は水分散液を提供するものである。

本発明の目的物がヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液に
なるか又はヒアルロン酸含有コラーゲン水分散液になる
かは使用するコラーゲンによる。

コラーゲンとして水可溶性コラーゲンを用いる場合はヒ
アルロン酸含有コラーゲン水溶液となり、コラーゲンと
して線維を形成させたコラーゲン（以下線維化コラーゲ
ンという）又は線維形成後架橋剤で架橋処理したコラー
ゲン（以下架橋コラーゲンという）を用いる場合はヒア
ルロン酸含有コラーゲン水分散液となる。　水可溶性コ
ラーゲンとしては市販もしくは公知の水可溶性コラーゲ
ンを用いることができ、例えばコラーゲン含有材料（前
述の動物の皮膚、血管、角膜、股、骨、歯等）から希酸
で抽出した酸可溶性コラーゲンあるいは分子間架橋を伴
う不溶性コラーゲンをペプシンの様な蛋白質分解酵素で
処理し水可溶性としたアテロコラーゲンを用いる。特に
組織欠損を充填するためのコラーゲンは体内に注入する
ため抗原性の低い製剤が望まれるため、水可溶性コラー
ゲンのなかでも特に抗原となる部分が除かれたアテロコ
ラーゲンを使うことが好ましい。市販品としては前述の
高研アテロコラーゲンインブラント等があり好適に用い
ることができる。

線維化コラーゲンとしては市販もしくは公知の（例えば
特公昭６０−５４２８８に記載の）線維化コラーゲンを
用いることができる。例えば酸（例えば塩酸、硫酸等）
水溶液（例えばｐＨ３程度）に溶かしたコラーゲンを適
当なアルカリ水溶液（例えば水酸化ナトリウム水溶液）
でｐＨ４，５〜１１にするとコラーゲンが線維化して沈
澱する。これを集めて水洗し、必要なら乾燥することに
より線維化コラーゲンを得ることができる。又上記と同
様に酸水溶液に溶かしたコラーゲン溶液に濃い緩衝溶液
（リン酸緩衝液等）を入れて約５°Ｃ以下で中性とし、
ついで体温近くまで上昇するとコラーゲンが線維化して
（るのでこれを上記と同様に操作しても線維化コラーゲ
ンを得ることができる。線維化コラーゲンとしては抗原
性の観点から線維化アテロコラーゲンが好ましい。市販
品としては前述のコラーゲンコーポレーションのザイダ
ムＩ、ＩＩ等があり好適に用いることができる。　架橋
コラーゲンとしでは市販もしくは公知の（例えば特開昭
５８−７０７９６、特開昭６１−２７３１５６等に記載
の）架橋コラーゲンを用いることができる。例えば１％
程度の線維化コラーゲン水分散液にゲルタールアルデヒ
ド等を加えて室温で一夜攪拌すると架橋化されるのでこ
れを集めて水洗し、必要なら乾燥することにより架橋コ
ラーゲンを得ることができる。反応系は中性かアルカリ
性が望ましい。又、架橋剤としてヘキサメチレンジイソ
シアネートを用いる場合は上記アルカリ水溶液を用いて
線維化した線維化コラーゲンをメタノール、エタノール
等のアルコールに分散させ上記と同様に架橋させ、上記
と同様に操作しても架橋コラーゲンを得ることができる
。架橋コラーゲンとしては抗原性の観点から架橋アテロ
コラーゲンが好ましい。　　ヒアルロン酸は商業的にニ
ワトリの鶏冠、哺乳動物の眼球、関節液から調製される
他、ストレプトコッカス・ズーエピデミカスに代表され
る様なヒアルロン酸ヲ産生ずる微生物を培養することに
より得ることもできる。

本発明に利用できるヒアルロン酸の分子量は制限がなく
、数千から数百万までの分子量のヒアルロン酸を必要に
応じて使用できる。例えば、高分子量のものでは分子量
約３００万のものや、資生堂バイオヒアルロン酸（分子
量１６０万〜２００万）や、資生堂バイオヒアルロン酸
（分子量６５万〜１６０万）等を用いることができる。

また、数千から数十万の比較的低い分子量のヒアルロン
酸を使用する場合は必要に応じて所望の分子量の両分を
分取しても良いし、物理的な方法例えば、オートクレー
ブ処理等により高分子量ヒアルロン酸を低分子量に変換
して使用しても良い。

本発明のヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液又は水分散
液中の両成分の濃度、比率は広範囲に変化させることが
できる。本発明の効果を発揮させるには好ましくはヒア
ルロン酸濃度をｏ、ｏｉ〜１ｏ重量％及びコラーゲン濃
度を０．０１〜１０重量％、より好ましくはヒアルロン
酸濃度を０．０５〜１０重量％及びコラーゲン濃度を０
．１〜１０重量％、さらに好ましくはヒアルロン酸濃度
を０．０５〜５重量％及びコラーゲン濃度を０．５〜７
重量％、もっとも好ましくはヒアルロン酸濃度を０．１
〜２重量％及びコラーゲン濃度を１〜５重量％とする。

本発明のヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液又は水分散
液は交通事故、手術、外傷等により欠損した、ヒトや動
物の組織部位に注入するものであるので、生体条件に合
致したｐ）！、浸透圧を有している必要がある。この観
点から当該水溶液又は水分散液のｐ旧よ約６．５〜８．
０及び重量浸透圧濃度は約２３０〜３２０ｍ　Ｏｓｍ／
ＫｇＨｚＯであることが必要である。これらのｐＬ浸透
圧調整のためＫＨｚＰＯ４−ＫｚＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ
４−ＮａＪＰＯ４及び　ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＨ２Ｏ４
等のリン酸緩衝液をはじめとする緩衝液、グルコース等
の重量浸透圧濃度調節剤を用いることができる。

本発明のヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液もしくは水
分散液の調製は種々の方法によって行うことができる。

例えばヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液の調製の場合
、通常はコラーゲンを水溶液としヒアルロン酸水溶液と
混合する。この場合ｐＨ２浸透圧の調整は予め調整した
ちの同志を混合しても行ってもよく、又混合後行っても
よい。又、ヒアルロン酸とコラーゲンをはじめから１つ
の水溶液とし、ｐＨ，浸透圧の調整を行うことも可能で
ある。代表的調製例を示すと、まずｐＨ３，ｏ〜４．０
の酸性水溶液にコラーゲンを適当濃度に攪拌溶解し、つ
いでｐｎ及び浸透圧調整剤を添加してｐＨ６，５〜８．
０、重量浸透圧濃度２３０〜３２０ｍ　Ｏｓｍ／ＫｇＨ
ｚＯとする。−方、適当濃度のヒアルロン酸水溶液を開
−ｐＨ３同一重量浸透圧濃度に調整し、前記コラーゲン
溶液と混合する。

ヒアルロン酸含有コラーゲン水分散液の調製も上記ヒア
ルロン酸含有コラーゲン水溶液の調製に準じて行うこと
ができる。

本発明のヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液もしくは水
分散液は交通事故、手術、外傷等により欠損した、ヒト
や動物の組織部位に注入する、軟組織陥凹部補正修復剤
として用いることができるが、この水溶液もしくは水分
散液には必要に応じ他の添加剤、例えば、リドカイン等
の麻酔剤を添加することができる。その添加量は添加剤
の目的に沿い、かつ本発明の目的効果を損なわないこと
を条件に当業者が適宜決定することができる。例えば、
リドカイン等の麻酔剤にあってはその添加量は水溶液も
しくは水分散液中濃度として０．１〜１％（Ｗ／Ｖ）が
適当である。

本発明のヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液もしくは水
分散液は交通事故、手術、外傷等により欠損した、ヒト
や動物の組織部位、例えば手術後陥凹、創陥凹、にきび
痕、ボーランド病治療後陥凹、しわなどの陥凹部に陥凹
の大きさに応じて１回に０．０１〜１　ｍｌ注射器で注
入するが、１回で治療が完了しない場合は適宜回数をふ
やして（通常３日に１回〜１か月に１回）、完療するま
で注入を続ける。注入は通常水溶液タイプ及び線維化コ
ラーゲン分散液では皮肉、架橋コラーゲン分散液では皮
下に行う。

（実施例） 実施例　１ 高研アテロコラーゲンインブラント（２％、ｐＨ７，３
、重量浸透圧濃度２６０ｍ　Ｏｓｍ／にｇ）１．ｏ　）
を用意した。一方、ヒアルロン酸粉末（資生堂バイオヒ
アルロン酸）（分子量約８５万〜１６０万）２重量部に
Ｏ，１Ｍ　ＮａＨｚＰＯａ−ＮａｚＨＰＯａＷｋ衝液（
ｐ１４７．３）９８重量部を加えて充分混合し、ヒアル
ロン酸濃度２％、ｐＨ７，３、重量浸透圧濃度２６０ｍ
　Ｏｓｍ／ｋｇＨｚＯのヒアルロン酸水溶液を調製した
。ついで前記アテロコラーゲン水溶液５０重量部を前記
ヒアルロン酸水溶液５０重量部に加え、充分攪拌混合し
てアテロコラーゲン及びヒアルロン酸濃度各１％、ｐ）
１７．３　、重Ｎ浸透圧濃度２６０ｍ　Ｏｓｍ　／　Ｋ
ｇＨｚＯのヒアルロン酸含有アテロコラーゲン水溶液を
得た。

実施例　２ 新鮮な子牛の皮を精製水で十分洗浄し付着している汚れ
を落とした。７０％エタノールで消毒後、毛をそり、カ
ミソリで毛根部を残さないように皮の表面を削ぎ落とし
、裏面も同様に脂肪層等を除き無菌的に真皮層を得た。

これを細断し５％ＮａＣ１で洗浄後真皮１００ｇに対し
、注射用蒸留水４２を加えＩＮのＨＣＩでｐＨ３，０に
調整し、ペプシン０．２ｇを加えｐＨ３，０で３日間処
理し、コラーゲンを可溶化し、アテロコラーゲンとした
。この溶液をｐＨｌ０とし、ペプシンを失活後、等電点
沈澱法および、濾過により精製し、無菌でパイロジエン
フリーのアテロコラーゲンを得た。このアテロコラーゲ
ンを注射用萎留水およびＩＮのＩ（ＣＩでｐｕａ、ｏ　
、濃度６％に調製し、この溶液１００重量部にパイロジ
エンフリーの０．３　ＭＫＨｚｐｏ４−ＫｚＨｐｏ４Ｎ
″１衝液（ｐＨ７，５）を５０重量部加えて充分に混合
した。混合後の溶液はアテロコラーゲン濃度４％、ｐＨ
７，３、重量浸透圧濃度２８０ｍ０５ｍ／ＫｇＨｚＯで
あった。一方、同様にして、ヒアルロン酸粉末（分子量
約１６０万〜２００万）４重量部にＯ，１Ｍ　１ｈＨＰ
０４−Ｋｌｌ□ｐｏ４緩衝液（ｐＨ７，３）を９６重量
部加えて、ｐＨ７，３，２８０ｍ　Ｏｓｍ７Ｋｇ　）Ｉ
ｚＯのヒアルロン酸溶液を得た。このアテロコラーゲン
溶液５０重量部にこのヒアルロン酸溶液５０重量部を加
え、充分混合した。こうして、調製された溶液は、アテ
ロコラーゲン濃度２％、ヒアルロン酸濃度２％、ｐＨ７
，３で、重量浸透圧濃度は２８０ｍ　Ｏｓｍ７Ｋｇ　Ｈ
ｚＯであった。

実施例　３ 酸可溶性コラーゲン（高研セルゲンＩ−ＡＣ’）水溶液
（０，５％、ｐＨ３）９重量部ニ１．０ＭＫ２＋１Ｐ０
４−Ｋｌｌ□ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７，３）を１重量部加
えて、ｐＨ７，３重量浸透圧潰度２３０ｍ　Ｏｓｍ７Ｋ
ｇ　）１２０のｏ、４５％コラーゲン水溶液を得た。

一方、同様にして、ヒアルロン酸粉末（分子量約３００
万）　０．４５重量部ニ０．１　Ｍ　ＫＪＰＯ４−ＫＨ
ｚＰＯ４緩衝液（ｐＨ７，３）を　９９．５５重量部加
えてｐＨ７，３，２３０ｍ　Ｏｓｍ　２７Ｋｇ）ＩｚＯ
の０．４５％ヒアルロン酸水溶液を得た。

上記酸可溶性コラーゲン水溶液５０重量部に、上記ヒア
ルロン酸水溶液５０重量部を加えて、酸可溶性コラーゲ
ン濃度０．２２５％、ヒアルロン酸濃度０．２２５％、
ｐＨ７，３、重量浸透圧濃度２３０ｎ　Ｏｓｍ７Ｋｇ）
１２０の溶液を調製した。

実施例　４ 特公昭６０−５４２８８の方法に準じて、水分散液を調
製した。

コラーゲン物質及び方法 牛のアテロペプチドコラーゲン溶液の調製中の皮膚を軟
化させ、ＨＣｆ処理によって脱毛した。次に脱毛した皮
膚を粉砕し、ｐＨ２のＩ（Ｃｆ８〜１１ｇ／ｆの量で分
散させた。全蛋白質に対して０．１重量％のペプシンを
この水分散液に加え、混合物を１５〜２０°Ｃで約１０
０〜３００時間処理した。次に、ＮａＯＨを加えて、処
理媒体のｐＨを約１０に上げ、これによって消化を中止
させた。低いｐＨで沈澱法によって反応混合物から失活
（変性）酵素を取除いた。

次に、溶液を浄化し、濾過及びクロマトグラフィーによ
って濃縮して、牛のアテロペプチドコラーゲンの希塩酸
溶液５ｍｇ　／ｄ（ｐＨ３）を作った。

線維コラーゲンの調製 １８°Ｃでこの溶液に０．０２？１Ｎａ２ＨＰＯ４を加
えそのｐ）Ｉを７．４に上げて、この溶液から線維コラ
ーゲンを再構成した。析出沈澱した線維コラーゲンを上
澄液から分離し、濃縮してから、ＮａＣ４２及びＮａ、
ＩＩＰＯ。

を用い生理的ｐＨ（７，３）及びイオン強度まで均質化
した。得られた分散液のコラーゲン濃度は８％であった
。この時の重量浸透圧濃度は３００ｍ　Ｏｓｍ／ＫｇＨ
ｚＯであった。同様にして、ヒアルロン酸粉末（資生堂
バイオヒアルロン酸）（分子量約１６０万〜２００万）
より、８％ヒアルロン酸溶液ｐ）１７．３重量浸透圧潰
度３００ｍＯｓｍ　／ＫｇＨｚＯを調製し、上記コラー
ゲン分散液と等量均一になるまで攪拌混合させた。

ヒアルロン酸線維化コラーゲンをそれぞれ４％含み、ｐ
Ｈｌ７．３重量浸透圧潰度３００ｍ　Ｏｓｍ／ＫｇＨｚ
Ｏの分散液を得た。

実施例　５ 実施例２で得たアテロコラーゲン濃度２％ヒアルロン酸
濃度２％を含むｐＨ７，３重量浸透圧潰度２８０ｍ　Ｏ
ｓｍ／ＫｇｌｈＯの溶液を温度３７°Ｃに加温し、１時
間維持し、溶液をゲル化させた。このものを攪拌捧で攪
拌しヒアルロン酸を含有する、線維化したコラーゲンの
分散液を得ることができた。

実施例　６ アテロコラーゲン１重量部にＯ，１Ｍ　Ｋ、ＨＰＯ４−
ＫＨ□ｐｏ、緩衝液（ｐＨ７，３）を９９重量部加えて
ｐＨ７，３の１％コラーゲン溶液を得た。この溶液を３
５°Ｃに加温し２時間維持すると白濁し、ゲルが形成し
た。

グルタルアルデヒドのＫ２ＨＰＯ４−Ｋ２ＨＰＯ４で調
製した生理的リン酸塩緩衝剤溶液、ｐｉ（７，４０，４
重量％を１０ｍ用意しくグルタルアルデヒドを４０ｍｇ
含む）上記ゲルＬｏｇを加え、１時間反応させた。リン
酸塩緩衝剤で得られた架橋ゲルを繰返し洗浄してアルデ
ヒドを取除いた。

次にグルタルアルデヒドで架橋されたアテロコラーゲン
濃度が１５０ｍｇ／ｍｌ！になるまでゲルを遠心分離し
た。これに同じ＜　Ｋ２ＨＰＯ４−Ｋ）１２ＰＯ４緩衝
液（ｐＨ７，３）を用いて調製したヒアルロン酸（資生
堂バイオヒアルロン酸分子量１６０万〜２００万）の１
％溶液を等量刑え、ガラスホモジナイザーで処理し、混
合すると同時に架橋化されたコラーゲンの粒径を５０〜
１００μｍに粉砕した。この操作からグルタルアルデヒ
ドで架橋されたアテロコラーゲン濃度が７．５％ヒアル
ロン酸酸度が０．５％であるｐＨ７，３重量浸透圧潰度
３２０ＩＩ＋　Ｏｓｍ　／　ＫｇＨｚＯの混合分散液を
得ることができた。

実施例　７ 粉末の高研アテロコラーゲンをｐＨ３のパイロジエンフ
リー塩酸水に溶解させ、次いでＮａ０１１でｐＨを７．
０に調節して再構成線維アテロコラーゲンを沈澱させて
、分散液を得た。このアテロコラーゲンのアミン基を活
性化するためさらに分散液にＮ　ａ　ＯＩＩを加えてｐ
Ｈを１０．０に調整した。この水性分散液をエタノール
置換により脱水し、エタノール濃度が酒精度肝で９５度
以上を示すまで、エタノール置換を繰り返した。エタノ
ール中のコラーゲン濃度が１％の分散液を調製し、コラ
ーゲンＩｇ（乾燥重量）当り３００ｍｇのへキサメチレ
ンジイソシアナートを加え、２０°Ｃで２００時間反応
行った。反応後、分散液を過剰のエタノールで洗浄して
遊離のへキサメチレンジイソシアナートを除去した。次
いで、分散液のエタノールを水置換により除去し、遠心
分離によりコラーゲン濃度８０ｍｇ／　ｒｎｌｌまで濃
縮した。

次いで、この濃縮物をガラスホモジナイザーで処理して
、コラーゲンを粒径約５０〜１００μｍの粒子に粉砕し
た。この濃縮物に含まれたコラーゲンの架橋率をＴＮＢ
Ｓ法　（２，４，６−１−リニトロベンゼンスルホン酸
比色法）で測定したところ、６５％であった。粉砕処理
後の濃縮物にリン酸緩衝液Ｉ　ＭＮａｚＨＰＯ４−Ｎａ
Ｈ２ＰＯ４を加えて０．１ＭＮａＪＰＯ４−ＮａＨ２Ｐ
Ｏ４、ｐ！（７，０及び全コラーゲン濃度７０ｍｇ／　
ｒｎｌの分散液を得た。

一方ヒアルロン酸（資生堂バイオヒアルロン酸分子１１
８５万〜１６０万）の粉末をリン酸緩衝液０．１ＭＮａ
２ＨＰ０４−Ｎａｌ１２ＰＯ４に溶解させたｐＨ７，０
，７％の溶液を得た。

このヒアルロン酸溶液５０重量部とへキサメチレンジイ
ソシアナートで架橋したコラーゲン分散液５０重量部を
混合攪拌して、架橋したコラーゲン３．５％ヒアルロン
酸３．５％を含む混合分散液ｐＨ７，０重量浸透圧潰度
２８０ｍ　Ｏｓｍ／ＫｇＨｚＯを得た。

実施例　８ 実施例２に準じて緩衝液濃度０．１Ｍ（ＮａＨ２ＰＯ，
−Ｎａ２ＨＰ０４緩衝液）ｐＨ７，３、重量浸透圧濃度
３００ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２０の６％コラーゲン溶液を調
製した。

また、同様に実施例２に準じて、ｐＨ１重量浸透圧濃震
度コラーゲン溶液に等しいヒアルロン酸の１％、０．１
％、０．０２χの３種の溶液を調製した。

この３種のヒアルロン酸溶液５０重量部に対し、６χの
コラーゲン溶液を５０重量部を加え、充分混合した。こ
うして、 アテロコラーゲン濃度３％ヒアルロン酸度度０．５％９
１１７．３重量浸透圧濃度３００ｍＯｓｍ／ＫｇＨｚＯ
の溶液、アテロコラーゲン濃度３％ヒアルロン酸度度０
．０５％Ｐ１１７．３重量浸透圧濃度３００ｍＯｓｍ／
ＫｇＨ２０の溶液、アコロコラーゲン濃度３％ヒアルロ
ン酸１度ｏ、ｏｔ％ｐＨ７，３重量浸透圧濃度３００ｍ
Ｏｓｍ／ＫｇＨｚＯの溶液を得た。

それぞれの溶液を実際に皮肉に注入したところ期待した
とおり、皮膚の陥凹部を平坦に修復することができ体内
注入用コラーゲン溶液として都合の良いものであった。

〔発明の効果〕

本発明の効果を目的物がヒアルロン酸含有コラーゲン水
溶液の場合とヒアルロン酸含有コラーゲン水分散液の場
合で分けて説明する。

本発明のヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液は従来の体
内注入用コラーゲン水溶液（例えば特公昭６２−３７０
２０アテロコラーゲン水溶液およびその製造方法）と同
様に微細な注射針によっての注入が可能な流動性があり
、生体条件に平衡化されるとコラーゲン線維を再生する
。しかもヒアルロン酸を混合することにより線維形成速
度が速くなり、線維形成後の容積保持力（保水力）が向
上し、線維形成後のコラーゲンの溶出率が低下するなど
、コラーゲン単独の水溶液よりも物性面において好まし
い効果がもたらされる。さらに抗原性をおさえるという
良好な効果もある。また、この線維形成速度および容積
保持力は、コラーゲン水溶液およびヒアルロン酸の濃度
が高くなるに従って上昇するので各濃度の変化や、配合
比の変化によって種々の線維形成速度および容積保持力
を得ることが出来、目的に合った性質をもつ溶液が製造
出来るという特徴をもつ。

上記効果を体内に注入した場合に即して述べると組繊欠
損部修復に利用した場合、体内注入後、すみやかに線維
形成が起こり、周囲組織とのなじみがより向上し線維芽
細胞の進入が起こる。また細胞間の保水力の増大などに
伴い必要な体積を長期に渡り保持でき欠損部の隆起効果
が向上し注入回数を減らす事が可能である。その上、生
体内での吸収が遅くなるため抗原性がなく、架橋剤によ
る毒性の心配もない。

ヒアルロン酸を含有させた場合の効果を裏付けるため、
コラーゲン水溶１夜およびヒアルロン酸含有コラーゲン
水溶液の比較検討を行った。線維形成時間は、コラーゲ
ンおよびヒアルロン酸の濃度と混合比により異なるが、
混合することにより、線維形成を開始するまでの時間（
ラグタイム）が、短縮され線維形成速度が速くなり、体
内に注入してからの注入後の体内への吸収を抑える効果
があった。

また、例えば特公昭６２−３７０２０のコラーゲン２％
溶液と２％ヒアルロン酸？容：夜（コラーゲンと同緩衝
液使用）を等量混合し線維形成を行ってゲル化させる。

これを遠心分離し、分離された上澄の量および、上澄中
のコラーゲンの量を測定した。これもコラーゲンおよび
ヒアルロン酸の濃度と混合比により異なるが、この場合
、コラーゲン単独のものは全容量の７５．７％、混合液
からは、全容量の５０％の水分が分離され、コラーゲン
にヒアルロン酸を混合することにより、容積保持能力（
保水力）が向上した。上澄中のコラーゲン濃度は、コラ
ーゲン単独のものは、０．３４％で、混合液では、０．
１８％と低く、上澄中に溶出されにくいことがわかった
。

また、ラット皮下に投与し、３力月後にコラーゲンの抗
体反応を調べたところ、コラーゲン単独のものでは、わ
ずかながら、抗体反応が認められたが、混合液において
は、認められなかった。

上記の結果を要約すると、体内注入に使用した場合、す
みやかな線維形成が成されるとともに、組織欠損部の充
填に必要とされる容積保持の期間が長くなるため注入回
数を減らせることができる。

注入は、流動性に冨んでいるため、注射針からの流出も
スムースに行える。また体内に注入した時、体内吸収に
ともない起こり得る抗原性の問題が抑制され、もともと
生体物質であるため添加しても毒性の心配が全くな（、
生体注入用として非常に適している。また、線維形成速
度は、ヒアルロン酸の濃度およびコラーゲン濃度に依存
して速くなるため、各材料の濃度を変えたり、配合比を
変えるだけで線維形成速度を変化させる事が出来る。

そして、これに伴って保水力も変化してくるので必要に
応じ線維形成速度および保水力を変化させ、目的に合っ
た速度や保水力が選べるため従来の体内注入用アテロコ
ラーゲン水溶液にない多様性を持っている。

又、本発明のヒアルロン酸含をコラーゲン水溶液は、低
温下（例えば１０°Ｃ以下、特に２〜６°Ｃ）に保存す
る場合には線維形成を起こさず、生体温度で線維形成を
起こすので、体内注入用コラーゲン溶液として都合よい
ものである。又、この低温安定性はコラーゲン単独水溶
液よりも優れている。

なお、従来の技術の項で述べたごとく、ヒアルロン酸を
共存させたコラーゲン水溶液については人工臓器肥（１
）、３２７−３３０　（１９８３）に記載がある（３２
７頁右欄）。しかしながら、この水溶液のｐＨについて
は何ら示されておらず、又重量浸透圧濃度の調整は何ら
行っていない。又、当該文献に示された事項はコラーゲ
ン−ヒアルロン酸からなるマトリックスが血小板の粘着
を強く抑制し、又このマ）　ＩＪフックス上は線維芽細
胞の増殖が良好であること（要約）、及びコラーゲン線
維再構成にヒアルロン酸が殆ど影響を及ぼさないこと＜
３２８真中〜下段）である。しかしながら、はじめの２
つの効果は本発明の効果と関係なくまた３、つめの効果
は本発明の知見と相反する。

次にヒアルロン酸含有コラーゲン水分散液には線維化コ
ラーゲンを使用するものと架橋コラーゲンを使用するも
のとがある。線維化コラーゲン、架橋コラーゲンとも水
可溶性コラーゲンに比し、隆起効果、抗原性が改善され
ているが、ヒアルロン酸を併用することによってさらに
改善効果が高まる（試験例５，６．８）。架橋コラーゲ
ンタイプのヒアルロン酸含有コラーゲン水分散液ではさ
らに架橋剤による細胞毒性が改善される（試験例７）。

試験例　１ 実施例１で得たヒアルロン酸含有アテロコラーゲン水溶
液（ヒアルロン酸、アテロコラーゲン各１χ含有）を分
光光度計用セルに充填し脱気する。

これを３７°Ｃの水浴中にて２分間インキュベート後、
日立分光光度計１００−１０型にて波長４００ｎｍにお
ける吸光度を測定した。吸光度が平衡するまで２分間イ
ンキュベーションと吸光度測定を繰り返した。

このようにして線維形成速度を測定した結果を第１図に
示す。第１図において （Ａ）は混合、’ｆｆ１（１％アテロコラーゲン、１％
ヒアルロン酸最終濃度として）の場合を、（Ｂ）は単独
液（１％アテロコラーゲン）の場合を示す。

図において混合液は吸光度が平衡化に達するのに約２６
分を要している。一方単独液では約３倍の７６分を要し
ている。これらの結果は、線維形成の速度が単独液より
も混合液の方が約３倍の速さをもっているということを
示している。

また、上記のように調製したヒアルロン酸含有アテロコ
ラーゲン水溶液を共栓付の遠心管に充填し、３７°Ｃに
てインキュベートし、２４時間毎に１０．００Ｏｒｐｍ
にて３０分間遠心した。こうして分離された水分を容ｉ
ｎ少部分とみなすことで、容量保持率を測定した。その
結果を第２図に示す。第２図において （Ａ）は混合液（１％アテロコラーゲン、１％ヒアルロ
ン酸最終濃度）の場合を （Ｂ）は単独液（１％アテロコラーゲン）の場合を示す
。

７白目にて各法を比較すると、混合液は５０％の容量を
保持しているが、単独液は２４％しか容量を保持してい
ない。これらの結果は、ヒアルロン酸を混合すると保水
力が向上し、その結果容量保持力が高められることを示
す。

更に上記の容量保持率測定にて分離された上澄中に溶出
したコラーゲン量を測定した。これは上澄のヒドロキシ
プロリン量を測定することより求められた。その結果、
上澄に溶出されたコラーゲン量は（昆合液で３６．５ｍ
ｇ、単独液１０８．１ｍｇで、？容量率として、９．３
％および２６．１％となり混合液の方が約１／３の溶出
率であった。このことは、混合液では体内に注入した時
に隆起効果を助長させるばかりでなく、体内へのコラー
ゲン吸収が低下するため抗原性を少なくさせる効果があ
ることを示している。

以上を要約するに実施例１にて得られたヒアルロン酸含
有アテロコラーゲン水溶液は、線維形成が速く起こり、
容積保持力が増加され、抗原性が低下しており、体内注
入用コラーゲン溶液として都合のよいものであった。

試験例　２ 実施例１と準じて調製した、アテロコラーゲン濃度１％
、ヒアルロン酸濃度０．５％、ｐｌ＋７．３　、重量浸
透圧濃度２４０ｍ　Ｏｓｍ７Ｋｇ　Ｈ２Ｏのヒアルロン
酸含有アテロコラーゲン水溶液について、試験例１と同
様にして線維形成速度及び容量保持率を測定した。なお
、線維形成速度についてはさらに実施例１に準じて調製
した、アテロコラーゲン濃度１％、ヒアルロン酸濃度２
％、ｐＨ７，３、重量浸透圧濃度２７０ｍ　Ｏｓｍ／Ｋ
ｇＨ□０のヒアルロン酸含有アテロコラーゲン水溶液及
びアテロコラーゲン濃度２％、ヒアルロン酸濃度２％、
ρ１１７．３　、重量浸透圧濃度３２０ｍ　Ｏｓｍ７Ｋ
ｇ　ＨｚＯのヒアルロン酸含有アテロコラーゲン水溶液
についても測定した。

結果を第１図及び第２図に示す。図中（Ｃ）は０．５％
ヒアルロン酸含有１％アテロコラーゲン水溶液、（Ｄ）
は２％ヒアルロン酸含有１％アテロコラーゲン水溶液、
（Ｅ）は２％ヒアルロン酸含有２％アテロコラーゲン水
溶液の場合をそれぞれ表す。

試験例　３ 実施例２で得た２％ヒアルロン酸含有２％コラーゲン水
溶液をラット皮下に注入し、３目移ｆｌＪ１織を採取し
、抗ウシコラーゲン抗体を使用して注入部位を染色した
。ヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液ではコラーゲン単
独溶液に対し、顕微鏡下２．７倍の面積にわたり浸透し
ており、広い範囲に浸透させる効果が示された。

又、このヒアルロン酸含有アテロコラーゲン水溶液は、
４°Ｃ下にて線維形成を起こさず、生体条件に平衡化さ
れると線維形成を起こし、体内注入用コラーゲン溶液と
して都合のよいものであった。

試験例　４ 実施例３で得たヒアルロン酸含有酸可溶性コラーゲン水
溶液は４°Ｃ下にて線維形成を起こさず、生体条件に平
衡化されると線維形成を起こし、体内に注入用コラーゲ
ン水溶液として都合の良いものであった。

試験例　５ 種々のコラーゲン水溶液や水分散液を用いて、ラット皮
膚陥没の修復効果におけるヒアルロン酸の混合効果を確
認した。人為的にメスでラット背部の皮膚を切りとり、
自然治癒させ治癒部位に同程度の陥没の残ったラットを
４０頭用意した。う・ントを５頭ずつ、Ａ群からＨ群に
わけ１週間毎に陥没が平坦に維持されるまで、Ａ−Ｄ群
では１回あたり０．０３ｄの水溶液又は水分散液を皮肉
に、又Ｅ−Ｈ群では１回あたり０．０５ｄの水分散液を
皮下に注入した。ただし、６回注入しても平坦に維持さ
れない場合実験をうちきった。

要した注入回数 Ａ　　Ｂ　　ＣＤ　　Ｅ　　Ｆ　　Ｇ　　Ｈ平均２．６
５．６１．２３．０１．０１．０１．０１．２上記から
明らかなごとく水溶液タイプ及び線維化タイプではヒア
ルロン酸を混合することにより治療のための注入回数を
減らすことができた。

架橋化したものについては、はとんどの検体が１回の注
入で１０週間陥没が隆起状態に維持されたため、ヒアル
ロン酸の混合効果を確認するため、さらに観察を続けた
。その結果　Ｆ群では１６週口重Ｈ群では１５週ロー盛
り上がりが消失したのに対しヒアルロン酸を混合したＦ
群、０群は２０週ローも隆起状態を維持していた。

Ａ−Ｈ群に注入した水溶液又は水分散液は以下の表の通
りである。

試験例　６ 生体内での容量保持性を示す尺度として、菌由来のコラ
ゲナーゼを用いて、試験例５で使用したコラーゲン水溶
液又は水分散液の分解率を測定した。

このことよりヒアルロン酸を混合するとコラーゲン分解
酵素に対する安定性が増し、生体内での容量保持性も高
いことがわかる。

試験例　７ 狙胞皇ユ■筋 ヒト線維芽細胞のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養試験を行った。培養皿に各種コラーゲ
ン液を塗布し、風乾後に培養皿１枚につき１×１０５個
の細胞を播いて７日間培養し、細胞数を数え、細胞形態
の観察を行った。参考のため、全くコラーゲンを塗布し
ない培養皿を用いた試験も行った。用いたアテロコラー
ゲンの種類及び結果を次表に示した。

以上の結果よりヒアルロン酸を混合すると本来毒性を持
つ様な例えばゲルタールアルデヒド架橋コラーゲン等の
毒性を抑制することが確認された。

試験例　８ コラーゲンを化学的に架橋することによって牛コラーゲ
ンのもつ抗原性がある程度低下することは知られている
がヒアルロン酸を加えるとさらに抗原性が低下すること
を実証する。

各製剤につきラットを２０頭用意し、各製剤で感作誘導
を行った。ラットの感受性を高めるためには、アジュバ
ントを使用した。

３週間後、感作誘導に使用した製剤を注入し、感作を誘
発した。

２４時間後、注入部位に赤斑が現れたものの数を測定し
た。

この結果よりどの様なコラーゲン溶液、分散液について
もヒアルロン酸を混合することにより、抗原性を低下さ
せることが確認された。

次に各請求項ごとの効果について述べる。

請求項１のヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液又は水分
散液はヒアルロン酸を含有しないものに比し欠損陥凹部
の隆起効果、抗原性において優れている。

請求項２では請求項１の効果がさらに明確となる。

請求項３のヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液はコラー
ゲン単独水溶液に比し、隆起効果、抗原性の点で優れて
いる他、線維形成速度の調整がより容易で、かつ低温安
定性がより優れている。

請求項４のヒアルロン酸含有線維化コラーゲン水分散液
は線維化コラーゲン単独水分散液に比し、隆起効果、抗
原性の点で優れている。

請求項５のヒアルロン酸含有架橋コラーゲン水分散液は
架橋コラーゲン単独水分散液に比し、隆起効果、抗原性
の点で優れている。

請求項６の軟組織陥凹部補正修復剤はコラーゲン単独水
溶液又は水分散液に比し、少なくとも隆起効果、抗原性
の点で優れている。

【図面の簡単な説明】

第１図は種々の濃度、相互比率のヒアルロン酸含有アテ
ロコラーゲン水溶液及びアテロコラーゲン単独水溶液の
生体条件下におけるコラーゲン線維形成速度についての
比較を示す。 第２図は種々の濃度、相互比率のヒアルロン酸含有アテ
ロコラーゲン水溶液及びアテロコラーゲン単独水溶液の
遠心後の容量保持率についての比較を示す。 第１．２図中（Ａ）は１％ヒアルロン酸含有１％アテロ
コラーゲン水溶液、（Ｂ）は１％アテロコラーゲン水溶
液、（Ｃ）は０．５％ヒアルロン酸含有１％アテロコラ
ーゲン水溶液、（Ｄ）は２％ヒアルロン酸含有１％アテ
ロコラーゲン水溶液及び（Ｅ）は２％ヒアルロン酸含有
２％アテロコラーゲン水溶液の場合をそれぞれ表す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ｐＨが約６．５〜８．０及び重量浸透圧濃度が約２
   ３０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ＿２Ｏである、ヒアルロ
   ン酸を含有させたコラーゲン水溶液又は水分散液。 ２　ヒアルロン酸０．０１〜１０重量％およびコラーゲ
   ン０．０１〜１０重量％を含有させた請求項１記載のヒ
   アルロン酸含有コラーゲン水溶液又は水分散液。 ３　コラーゲンがアテロコラーゲンである請求項１又は
   ２記載のヒアルロン酸含有コラーゲン水溶液又は水分散
   液。 ４　コラーゲンが線維化コラーゲンである請求項１又は
   ２記載のヒアルロン酸含有コラーゲン水分散液。 ５　線維化コラーゲンが線維化アテロコラーゲンである
   請求項４記載のヒアルロン酸含有コラーゲン水分散液。 ６　コラーゲンが架橋コラーゲンである請求項１又は２
   記載のヒアルロン酸含有コラーゲン水分散液。 ７　架橋コラーゲンが架橋アテロコラーゲンである請求
   項６記載のヒアルロン酸含有コラーゲン水分散液。 ８　請求項１〜７いずれにか記載のコラーゲン水溶液又
   は水分散液からなる軟組織陥凹部補正修復剤。