CN117122737A - 一种可注射组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可注射组合物及其制备方法，属于生物技术领域。本发明的组合物，不含交联剂，具有较好的生物相容性和安全性，可以用于美容塑形等。

Description

一种可注射组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种可注射组合物及其制备方法，具体涉及透明质酸和胶原蛋白的组合物及其制备方法，属于生物工程领域。

背景技术

透明质酸，其广泛分布于人体的结缔组织、上皮组织和神经组织中。透明质酸在皮肤中含量丰富，它可确保良好的水合作用，协助细胞外基质的组织，充当空间填充物；并参与组织修复。然而，随着年龄的增长，皮肤中存在的透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白和其他基质聚合物的数量会减少。例如，反复暴露在来自太阳的紫外线下会导致真皮细胞减少其透明质酸的产生并增加其降解速度。这种透明质酸的损失会导致各种皮肤状况，例如皮肤干燥、皱纹、瑕疵、缺陷、皮肤厚度减少缺乏弹性等。

胶原蛋白存在于人体皮肤和韧带等部位，是哺乳动物中含量最多的蛋白，占人体蛋白的1/3，是细胞外基质的主要成分，能够控制细胞的生长分化。随着时间的推移，和/或暴露于紫外线，酒精以及老化等过程，人体内的胶原蛋白成分可能会丢失；皮肤中的胶原蛋白减少，会导致皮肤失去弹性、皮肤厚度减少、形成皱纹和下垂等衰老现象出现。

皮肤会随时间推移而发生老化，并且会因多种因素而加剧。

将可吸收生物材料(填充物)注射于人体某部位包括皮肤，以改善、修饰皮肤皱纹、软组织缺陷、轮廓从而改善局部或整体形态等，是使人年轻化的常进行的操作；其具有操作方便、延缓衰老和美容效果明显、恢复期短等优点，已经被广泛应用于临床。

基于透明质酸的填充物，常用于美容皮肤病学实践中，其具有极好的安全性，但其易于被酶降解而清除，故常采用化学交联或其他方式以延长其填充物在体内的停留时间，但化学交联需引入交联剂，易导致因交联剂发生/存在毒性，而且透明质酸是透明的，注射后易出现“丁达尔现象”，导致注射部位颜色异常明显，透明质酸还因为其吸水能力而易导致注射部位发生肿胀。

胶原蛋白可生物降解，具有良好的生物相容性，可作为医学组织工程的主要生物材料应用于人造皮肤、人造血管、填充修复等领域。胶原蛋白因其不透明性，不会在注射部位发生“丁达尔现象”，且可以帮助胶原蛋白增长，已经被应用于皮肤填充方面，但纯胶原蛋白水凝胶的力学性能差，降解快，持续时间较短，应用受限。

故如果将透明质酸和胶原蛋白结合使用，获得既具有较好的注射性，又能够在体内发挥控制细胞生长分化和填充支撑，延迟降解等作用的凝胶，则将可以解决目前存在的不足，更好地满足需求。

因此，开发一种更加安全有效、注射性好使用方便具有控制细胞生长分化、帮助胶原蛋白增长和填充支撑等多种作用的胶原蛋白组合物，具有极大的研究价值和是临床应用迫切需要和期望的。

发明内容

基于目前存在的问题和需求，本发明提供了一种组合物，其不使用化学交联剂，可避免交联试剂残留影响，可集合更好地发挥透明质酸和胶原蛋白的优势而又避免其缺点，具有高粘弹性，抗酶降解性，高生物相容性和安全性，能够发挥控制细胞生长分化，帮助胶原蛋白再生和填充支撑等多种作用，且其制备工艺简单；所述组合物可以用于人体外形修复、再塑或皮肤护理等。

由此，本发明提供一种组合物，其包括：透明质酸类物质，胶原蛋白和水；所述透明质酸类物质包括交联的透明质酸类物质和游离的透明质酸类物质；其中，所述胶原蛋白至少部分与透明质酸类物质物理交联。

根据本发明，所述透明质酸类物质可以为透明质酸，透明质酸钠，透明质酸锌和透明质酸钙中的一种或多种。在一些实施方式中，所述透明质酸类物质为透明质酸钠。在一些实施方式中，所述透明质酸类物质为透明质酸锌。

根据本发明，所述组合物中，至少部分胶原蛋白与透明质酸类物质物理交联，和/或至少部分胶原蛋白与游离的透明质酸类物质之间形成物理交联。

根据本发明，所述的物理交联的形成，可以包括冷冻或其他适宜的方式。在一些实施方式中，所述的物理交联的形成，包括在-30℃～-20℃冷冻3天-14天，然后在20℃～30℃条件下融解。在一些实施方式中，所述的物理交联的形成，包括透明质酸类物质，胶原蛋白，缓冲盐和水的混合溶液在-30℃～-20℃冷冻3天-14天，然后在20℃～30℃条件下融解。

所述组合物中，基于组合物的总体积，所述透明质酸类物质的含量可以为5mg/mL-30mg/mL。在一些实施方式中，所述组合物中，基于组合物的总体积，所述透明质酸类物质的含量为10mg/mL-20mg/mL，有利于充分发挥填充和营养皮肤、抵抗衰老的作用。在一些实施方式中，所述组合物中，基于组合物的总体积，所述透明质酸类物质的含量为5mg/mL-10mg/mL，有利于充分发挥营养皮肤和抵抗衰老的作用。

根据本发明的实施例，所述组合物中，基于质量比计算，游离的透明质酸类物质的量不低于透明质酸类物质总量的5％，和/或游离的透明质酸类物质的量不高于透明质酸类物质总量的40％。

在一些实施方式中，所述组合物中，基于质量比计算，游离的透明质酸类物质的量不高于透明质酸类物质总量的10％。在一些实施方式中，所述组合物中，基于质量比计算，游离的透明质酸类物质的量不高于透明质酸类物质总量的35％。在一些实施方式中，所述组合物中，基于质量比计算，游离的透明质酸类物质的量不高于透明质酸类物质总量的30％。

在一些实施方式中，所述组合物中，基于质量比计算，游离的透明质酸类物质的量为透明质酸类物质总量的5％-10％。

在一些实施方式中，所述组合物中，基于质量比计算，游离的透明质酸类物质的量为透明质酸类物质总量的5％-40％。在一些实施方式中，所述组合物中，基于质量比计算，游离的透明质酸类物质的量为透明质酸类物质总量的5％-30％。在一些实施方式中，所述组合物中，基于质量比计算，游离的透明质酸类物质的量为透明质酸类物质总量的15％-40％。在一些实施方式中，所述组合物中，基于质量比计算，游离的透明质酸类物质的量为透明质酸类物质总量的20％-40％。

上述比例范围的游离的透明质酸类物质和交联的透明质酸类物质，及至少部分胶原蛋白与透明质酸类物质交联的条件，能够使所述组合物既具有较好的流动性，又具有适宜的粘弹性，有利于组合物注射使用，及发挥刺激细胞增殖，填充和支撑等作用。

所述透明质酸类物质的分子量可以为150万道尔顿-300万道尔顿。在一些实施方式中，所述透明质酸类物质的分子量为180万道尔顿-280万道尔顿。在一些实施方式中，所述透明质酸类物质的分子量为200万道尔顿-260万道尔顿。在此分子量范围的透明质酸类物质，有利于组合物的抗酶解性能和发挥刺激细胞增殖，填充和支持作用；透明质酸类物质分子量过高，则难以溶解和形成所述特性的组合物，过低，不利于形成所述特性的组合物。

所述组合物中，基于组合物的总体积，所述胶原蛋白的含量可以为2mg/mL-15mg/mL。在一些实施方式中，基于组合物的总体积，所述胶原蛋白的含量可以为3mg/mL-10mg/mL。在一些实施方式中，基于组合物的总体积，所述胶原蛋白的含量为4mg/mL，5mg/mL，6mg/mL，7mg/mL，或7.5mg/mL。

根据本发明，所述胶原蛋白可以为提取自牛、牦牛或猪的胶原蛋白，分子量不低于15万道尔顿。在一些实施方式中，所述胶原蛋白的分子量不低于20万道尔顿。在一些实施方式中，所述胶原蛋白的分子量为25万道尔顿-50万道尔顿。在一些实施方式中，所述胶原蛋白的分子量为30万道尔顿-40万道尔顿。

所述组合物中，基于胶原蛋白的总质量计算，至少60％的胶原蛋白具有三螺旋结构，可与细胞表面的整合素等受体相互作用，参与细胞外基质与细胞内信号传导的调节，影响细胞的增殖、分化和凋亡等，具有较强的生物活性，这样的胶原蛋白与透明质酸类物质形成的本发明的所述组合物，其同时具有相对更高的力学性能、机械性能及耐降解性能等特性。在一些实施方式中，所述组合物中，基于胶原蛋白的总质量计算，80％或90％或95％或99％的胶原蛋白具有三螺旋结构，有利于提升组合物的粘弹性、耐酶解性能、机械性能等。

根据本发明的实施例，所述透明质酸类物质与所述胶原蛋白的质量比可以为(5:1)-(0.5:1)。在一些实施方式中，所述透明质酸类物质与所述胶原蛋白的质量比为(4:1)-(1:1)，有利于得到发挥作用更好的海绵或凝胶，有利于刺激促进细胞增殖。在一些实施方式中，所述透明质酸类物质与所述胶原蛋白的质量比为4:3，有利于刺激促进细胞增殖和降低肿胀等不良作用。

所述组合物还含有缓冲盐。所述缓冲盐包括磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钾和氯化钠中的至少一种。

上述缓冲盐，可以使所述组合物具有适宜注射使用的pH值和/或适宜的渗透压，从而利于组合物使用。

根据本发明，所述组合物的pH可以为6.0-7.6。在一些实施方式中所述组合物的pH优选为6.5-7.6。在一些实施方式中所述组合物的pH为6.8，7.0，7.2或7.4。

根据本发明，所述组合物的渗透压在200mOsmol/kg-400mOsmol/kg，优选在250mOsmol/kg-350mOsmol/kg。

在一些实施方式中，所述组合物，基本上由交联的透明质酸类物质，游离的透明质酸类物质，胶原蛋白，缓冲盐和水组成。

根据本发明，在一些实施方式中，所述组合物可以注射使用，其可以注射到人体组织中，改善人体外观或改善老化导致的不健康或疾病状态，如作为填充剂，用于填充皮肤、软组织的凹陷、体积不足等缺陷，或者用于修整面部大小不对称，或者用于塑造面部和其他部位的轮廓，或者用于改善、抚平皮肤的干燥、细纹等。

根据本发明，在一些实施方式中，所述组合物可以外用，或作为基质，与其他成分，如可外用的或可注射使用的药物活性成分，氨基酸，或寡肽等组合使用。

根据本发明，所述组合物，可以为海绵形式，也可以为凝胶形式。

在一些实施方式中，所述组合物，使用27G针头注射时平均推挤力不超过40N(牛顿)。在一些实施方式中，所述组合物为凝胶形式，具有极好的注射性，使用27G针头注射时平均推挤力不超过20N。在一些实施方式中，所述组合物，可以使用30G针头注射，平均推挤力不超过30N。

根据本发明，在一些实施方式中，所述组合物为海绵形式，可以作为敷料，用于伤口愈合，或者作为屏障防粘连，或者作为填充物，用于有需要的部位。

根据本发明的实施例，所述组合物中，至少部分透明质酸类物质之间形成了物理交联，并且，至少部分胶原蛋白与部分透明质酸类物质之间也形成了物理交联。所述组合物，既含有物理交联的交联透明质酸类物质，物理交联的透明质酸类物质-胶原蛋白，又含有游离的透明质酸类物质，可以改善组合物的抗酶降解性，有利于延长组合物的作用时间，提升组合物的不透明度，减少注射入皮下后的丁达尔现象，使用于皮肤、软组织后有利于组织沉积胶原蛋白，刺激、促进自体胶原蛋白再生。本发明提供的组合物，可通过注射器注射到体内，发挥填充、营养皮肤和抵抗衰老的作用，具有较好的耐酶降解性，粘弹特性等力学性能，有利于细胞的黏附、增殖，抵抗改善衰老状态。

在一些实施方式中，基于质量比计算，至少1％的胶原蛋白与透明质酸类物质物理交联。在一些实施方式中，基于质量比计算，至少5％的胶原蛋白与透明质酸类物质物理交联。在一些实施方式中，基于质量比计算，至少10％的胶原蛋白与透明质酸类物质物理交联。在一些实施方式中，基于质量比计算，至少15％的胶原蛋白与透明质酸类物质物理交联。在一些实施方式中，基于质量比计算，至少20％，或至少25％，或至少30％的胶原蛋白与透明质酸类物质物理交联。在一些实施方式中，基于质量比计算，至少35％，或至少40％，或至少50％的胶原蛋白与透明质酸类物质物理交联。在一些实施方式中，基于质量比计算，至少55％，或至少60％，或至少70％的胶原蛋白与透明质酸类物质物理交联。

另一方面，本发明还提供了制备所述组合物的方法。

一种制备前述组合物的方法，包括以下步骤：

1)分别获得透明质酸类物质的水溶液和胶原蛋白的水溶液；

2)将透明质酸类物质的水溶液调节pH至1.5或其以下，任选地除去气泡，然后在0℃～10℃条件下，与胶原蛋白的水溶液混合，再调节pH至1.5或其以下，得到酸性混合液；

3)将所得的酸性混合液在-30℃～-20℃冷冻3天-14天，然后在20℃～30℃条件下融解，得到透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶；

4)将所得透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶转移到透析袋中并置于缓冲盐的水溶液中，透析至透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶pH为6.0-7.6；或将所得透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶加入缓冲盐的水溶液中浸泡至透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶pH为6.0-7.6；取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶，得到所述组合物；

任选地，将所述组合物进行灭菌。

所述步骤1中，使用的胶原蛋白可以为固体形式，也可以为溶液形式。

所述步骤2中，可以使用盐酸调节pH。所述步骤2中，可以调节pH至1.2-1.5，得到海绵形式组合物；可以调节pH至1.2以下，得到凝胶形式组合物。一些实施方式中，所述步骤2中，调节pH至1.1或其以下，得到凝胶组合物。一些实施方式中，所述步骤2中，调节pH至不超过1.1，1.0或0.9，得到凝胶形式组合物。

所述步骤3中，冷冻的时间优选为3天-12天。

所述步骤3中，融解时间可以为4h(小时)-10h，或者5h-8h。

所述步骤4中，可以通过具有1000道尔顿至约10000道尔顿的分子量截止值的膜进行透析。

所述步骤4中，可以将海绵或凝胶透析或浸泡至pH为6.5-7.6，或者6.8-7.4，或7.0，或7.2。

所述灭菌可以采用：干热灭菌，蒸汽热灭菌，湿热灭菌，辐照(β射线、γ射线或x射线灭菌，或电磁(电子束)灭菌。

在一些实施方式中，所述灭菌采用辐照灭菌。在一些实施方式中，采用钴60以不超过15KGy的辐照剂量在-30℃～0℃进行辐照灭菌。

在一些实施方式中，通过干热灭菌，蒸汽热灭菌，湿热灭菌或辐照灭菌将海绵形式组合物转变为凝胶形式组合物。在一些实施方式中，采用钴60以超过15KGy的辐照剂量在-30℃～0℃进行辐照灭菌，将海绵形式组合物转变为凝胶形式组合物。

在一些实施方式中，通过无菌生产条件，制备得到所述组合物。

在一些实施方式中，一种制备前述组合物的方法，包括以下步骤：

1)分别获得透明质酸类物质的水溶液和胶原蛋白的水溶液；

2)将透明质酸类物质的水溶液调节pH至1.2以下，任选地除去气泡，然后在0℃～5℃条件下，与胶原蛋白的水溶液混合，再调节pH至1.2以下，得到酸性混合液；

3)将所得的酸性混合液在-30℃～-20℃冷冻3天-12天，然后在20℃～25℃条件下融解，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶；

4)将所得透明质酸-胶原蛋白凝胶加入到缓冲盐的水溶液中浸泡至透明质酸-胶原蛋白凝胶的pH为

6.0-7.6，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白凝胶；

任选地，将所得中性透明质酸-胶原蛋白凝胶灭菌，得到所述组合物。

在一些实施方式中，一种前述组合物的制备方法，包括以下步骤：在无菌生产条件下，采用无菌原料，1)分别获得透明质酸的水溶液和胶原蛋白的水溶液；

2)将透明质酸的水溶液调节pH至1.5或其以下，任选地除去气泡，然后在0℃～5℃条件下，与胶原蛋白的水溶液混合，再调节pH至1.5或其以下，得到酸性混合液；

3)将所得的酸性混合液在-30℃～-20℃冷冻3天-12天，然后在20℃～25℃条件下融解，得到透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶；

4)将所得透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶加入到缓冲盐的水溶液中浸泡至透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶的pH为6.0-7.6，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶，得到所述组合物。

在一些实施方式中，一种前述组合物的制备方法，包括以下步骤：在无菌生产条件下，采用无菌原料，采用无菌原料，

1)分别获得透明质酸类物质的水溶液和胶原蛋白的水溶液；

2)将透明质酸类物质的水溶液调节pH至1.2以下(即低于1.2)，任选地除去气泡，然后在0℃～5℃条件下，与胶原蛋白的水溶液混合，再调节pH至1.2以下，得到酸性混合液；

3)将所得的酸性混合液在-30℃～-20℃冷冻3天-12天，然后在20℃～25℃条件下融解，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶；

4)将所得透明质酸-胶原蛋白凝胶加入到缓冲盐的水溶液中浸泡至透明质酸-胶原蛋白凝胶的pH为

6.0-7.6，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，即得到所述组合物。

本发明的方法，采用一次冻融的方式，有助于得到适宜注射的和具有合适粘弹性的组合物。

根据本发明，为了得到适宜大小的海绵形式组合物，可以将所述海绵形式组合物进行剪切、粉碎等操作，以使其成为适宜大小的海绵形式组合物，从而可以注射使用或达到适于使用的大小。在一些实施方式中，将所述海绵形式的组合物粉碎成为平均粒径为20微米-100微米的组合物。

本发明提供的方法，通过控制各个步骤及其相关条件，使获得的组合物具有特殊的交联结构，组合物中，透明质酸或其盐之间形成交联，并且有胶原蛋白与透明质酸或其盐之间形成交联，从而形成复杂的交联网络和体系，从而组合物具有相对更优的性能；所述方法具有可操作性和可控性，可以用于生产。

具体实施方式

术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

本发明中，“由以下组分组成”或“基本上由以下组分组成”表示还可以含有不可避免的杂质和/或水。

本发明中，任选表示可以有也可以没有。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“一些实施方式”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

本发明中，物理交联指通过非化学键的相互作用(如氢键、范德华力、静电等)而形成的交联。

本发明种，使用“透明质酸类物质”这一术语来表示游离的透明质酸类物质和/或交联的透明质酸类物质；其中游离是相对交联来说，“透明质酸类物质”可以是透明质酸，透明质酸钠，透明质酸锌和透明质酸钙中的一种或多种。

本发明中，室温为环境温度，在20℃～30℃，或者22℃～28℃，或者25℃。

本发明中，透明质酸类物质的分子量以粘均分子量计。

组合物中，透明质酸类物质的浓度/含量基于透明质酸或透明质酸的盐的总质量计算，如样品中是含透明质酸则以透明质酸计算，如样品中是含透明质酸钠，则以透明质酸钠计算，如样品中是含有透明质酸和透明质酸钠，则以二者总量计算。

以下实施例中，使用牛源的胶原蛋白，具有三螺旋结构；如果使用透析，则4小时-5小时更换一次透析液；如果使用浸泡，则间隔2小时-3小时更换一次浸泡液；透析所使用的透析袋截留分子量为1万；磷酸盐缓冲液或PBS缓冲液为0.01mol/L，pH＝7.0或7.2，采用磷酸氢二钠，磷酸二氢钠和氯化钠配制获得。

预实验例：

室温条件下，机械搅拌，将1072mg透明质酸钠(HA，分子量为240万道尔顿)溶于80mL超纯水中，得到透明质酸钠溶液；4℃条件下，磁力搅拌，将125mg胶原蛋白(分子量为30万Da)溶解于12.5mL超纯水中，得到胶原蛋白溶液；

取透明质酸钠溶液7.5g，用0.1mol/L的盐酸溶液调节pH至3.5，然后降温至4℃，加入胶原蛋白溶液2.5g，搅拌，发现出现少量白色丝状物质，持续搅拌2小时，仍然存在白色丝状物质；

取透明质酸钠溶液7.5g，用0.1mol/L的盐酸溶液调节pH至1.5，然后降温至4℃，加入胶原蛋白溶液2.5g，搅拌，未出现丝状等沉淀物质，持续搅拌2小时，未出现沉淀物质。

实施例1

配方表：

物料含量

组1

组2

组3

组4

组5

组6

组7

透明质酸钠

20mg/mL

20mg/mL

20mg/mL

20mg/mL

20mg/mL

20mg/mL

10mg/mL

胶原蛋白

2mg/mL

4mg/mL

5mg/mL

10mg/mL

15mg/mL

20mg/mL

20mg/mL

其中，原料为：透明质酸钠，分子量为240万Da；胶原蛋白(牛源)，分子量为30万Da；

制备方法a：

按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M(mol/L)的HCl(盐酸)调节溶液的pH至1.5，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在0℃条件下，将所得胶原蛋白溶液100mL加入至所得透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至1.5，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻3天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时，获得透明质酸-胶原蛋白海绵；

将所得的透明质酸-胶原蛋白海绵，转移到透析袋(截留分子量1万)中并置于pH为7.2的磷酸盐缓冲液中透析，直到海绵的pH为7.0，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白海绵，发现各配方组所得海绵不能使用27G针头推挤；

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白海绵采用129℃，2分钟湿热灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-a，组2-a，组3-a，······，组7-a。

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白海绵，采用钴60以10KGy的辐照剂量在0℃进行辐照灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白海绵，分别称为组1-a’，组2-a’，组3-a’，······，组7-a’。

制备方法b：

按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M的HCl调节溶液的pH至1.0，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在4℃条件下，将胶原蛋白溶液100mL加入至透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至1.0，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻3天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时，获得透明质酸-胶原蛋白凝胶；

将所得的透明质酸-胶原蛋白凝胶，置于pH为7.2的磷酸盐缓冲液中浸泡，直到凝胶的pH为7.0，得到中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，发现各配方组所得凝胶可以使用27G针头推挤出；

取部分中性透明质酸-胶原蛋白凝胶采用129℃，2分钟湿热灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，称为组1-b，组2-b，组3-b······，组7-b；

取部分中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，采用钴60以10KGy的辐照剂量在0℃进行辐照灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，称为组1-b’，组2-b’，组3-b’，······，组7-b’。

制备方法c：

按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M的HCl调节溶液的pH至1.5，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在4℃条件下，将胶原蛋白溶液100mL加入至透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至1.5，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻14天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时，获得透明质酸-胶原蛋白海绵；

将所得的透明质酸-胶原蛋白海绵，转移到透析袋中并置于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析，直到海绵的pH为7.2，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白海绵，发现各配方组所得海绵不能使用27G针头推挤；

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白海绵，采用129℃，2分钟湿热灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-c，组2-c，组3-c，······，组7-c。

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白海绵，采用钴60以10KGy的辐照剂量在-20℃进行辐照灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白海绵，分别称为组1-c’，组2-c’，组3-c’，······，组7-c’。

制备方法d：

按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M的HCl调节溶液的pH至0.9，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在4℃条件下，将胶原蛋白溶液100mL加入至透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至0.9，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻14天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时，获得透明质酸-胶原蛋白凝胶；

将所得的透明质酸-胶原蛋白凝胶，转移到透析袋中并置于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析，直到凝胶的pH为7.0，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，发现各配方组所得凝胶可以使用27G针头推挤出；

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，采用129℃，2分钟湿热灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-d，组2-d，组3-d，······，组7-d。

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，采用钴60以10KGy的辐照剂量在-20℃进行辐照灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-d’，组2-d’，组3-d’，······，组7-d’。

制备方法e：

按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M的HCl调节溶液的pH至1.5，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在3℃条件下，将胶原蛋白溶液100mL加入至透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至1.5，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻12天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时，获得透明质酸-胶原蛋白海绵；

将所得的透明质酸-胶原蛋白海绵，转移到透析袋中并置于pH为7.0的磷酸盐缓冲液中透析，直到海绵的pH为6.8，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白海绵，发现各配方组所得海绵不能使用27G针头推挤；

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白海绵，采用129℃，2分钟湿热灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-e，组2-e，组3-e，······，组7-e。

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白海绵，采用钴60以12KGy的辐照剂量在0℃进行辐照灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白海绵，分别称为组1-e’，组2-e’，组3-e’，······，组7-e’。

制备方法f：

按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M的HCl调节溶液的pH至0.9，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在3℃条件下，将胶原蛋白溶液100mL加入至透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至0.9，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻12天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时，获得透明质酸-胶原蛋白凝胶；

将所得的透明质酸-胶原蛋白凝胶，转移到透析袋中并置于pH为7.2的磷酸盐缓冲液中透析，直到凝胶的pH为6.8，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，发现各配方组所得凝胶可以使用27G针头推挤出；

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，采用129℃，2分钟湿热灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-f，组2-f，组3-f，······，组7-f。

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，采用钴60以10KGy的辐照剂量在0℃进行辐照灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-f’，组2-f’，组3-f’，······，组7-f’。

制备方法g：

按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M的HCl调节溶液的pH至1.2，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在3℃条件下，将胶原蛋白溶液100mL加入至透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至1.2，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻12天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时，获得透明质酸-胶原蛋白海绵；

将所得的透明质酸-胶原蛋白海绵转移到透析袋中并置于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析，直到海绵的pH为7.0，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白海绵，发现各配方组所得海绵不能使用27G针头推挤，比方法e所得中性透明质酸-胶原蛋白海绵略软，且粘弹性也相对更低；

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白海绵，采用129℃，2分钟湿热灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-g，组2-g，组3-g，······，组7-g。

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白海绵，采用钴60以10KGy的辐照剂量在0℃进行辐照灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白海绵，分别称为组1-g’，组2-g’，组3-g’，······，组7-g’。

制备方法h：

按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M的HCl调节溶液的pH至0.9，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在3℃条件下，将胶原蛋白溶液100mL加入至透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至0.9，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻6天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时，获得透明质酸-胶原蛋白凝胶；

将所得的透明质酸-胶原蛋白凝胶，转移到透析袋中并置于pH为7.2的磷酸盐缓冲液中透析，直到凝胶的pH为7.0，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，发现各配方组所得凝胶可以使用27G针头推挤出；

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，采用129℃，2分钟湿热灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-h，组2-h，组3-h，······，组7-h。

取部分所得中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，采用钴60以10KGy的辐照剂量在0℃进行辐照灭菌，得到透明质酸-胶原蛋白凝胶，分别称为组1-h’，组2-h’，组3-h’，······，组7-h’。

制备方法i：

使用无菌原料在无菌生产条件下，按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M的HCl调节溶液的pH至1.5，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在3℃条件下，将胶原蛋白溶液100mL加入至透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至1.5，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻6天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时，获得透明质酸-胶原蛋白海绵；

将所得的透明质酸-胶原蛋白海绵，置于pH为7.2的磷酸盐缓冲液中浸泡，直到海绵的pH为7.0，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白海绵，发现各配方组所得海绵不能使用27G针头推挤。

制备方法j：

使用无菌原料在无菌生产条件下，按照配方表，制备各组产品：将透明质酸钠溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，然后缓慢加入1M的HCl调节溶液的pH至1.1，离心，除去气泡，得到酸性透明质酸钠溶液(配方含量)；将胶原蛋白溶于注射用水中，室温条件下搅拌至完全溶解，得到胶原蛋白溶液(配方含量)；在3℃条件下，将胶原蛋白溶液100mL加入至透明质酸钠溶液100mL中，搅拌均匀，用1M的HCl调节混合溶液的pH至1.1，得到酸性混合溶液；

将所得的酸性混合溶液在-20℃条件下冷冻6天，然后取出，获得透明质酸-胶原蛋白凝胶；

将所得的透明质酸-胶原蛋白凝胶，置于pH为7.2的磷酸盐缓冲液中浸泡，直到凝胶的pH为7.0，取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白凝胶，发现各配方组所得凝胶可以使用27G针头推挤出。

循环冷冻制备方法k：

按照配方组5，参照制备方法a或制备方法b的操作，将解冻所获得的海绵或者凝胶再次在-20℃条件下冷冻3天，然后取出，置于25℃条件下解冻5小时-6小时(如此为循环2次)，然后将所得海绵或者凝胶在pH为7.2的磷酸盐缓冲液中浸泡，直到海绵或凝胶的pH为7.0，取出，得到海绵或者凝胶；任选地进行制备方法a中的湿热灭菌或辐照灭菌，得到产品；其中，按照制备方法a操作，所得海绵，无法使用27G

针头推挤出；按照方法b所得凝胶可以使用27G针头推挤出。

以下测试涉及的对照品，配制方法如下：

对照品1：透明质酸钠和胶原蛋白的混合溶液，使用PBS溶液配制，其中，透明质酸钠10mg/mL，胶原蛋白7.5mg/mL，直接简单混合即得(不经过冷冻步骤)；

对照品2：透明质酸钠和胶原蛋白的混合溶液，其中，透明质酸钠10mg/mL，胶原蛋白7.5mg/mL；参照方法b，但先将透明质酸钠溶液经过冷冻步骤，然后与胶原蛋白溶液在4℃条件下混合，再置于pH为7.2的磷酸盐缓冲液中浸泡，得到凝胶。

对照品3：透明质酸钠和重组胶原蛋白(不具有三螺旋结构)的混合溶液，其中，透明质酸钠10mg/mL，重组胶原蛋白7.5mg/mL；按照方法b制备，得到凝胶。

实施例2：测试及结果

1)推挤力

室温条件下，分别取各配方组制得的样品，以恒定的速度推动注射器推进杆，注射器针头为27G，推动速度为30mm/min，检测推挤力大小。

各配方组和方法制备所得的海绵，不能使用27G针头推挤；

测得各配方组和方法制备所得的凝胶样品的平均推挤力在3N-16N之间，灭菌后的样品的推挤力相对灭菌前的样品，平均推挤力略有降低，仍然在3N-16N之间。

2)渗透压

分别取各配方组制得的海绵或凝胶，采用渗透压测定仪，参照《中国药典》2020版0632渗透压摩尔浓度测定法方法，测量渗透压，在250mOsmol/kg-350mOsmol/kg之间。

3)游离的透明质酸钠含量

分别取部分配方组制得的样品，采用中国医药行业标准YY/T 0962-2021附录F方法，检测样品中的游离透明质酸钠的含量，检测结果见下表。

样品

组1-a

组2-a

组3-a

组4-a

组5-a

组6-a

组7-a

组5-h

组5-i

组5-j

灭菌前

7％

6％

6％

6％

6％

7％

6％

6％

6％

6％

灭菌后

39％

37％

34％

26

19％

16％

12％

18％

6％

6％

样品

组1-a’

组1-b’

组3-c

组3-c’

组3-d

组3-d’

组7-e

组7-e’

组7-f’

灭菌前

7％

6％

6％

6％

6％

6％

7％

6％

6％

灭菌后

8％

7％

31％

8％

32％

7％

11％

7％

7％

根据结果可知，灭菌前，各配方组所得海绵/凝胶中游离的透明质酸钠含量低于10％；灭菌后，不同灭菌方法，导致产物中游离透明质酸钠含量差别较大；热灭菌方式中，游离透明质酸钠含量相对高；辐照灭菌方式中，灭菌前后游离透明质酸钠含量差别不明显。

4)溶胀度

测试方法：取500目筛网(8cm*8cm的正方形，折叠成4cm*4cm*2cm的正方形槽)放入干燥箱中，80℃下至恒重，记作m₀；称取0.2g-0.5g待测样品置于500目筛网上，将筛网置于蒸发皿中，一次性加入30mL0.9％氯化钠溶液，使其完全浸润样品，溶胀12h；将筛网并样品一起取出，用滤纸吸去筛网底部和周边液体至滤纸无湿痕为止，称量记作m₁；然后将筛网放入干燥箱中，80℃下至恒重，记作m₂；溶胀度＝(m₁-m₂)/(m₂-m₀)*100％；其中，m₁为筛网加样品溶胀后的质量，单位为克(g)，m₂为筛网加样品烘干后的质量，单位为克(g)，m₀为恒重后筛网质量，单位为克(g)。

按照测试方法，测试实施例1配方组按照制备方法a-制备方法j所得凝胶产物的溶胀度；结果：按照实施例1的各制备方法制得的透明质酸钠-胶原蛋白凝胶，溶胀度低于60％，相比按照同样方法制得的透明质酸钠凝胶，本发明的凝胶产物的溶胀度相对更低，配方组7所得凝胶溶胀度低于15％。

根据结果可知，相对单独的透明质酸凝胶，本发明提供的含有胶原蛋白的凝胶，溶胀率更低，注射后将更不容易发生肿胀等不良反应。

5)粘弹性

样品：实施例1各配方和方法所得；

方法：使用流变仪对各待测样品进行测试，测试之前将解冻的透明质酸样品滤去自由水；测试中选用直径为20mm的平板，板间距设置为0.5mm，体系温度控制为25℃，根据线性粘弹区得到合适应变，进行0.01Hz-10Hz频率扫描，测量弹性模量(G’)和粘性模量(G”)。

结果：

辐照灭菌方法，所得产品的粘弹性灭菌前后几乎不变；

热灭菌导致样品G’下降，且胶原蛋白比例越高，G’降低越多(这可能是因为胶原蛋白耐热性较差)；

同样透明质酸钠与胶原蛋白比例条件下，随冷冻天数增加或冷冻循环次数增加，G’增加，推挤力也增加，但一定冷冻天数后，G’增加程度减弱；直接混合透明质酸钠和胶原蛋白，其G’和G”都相对较低；

同样冷冻天数条件下，胶原蛋白含量高，其G’相对更高；

同一样品，灭菌前后，G’高于G”；

简单混合透明质酸钠和胶原蛋白的样品，胶原蛋白未与透明质酸钠混合后冷冻的样品，及重组胶原蛋白与透明质酸钠冷冻的样品，弹性模量相对较低，推测其未能形成复杂的交联和/或网络结构。

有关具体结果参见下表。

根据上述结果可知，本发明提供的组合物，具有相对更好的粘弹性。

6)透明质酸酶酶解试验

样品：唯瑅：型号为Restylane Vital，为20mg/mL的BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)交联的透明质酸钠；HA水溶液：使用PBS配制透明质酸钠溶液，10mg/mL；组3-a：实施例1中配方组3按照制备方法a所得灭菌后的凝胶，透明质酸钠按照10mg/mL计；组5-a：实施例1中配方组5按照制备方法a所得灭菌后的凝胶，透明质酸钠按照10mg/mL计。

方法：取50uL透明质酸酶，加入10mL PBS缓冲液(pH 7.0)，稀释成50U/mL；分别称取各待测样品0.3g，加入3mL PBS缓冲液(pH 7.0)，涡旋混匀1min，备用；往样品中加入2mL50U/mL透明质酸酶，涡旋混匀10s，得到混合液；混合液置于37℃水浴，自置于水浴之后开始计时，每隔0h，1h，3h，5h，7h，9h，24h，48h，72h······取样50μL，加入3mL PBS缓冲液(pH 7.0)稀释，立即使用紫外分光光度计测定232nm处吸光度，以PBS缓冲液(pH 7.0)作空白对照。

结果：各样品的吸光度先逐渐上升，然后达到平台期，再逐渐下降；其中，样品唯瑅的酶解完成时间约为72小时；HA水溶液酶解完成时间约为24小时；组3-a酶解完成时间约为102小时；组5-a酶解完成时间约为120小时；可以看出，本发明提供的组合物，更耐酶解。

7)胶原酶酶解试验

胶原蛋白溶液：5mg/mL，使用PBS缓冲液(pH 7.0)配制得到；样品：按照实施例1相应配方和方法所得；

称取各待测样品0.3g，浸泡在37℃100mL 5U/mL胶原酶的PBS缓冲液(pH 7.0)，通过测定溶液中的羟脯氨酸含量，推测样品剩余量，从而评价样品的降解程度；溶液中羟脯氨酸含量越多，则样品剩余量就越少，证明降解越快；检测结果见下表。

样品

胶原蛋白溶液

组3-a

组3-a’

组3-h

组3-h’

组5-h

组5-h’

羟脯氨酸含量(％)

>90

>80

70-75

>75

<70

<70

<60

检测结果显示，在降解24小时内，本发明的组合物的羟脯氨酸含量少于纯胶原蛋白样品，表明本发明制备的凝胶组合物的降解时间比纯的胶原蛋白长，耐酶解性能更好。

8)对成纤维细胞的增殖率

待测物分组：

样品组：实施例1组5-h’所得凝胶；对照组：前述的对照品2；空白组：培养基；

取适宜代数、状态良好的人皮肤成纤维细胞，胰酶消化后加入完全培养基终止消化，800-1000rpm/min离心5min，弃去上清液，加入完全培养基重悬细胞；按每孔100μl细胞悬液接种于96孔板，细胞密度为5000个/孔，每组设5个复孔，四周孔加入200μLPBS缓冲液(pH 7.0)；待细胞贴壁后，分别加入100μL待测物(分别用培养基稀释10倍)；将孔板置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱培养，每天显微镜下观察细胞形态；分别在培养第3天、5天、7天时，使用酶联免疫检测仪在490nm波长下测各孔吸光度，取平均值并记录，根据各组的吸光度均值计算细胞的相对增殖率，结果如下表所示。

组别	3天增殖率	5天增殖率	7天增殖率
				组5-h’	65％±4％	95±3％	135％±5％
对照组	55％±2％	80±3％	98±7％
				空白组	44％±4％	71％±4％	91±5％

由结果可知，随时间增加，相对于对照组及空白组，样品组(实施例1的组5-h’制备得到的凝胶)的细胞增殖效果更好，说明本发明提供的凝胶组合物，可以刺激促进细胞增殖。

本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容和范围内对本文所述的方案或应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进条件/参数来实现和/或应用本发明技术。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (10)

1.一种组合物，由以下组分组成：透明质酸类物质，胶原蛋白，缓冲盐和水；所述透明质酸类物质包括交联的透明质酸类物质和游离的透明质酸类物质；其中，所述胶原蛋白至少部分与透明质酸类物质物理交联；基于质量比计算，所述游离的透明质酸类物质的量不高于透明质酸类物质总量的40％；所述透明质酸类物质为透明质酸，透明质酸钠，透明质酸锌和透明质酸钙中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的组合物，包括以下条件中的至少之一：

基于组合物的总体积，所述透明质酸类物质的含量为5mg/mL-30mg/mL；

基于组合物的总体积，所述胶原蛋白的含量为2mg/mL-15mg/mL；

所述透明质酸类物质与所述胶原蛋白的质量比为(5:1)-(0.5:1)或(4:1)-(1:1)；

所述透明质酸类物质的分子量为150万道尔顿-300万道尔顿；

基于胶原蛋白的总质量计算，至少60％的胶原蛋白具有三螺旋结构；

所述胶原蛋白的分子量不低于15万道尔顿；和

所述物理交联的形成包括冷冻。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，所述缓冲盐包括磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钠和氯化钾中的至少一种；和/或所述组合物的pH为6.0-7.6。

4.根据权利要求1-3任一所述的组合物，其中，所述游离的透明质酸类物质的量不低于透明质酸总量的5％；和/或所述游离的透明质酸类物质的量不高于透明质酸总量的10％。

5.根据权利要求1-4任一所述的组合物，其使用27G针头或30G针头注射，平均推挤力不超过30N；和/或其渗透压在200mOsmol/kg-400mOsmol/kg。

6.根据权利要求1-5任一所述的组合物，所述组合物为海绵形式或凝胶形式。

7.根据权利要求1-6任一所述的组合物，所述缓冲盐为磷酸氢二钠，磷酸二氢钠和氯化钠组合，或为磷酸氢二钾，磷酸二氢钾和氯化钾组合。

8.一种制备权利要求1-7任一所述组合物的方法，包括以下步骤：

1)分别获得透明质酸类物质的水溶液和胶原蛋白的水溶液；

2)将透明质酸类物质的水溶液调节pH至1.5或其以下，任选地除去气泡，然后在0℃～10℃条件下，与胶原蛋白的水溶液混合，再调节pH至1.5或其以下，得到酸性混合液；

3)将所得的酸性混合液在-30℃～-20℃冷冻3天-14天，然后在20℃～30℃条件下融解，得到透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶；

4)将所得透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶转移到透析袋中并置于缓冲盐的水溶液中，透析至透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶pH为6.0-7.6；或将所得透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶加入至缓冲盐的水溶液中浸泡至透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶pH为6.0-7.6；取出，得到中性透明质酸-胶原蛋白海绵或凝胶，得到所述组合物；

任选地，将所述组合物进行灭菌；所述灭菌包括：干热灭菌，湿热灭菌，辐照灭菌，或电磁灭菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤2)中，调节pH至1.2-1.5，得到海绵形式组合物，或者调节pH至1.1或其以下，得到凝胶形式组合物。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，通过灭菌将海绵形式组合物转变为凝胶形式组合物，所述灭菌包括：干热灭菌，湿热灭菌或采用钴60以超过15KGy的辐照剂量在-30℃～0℃进行辐照灭菌。