DE2634898C3 - Verfahren zur Gewinnung von Streptokokkenstoffwechselprodukten - Google Patents

Description

- mit (NH₄J₂SO₄-Lösung fällt, erneut in 0,02 M Phosphatpuffer aufnimmt und eine Chromatographie an quervernetzter DEAE-Agarose π durchführt, wobei man durch Gradientenelution Streptolysin 0, Hyaluronatlyase, Streptokinase und Streptodornase in für analytische Zwecke erforderlichen Reinheit gewinnt, oder

— mit dem etwa gleichen Volumen 0,1 M Phosphatpuffer verdünnt, hochdisperses Siliziumdioxid bei pH 6 bis 7 einrührt und aus der vom Adsorbat getrennten Lösung die Hyaluronatlyase mittels (NH₄J₂SO₄ ausfällt, abzentrifugiert, gegen 0,02 M Phosphatpuffer dialysiert und die r> Hyaluronidase an DEAE-Agarose in reiner Form gewinnt, oder

- durch Fällung mit 10% NaCl, Ca-Phosphatfällung, fraktionierte (NH₄)₂SO₄-Fällung und Chromatographie an DEAE-Agarose reine Streptoki- jo nase und Streptodornase gewinnt, oder

— die bei der Hyaluronatlyasegewinnung an dem hochdispersen Siliciumdioxid absorbierten Stoffwechselprodukte wie Streptolysin O, Streptokinase und Streptodornase mit Wasser bei einem η pH-Wert von 9,5 bis 10,5, vorzugsweise 10,0, eluiert und durch die genannten fraktionierten Fällungsschritte für Streptokinase und Streptodornase sowie Gelchromatographie an DEAE-Agarose reine Streptokinase und Streptodornase w gewinnt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Streptokokkenstoffwechselprodukten mit großer Reinheit.

Streptokokken sind grampositive kettenförmig wachsende Kugelbakterien, die physiologisch zu den Milchsäurebakterien zu rechnen sind. Sie bilden in flüssigen Nährböden gezüchtet eine Reihe interessanter extrazellulärer Stoffwechselprodukte. Die bekanntesten sind Streptolysin O, Hyaluronatlyase, Desoxyribonuklease (Streptodornase) und Streptokinase. Je nach Art des eingesetzten Stammes, des Nährbodens und der Kulturbedingungen (pH-Wert, Temperatur, Glucosespiegel) werden unterschiedliche Mengen dieser Proteine gebildet. Für serologische Untersuchungen werden Streptolysin 0 (Antistreptolysinreaktion = ASR), Hyaluronatlyase (Antihyaluronidasereaktion) und Streptodornase (Antistreptodornasereaktion) zur Erkennung von Streptokokkenerkrankungen verwendet. Für den klinischen Gebrauch haben sich Streptokinase und Streptodornase entweder für sich oder in Kombination miteinander eingeführt.

Die bisher bekannten Reinigungsvorschrifteri gellen meist nur tür ein einzelnes Streptokokkenprotein. Man benötigt zur Isolierung aus dem Kulturfiltrat größere Mengen an Zusatzstoffen zur Fällung wie beispielsweise Äthanol, Methanol oder Ammonsulfat. Auch die Einführung von Absorptionsmittel wie Celite erfordert einen größeren Aufwand, obwohl hierbei schon erhebliche Fortschritte erkennbar sind. Es wurde bereits vorgeschlagen, die Fällung der Streptokinase auf CM-Cellulose durchzuführen, womit schon ein neues Prinzip, des als »Kristallisationszentrum« fungierenden Ionenaustauschers zur Anwendung käme.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von Streptokokkenstoffwechselprodukten zu beschreiben, in dem Methoden zur gleichzeitigen Isolierung möglichst vieler Stoffwechselprodukte unter Bedingungen angegeben werden, die eine Infektion ausschließen. Dabei soll die Reinigung in einfacher Weise möglich sein.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß die abgetöteten Streptokokken selbst diese Rolle eines als Ionenaustauscher fungierenden Kristallisationszentrums übernehmen können. Wenn die gewachsene Streptokokkenkultur mit konzentrierter Salzsäure auf pH 3,5 gebracht und eine Stunde bei Raumtemperatur oder Fermentationstemperatur gerührt wird, werden alle Streptokokken abgetötet. Die an die toten Streptokokken adsorbierten Proteine (Streptolysin O, Hyaluronidase, Streptolysin S und Streptokinase) werden zusammen mit den Kokken abzentrifugiert. Die einzelnen Produkte werden dann durch Elution mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8,0 wieder eluiert und von den toten Kokken separiert. Die Konzentrierung der Stoffwechselprodukte erfordert nach dieser Variante der Erfindung überraschenderweise keinerlei Hilfsstoffe, wenn man von der verwendeten Säure absieht. Auf den biologischen Teil des Verfahrens, der nicht Gegenstand der Erfindung ist, soll hier nicht näher eingegangen werden. Zur Herstellung der Fermentationslösung, welche die o.g. Streptokokkenstoffwechselprodukte enthält, findet der Stamm Streptokokkus equisimilis Verwendung und gegebenenfalls das im DDR-Patent Nr. 1 11 096 veröffentlichte Verfahren.

Die aus den eluierten Streptokokken isolierten Stoffwechselprodukte können nun entweder simultan oder einzeln nach speziellen Verfahren gereinigt werden. Als letzter Reinigungsschritt wird immer die Chromatographie an einem neu entwickelten Ionenaustauscher durchgeführt, der aus quervernetzter Agarose besteht, an welche Diäthylaminoäthylgruppen in bekannter Weise fixiert wurden. Mit diesem Ionenaustauscher, der autoklavierbar und auf der Säule regenerierbar ist, chromatographiert man immer in prinzipiell der gleichen Weise, indem ein linearer Gradient zwischen 0,02 M Phosphatpuffer (pH 8,0) und 0,02 M Phosphatpuffer mit 0,4 M NaCl (pH 7,6) Anwendung findet. Hierbei werden die erwähnten Stoffwechselprodukte grundsätzlich in der Reihenfolge Streptolysin, Hyaluronatlyase, Streptokinase und Streptodornase getrennt. Der Ionenaustauscher wird regeneriert, indem die Säule (2,5 χ 25 cm) mit 1 1 0,5 N NaOH, steriliem H₂O und sterilem Phosphat-Puffer (0,02 M pH 8,0) gewaschen wird. Auch der Zusatz von Chloroform (4 ml pro 1 i Puffer) hat sich als Konservierungsmittel gut bewährt.

Die Vorteile dieser Methode bestehen darin, daß keine Zusatzstoffe zur Isolierung benötigt werden und die Streptokokken abgetötet sind, wodurch keine Infektionsgefahr besteht. Weiterhin lassen sich auf diese einfache Weise simultan alle wichtigen Stoffwechsel-

produkte isolieren und in gleicher Weise am gleichen speziellen Ionenaustauscher reinigen.

Das Verfahren soll an folgenden Ausführungsbeispielen, die die Erfindung nicht einschränken, näher erläutert werden:

Beispiel 1

5 1 30h Streptokokkenkultur (Streptokokken Gruppe C), die bei pH 7,2 und 28°C Titer von 128 HU/ml Streptolysin C, 100 TE/ml Hyaluronatlyase (0,24 U/ml nach Definition von Gerlach und Köhler) und 4200 Christenseneinheiten/ml Streptokinase liefert, wird mit konzentrierter Salzsäure auf pH 3,5 gebracht und 1 h gerührt. Man zentrifugiert ab und verwirft den Überstand. Die abgetöteten Streptokokken werden mit zweimal 250 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gewaschen. Hierbei werden praktisch alle Stoffwechselprodukte quantitativ eluiert Die vereinigten Eluate werden klar zentrifugiert und mit 60 g Ammonsulfat pro 100 ml Lösung gefällt. Man löst den Niederschlag in 50 ml 0,02 M Phosphatpuffer (pH 8,0) und dialysiert gegen den gleichen Puffersulfat frei. Diese Lösung trägt man nun auf eine 2,5 χ 25 cm Säule von quervernetzter Agarose auf, an welche Diäthylaminoäthylgruppen gebunden sind. Diese sogenannte DEAE-Agarose-Q wird vorher durch Waschen in der Säule mit 11 0,5 N NaOH, H₂O und durch Äquilibrieren mit 0,02 M Phosphatpuffer vom pH 8,0 vorbereitet Eluiert wird mit einem linearen Gradienten, der aus 1 I 0,02 M Phosphatpuffer (pH 8,0) und 1 1 0,02 M Phosphatpuffer mit 0,4 M NaCl-Zusatz (pH 7,6) besteht Man eluiert dann bei etwa 0,01 M NaCl das Streptolysin, bei 0,05 M NaCl die Hyaluronatlyase, bei 0,10 M NaCl die Streptokinase und bei 0,2 M NaCl die Streptodornase. Die aktiven Fraktionen können vereinigt werden und sind für Testzwecke ausreichend sauber. Alle Arbeiten werden bei Raumtemperatur, die Chromatographie bei 4° C ausgeführt.

Beispiel 2

In gleicher Weise wie bei Beispiel 1 werden 51 Streptokokkenkultur aufgearbeitet. Nach Elution der Streptokokkenstoffwechselprodukte aus den abgetöteten Kokken erhält man 500 ml Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer. Diese Lösung wird mit 15 g hochdispersem Siliciumdioxid für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Streptolysin O, Streptodornase und Streptokinase werden adsorbiert, während die Hyaluronatlyase in Lösung bleibt. Diese kann nach Fällung mit 300 g Ammoniumsulfat wie folgt weiter gereinigt werden. Man läßt über Nacht stehen und zentrifugiert ab. Es wird in 10 ml Wasser gelöst und klarzentrifugiert. Daraufhin dialysiert man gegen 0,02 M Phosphatpuffer und trägt dann wie bei Beispiel 1 auf eine 2,5 χ 25 an DEAE-Agarose-Q-Säule auf und Chromatographien in gleicher Weise. Die an dem Siliciumdioxid gebundenen Komponenten wie Streptolysin, Streptodornase oder Streptokinase lassen sich mit Wasser, dessen pH-Wert auf 9,5 bis 10,5 eingestellt wurde, vorzugsweise 10,0, durch 20minütiges Rühren wieder isolieren. Sie können nach Beispiel 4 weitergereinigt werden.

Beispiel 3

Eine ähnliche Abtrennung der Hyaluronatlyase von den anderen Stoffwechselprodukten läßt sich auch aus rohen Kulturfiltraten mit Hilfe von Siliciumdioxid

vornehmen. In gleicher Weise wie bei Beispiel 2 rührt man zu 51 zentrifugierter Streptokokkenkultur 15 g hochdisperses Siliciumdioxid bei pH — 7,5 für 2 h ein. Die am Siliciumdioxid gebundenen Komponenten wie "> Streptolysin, Streptodornase oder Streptokinase können nach Beispiel 4 verarbeitet werden. Die Hyaluronatlyase läßt sich nach Fällung mit Ammoniumsulfat nacn Beispiel 2 reinigen.

Beispiel 4

Man geht auch hier vom Rohkonzentrat aus, das nach Beispiel 1 aus 5 I Streptokokkenkultur durch Eluation der abgetöteten Kokken mit zweimal 250 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gewonnen wurde. 450 ml der klar zentrifugierten Lösung bringt man auf pH 3,5 und fällt durch Zugabe von 10% v/w NaCl (45 g NaCl). Nach 30 Minuten wird abzentrifugiert und in 100 ml Wasser unter Zugabe von 1 N NaOH (tropfenweise) gelöst Der unlösliche Rest wird verworfen. Zu dieser Lösung setzt man nun 10 ml 0,5 M Lösung von Na₂HPO* und bringt den pH-Wert auf 6,9. Unter Rühren und Konstanthaltung des pH-Wertes durch Zusatz von 1 N NaOH fällt man durch tropfenweisen Zusatz 1 M CaCI₂-Lösung (5,0 ml). Es wird 15 Minuten gerührt und nach weiteren 45 Minuten abzentrifugiert. Der Calciumphosphatniederschlag wird mit 50 ml 0,02 M Phosphatpuficr (pH 8,0) gewaschen. Aus diesem Niederschlag ist die Rückgewinnung des gebundenen Streptolysins nach E.J. Pentz undG. Shigemura (J.Bacteriol.69,210 (1955) möglich. 140 ml vereinigte Lösung werden nun unter Rühren mit 38 ml gesättigter Ammonsulfatlösung auf 21,3% Ammonsulfatsättigung gebracht. Nach 15 M^:-'iU. . jhrung läßt r>an 45 Minuten absitzen und zentrifugiert dann ab. Der Niederschlag wird mit 22%iger gesättigter Ammonsulfatlösung (50 ml) gewaschen und verworfen. Das Zentrifugat und Waschwasser werden vereinigt, man erhält 175 ml. Aus dieser Lösung läßt sich die Streptokinase durch Fällung bei pH 7,0 und 45% Ammonsulfat vom größten Teil der Streptodornase trennen. Hierzu kontrolliert man den pH-Wert und fügt weitere 77 ml gesättigte Ammonsulfatlösung zu. Nach 15 Minuten Rührung und 45 Minuten absitzen wird abzentrifugiert. Der Niederschlag wird einmal mit 50 ml 50% gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen und dann in 20 ml Wasser gelöst. Diese Lösung dialysiert man gegen 0,02 M Phosphatpuffer vom pH Wert 8,0 und trägt auf die in gleicher Weise präparierte Säule wie bei Beispiel 1 auf. Auch die Eluation erfolgt in derselben Art. Man erhält etwa 50% der Ausgangsmenge an Streptokinase. Aus dem Überstand der Streptokinasefällung, welche 60% der Streptodornase enthält, läßt sich diese leicht gewinnen, indem man sie durch Zusatz von 20 g festem Ammonsulfat pro 100 ml Lösung ausfällt (pro 235 ml 47 g). Nach 30 Minuten Rührung und 60 Minuten Absitzen wird zentrifugiert.

Die Streptodornase wird in 0,02 M Phosphatpuffer (20 ml) gelöst, gegen den gleichen Puffer dialysiert und auf die DEAE-Agarose-Säule gebracht. Man eluiert hier ebenfalls mit einem linearen Gradienten zwischen 0,02 M Phosphat (pH 8,0) und 0,02 M Phosphat + 0,4 M NaCl (pH 7,6). Unter Verwendung eines C-Streptokokkenstammes erhält man hier drei aktive Gipfel, die bei Kochsalzkonzentration von etwa 0,02 M, 0,05 M und 0,2 M eluiert werden. Der letzte Gipfel enthält praktisch 90% aller Streptodornaseaktivität und wird allein isoliert, während die anderen Isoenzyme verworfen werden. Die Ausbeute beträgt 20%.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung von Streptokokkenstoffwechselprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß eine fermentierte Streptokokkenkultur auf pH 3,5 eingestellt wird und die Stoffwechselprodukte Streptolysin O, Hyaluronatlyase Streptokinase und Streptodornase an den abgetöteten Streptokokken gebunden werden, wo- ^ nach mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8 eluiert wird, und daß man anschließend entweder