DE2309280A1

DE2309280A1 - Verfahren zur herstellung von reiner alpha-amylase durch affinitaetschromatographie

Info

Publication number: DE2309280A1
Application number: DE19732309280
Authority: DE
Inventors: Fritz Dr Hueper; Erich Dr Rauenbusch
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1973-02-24
Filing date: 1973-02-24
Publication date: 1974-08-29
Also published as: BE811448A; US3926730A; LU69478A1; JPS49117673A; NL7402394A; GB1453484A; FR2219173A1

Description

Bayer Aktiengesellschaft 2 309 28 ο Er/MH Zentralbereich

Patente, Marken und Lizenzen

509 Leverkusen. Bayerwerk ^C2

23. Feb. 1973

Verfahren zur Herstellung von reiner Oi-Amylase durch Affinitatschromatographi e

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der bekannten uC-Amylase aus biologischem Material durch Anwendung der Affinitätschromatographie.

Es ist bereits bekannt geworden, daß man Cfc-Amylase aus biologischem Material, insbesondere aus Pankreasextrakten, gewinnen kann. Diese bekannten Methoden zur Herstellung und Isolierung von reiner Oi-Amylase sind aber unspezifisch und kompliziert. So werden hierzu fraktionierte Fällungen mit Salzen und wasserlöslichen Lösungsmitteln, Gelchromatographie und Chromatographie an Ionenaustauschern angewendet (M. L. Caldwell, M. Adams, J. T. Kung, G. C. Toralbaila, J. A. Chem. Soc. 74., 4033 (1952); J. J. M. Rowe, J. Wakim, J. A. Thoma, Analytical Biochemistry 25,, 206 (I968)). Die Affinitätschromatographie - auch unter dem Namen biospezifische Sorption bekannt - wurde bislang zur Reinigung von verschiedenen Enzymen angewandt (siehe G. Peinstein, Naturwissenschaften 58, Heft 8, 389 (1971).

Die Anwendung der Affinitätschromatographie zur Herstellung von reiner «i-Amylase^ mit trägergebundenen Inhibitoren ist bisher jedoch noch nicht bekannt geworden.

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Es wurde gefunden, daß man die bekannte ce-Amylase in reiner Form erhält, wenn man einen Rohextrakt aus biologischem Material mit einem trägergebundenen öfc-Amylaaeinhibitor in Berührung bringt, den gebildeten Enzym-Inhibitorkomplex mit wäßrigen Lösungen wäscht und die a-Amylase desorbiert.

Es ist als ausgesprochen überraschend zu bezeichnen, daß sich die oi-Amylase in hochreiner Porm mit Hilfe eines Einstufenprozesses aus einem biologischen Rohextrakt, insbesondere Pankreasextrakt, gewinnen läßt, wo doch nach dem bisherigen Stand der Technik für die Herstellung selbst weniger reiner Oi-Amylase eine Vielzahl von Verfahrenssohritten notwendig war. Weiterhin ist überraschend, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren keine Denaturierung der sonst in wäßriger Lösung recht instabilen, reinen a-Amylase eintritt. Überraschenderweise läßt sich die CC-Amylase neben anderen Begleitenzymen aus dem biologischen Rohextrakt gewinnen, ohne daß die Begleitenzyme, die nicht von dem a-Amylaseinhibitor gebunden werden, verändert oder inaktiviert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Ä-Amylase weist gegenüber den bisher bekannten Verfahren zur Herstellung des gleichen Enzyms eine Reihe von Vorteilen auf.

So können in einem einstufigen Verfahren die Lösungen von Organextrakten ohne irgendwelche vorangegangenen Vorreinigungen eingesetzt werden. Dadurch läßt sich ohne weiteres eine Anreicherung von zirka 50 E /mg Protein oder weniger auf 350 E/mg Protein erzielen.

Nach der Extraktion der Amylase können aus dem verbleibenden Extrakt alle anderen darin noch enthaltenen Enzyme gewonnen

Alle in dieser Anmeldung angegebenen Enzymaktivitäten der

Einheit E wurden nach dem P.I.P.-Test bestimmt (Fourth Report of the P.I.P. Commission, J. Mond. Pharm. 1968, 3, 337).

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werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich auch im technisch durchgeführten Maßstab durch große Einfachheit aus. Der trägergebundene Inhibitor kann nach Desorption der 06-Amylase wieder eingesetzt werden. Auch nach mehrfachem Einsatz bleibt die Kapazität für tt-Amylase praktisch vollständig erhalten.

Das erfindungegemäße Verfahren zur Herstellung von reiner a-Amylase stellt somit eine Bereicherung der Technik dar.

Der Ablauf des erfindungsgemäßen biochemischen Verfahrene kann durch das folgende Schema dargestellt werden:

1. Rohlösung 2. Waschlösung 3. Elutionelösung mit tt-Amylase

GC-Amylase komplex gebunden

ψ ψ φ

Rohlösung Waschlösung Elutionslösung

ohne a-Amylase mit Verun- mit a-Amylase

reinigungen

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte biochemische Material besteht im allgemeinen aus tierischen Organextrakten, vorzugsweise Pankreasextrakten, insbesondere Extrakt aus Schweinepankreas. Daneben kann auch ein Extrakt aus pflanzlichem Material genommen werden, vorzugsweise aus Mikroorganismen, insbesondere Stämmen der Ordnung Actinomycetales.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten trägergebundenen ot-Amylaseinhibitoren werden nach an sich bekann-

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ten Methoden aus Trägerharzen und oi-Araylaseinhibitoren hergestellt.

Als für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Inhibitoren haben sich beispielsweise der Inhibitor aus Weizen, der nach dem Verfahren der Deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2 003 934 (DBP ) gewonnen werden kann, sowie der Oi-Amylaseinhibitor aus Actinomyceten nach Deutscher Offenlegungaschrift Nr. 2 064 092 (DBP ) erwiesen. flC-Amylase läßt sich reversibel durch die beiden vorerwähnten flC-Amylaseinhibitoren hemmen.

Der a-Amylaseinhibitor aus Weizen ^gemäß Deutscher Offenlegungsschrif t Nr. 2 003 934 ist ein Polypeptid und kann nach den für die Kupplung von Proteinen und Enzymen literaturbekannten Methoden an polymere Trägerharze gekuppelt werden.

Ein sehr gut geeignetes Trägerharz ist dafür das in der Deutschen Patentanmeldung P 22 15 512.0 (DBP ) bzw. in der Deutschen Patentanmeldung P 22 15 687.2 (DBP ) beschriebene perlförmige Copolymerisat aus 70 $> Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 $> Methacrylsäure und 10 ia Maleinsäureanhydrid.

Die Fixierung des a-Amylaseinhibitors aus Weizen erfolgt hierbei in Analogie zu den in der Deutschen Patentanmeldung P 22 15 687.2 (DBP ) beschriebenen Verfahren bei pH 6,3 in möglichst salzarmer Lösung. Es können jedoch auch Träger anderer Zusammensetzung verwendet werden. So läßt sich beispielsweise der 06-Amylaseinhibitor nach obigem Verfahren auch an Anhydridgruppen-haltige Träger kuppeln, die gemäß der Deutschen Offenlegungsschrift 1 908 290 hergestellt worden sind. Ebenfalls möglich

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ist die Kupplung an Träger mit freien Carboxyl- oder primären Aminogruppen mittels wasserlöslicher Carbodiimide (P. Cuatrecasas, J. Biol. Chemistry 245, 3059 (197O)). Andere geeignete Träger sind gequollene Agarose (z. B. Sepharose), die gemäß der Deutschen Offenlegungsschrift 1 768 512 mit Bromcyan aktiviert, den a-Amylaseinhibitor aus V/eizen kovalent binden.

Wesentlich für die Verwendbarkeit eines Trägers scheint seine große Hydrophilie und die damit verbundene Quellbarkeit zu sein. Es ist nämlich für das beschriebene Verfahren unbedingt notwendig, daß nicht nur der Inhibitor, sondern später auch das Molekül der a-Amylase in die Poren des Trägers eindringen und damit in Wechselwirkung mit dem Inhibitor kommen kann. Die guten Anreicherungsergebnisse der ot-Amylase zeigen überraschenderweise und im Gegensatz zur Lehrmeinung, daß auch Träger mit anionischen Gruppen, die als Kationenaustauscher wirken, zumindestens in diesem Fall, mit Erfolg zur Affinitätschromatographie verwendet werden können. Wie später gezeigt wird, enthält die eluierte αί-Amylase keine nachweisbare Menge an Premdproteinen. Im Kontrollversuch mit den verwendeten Adsorbentien ohne den gekuppelten Inhibitor konnte nachgewiesen werden, daß keine Enzymaktivität unspezifisch an den Träger gebunden wird. Die Adsorption der ct-Amylase an den trägergebundenen Amylaseinhibitor ist daher hochspezifisch und nicht auf andere Effekte, wie z. B. ionogene Bindung, zurückzuführen.

Der Amylaseinhibitor aus Actinomyceten gemäß Deutscher Offenlegungsschrift 2 064 092 (DBP ) ist ein Kohlenhydrat-Derivat. Er läßt sich daher nicht nach den voranstehend genannten, vorwiegend nur für Proteine und Polypeptide geeigneten Methoden an eine Matrix kuppeln. Es kann aber aus diesem Inhibitor ein sehr wirksames

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Adsorbens für α-Amylaae. hergestellt werden, indem man mit Hilfe von Bromcyan in den Inhibitor reaktive Gruppen einführt, die mit den freien Aminogruppen des Polymeren
reagieren und damit an den Träger fixiert werden. Als derartiges unlösliches Polymeres kommt beispielsweise Aminoäthylcellulose in Betracht. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Acrylamidgelen, beispielsweise Biogel® P 10, in das durch Umamidierung mit 1,2-Diaminoäthan primäre Aminogruppen eingeführt worden sind. Der Reaktionsverlauf kann durch das folgende Formelschema wiedergegeben werden:

CH₂ + H₂NCH₂CH₂NH₂ CH₂ O

CH-CONH₂ > CH-C-NH-CH₂-CH₂-NH₂

CH₀ - NH, CH₀

I ι

I II

+ Br CN

> ' τ y = NH

- HBr (^vO/

III

H ₊ m ^ I % ΐ"2

Z^o-C-NH-CH₂-CH₂-NH-C-CH

CH

ι
ι
ι

wobei X eine Iminogruppe oder Sauerstoff (= NH bzw. = O)
sein kann.

Eine wäßrige Lösung des Inhibitors läßt man bei einer Temperatur von O - 5O⁰C, vorzugsweise 2O⁰C, im alkalischen

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Bereich vorzugsweise bei pH 11,0 mit Bromcyan reagieren. Der pH-Wert wird während der Reaktion mit Natronlauge konstant gehalten. Nach beendeter Alkaliaufnahme fügt man das Aminoäthylpolymere zu und rührt über Nacht. Der trägergebundene Inhibitor wird abfiltriert und intensiv nacheinander mit 0,2 M Kochsalzlösung und Wasser gewaschen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die erfindungsgemäß hergestellten trägergebundenen oCr-Amylaseinhibitoren mit Extrakten aus biologischem Material zueammengegeben. Das Enzym läßt sich so aus Extrakten von tieriechen Organen, insbesondere Pankreas, sowie Pflanzen und Mikroorganismen hochspezifisch durch Ausrühren extrahieren.

Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Säulen beim erfindungsgemäßen Verfahren.

Es ist empfehlenswert, nach der Adsorption der (fc-Amyläse am trägergebundenen CC-Amylaseinhibitor den gebildeten Enzyminhibitor-Komplex mit Kochsalzlösung, vorzugsweise 0,5-molarer Kochsalzlösung, und Wasser zu waschen.

Außer Qt-Amylase werden andere Amylasen nach dem erfindungegemäßen Verfahren nicht adsorbiert. Die erfindungsgemäß hergestellte fc-Amylase enthält demnach keine saccharogenen Amylasen.

Die erfindungsgemäßen trägergebundenen Inhibitoren lassen sich auch zur Entfernung von (X-Amylase, die als Verunreinigung in Enzympräparationen enthalten sein kann, verwenden. Wird beispielsweise ein Extrakt aus Schweinepankreae, hergestellt gemäß der Deutschen Patentschrift Nr. 910 580, durch eine Säule mit dem erfindungsgemäßen Adsorbens filtriert, so enthält das Eluat keine ct-Amylase, jedoch alle anderen ursprünglich vorhandenen Proteine.

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Die erfindungsgemäß an unlösliche Inhibitoren adsorbierte 06-Amylase kann spezifisch mit Stärkelösung - besonders gut geeignet ist hierfür wasserlösliche Stärke nach Zulkowsky bei 0 - 5O⁰C, vorzugsweise bei 25⁰C, desorbiert werden. Aus den stärkehaltigen Eluaten kann die GC-Amylase beispielsweise durch Bindung an Ionenaustauscher und anschließende Desorption gewonnen werden. Vorteilhaft ist eine Ausfällung mit Ammoniumsulfat.

In analoger Weise können Inhibitorlösungen aus Actinomyceten zur Desorption der OG-Amylase verwendet werden. In diesem Fall kann der eluierte Ofc-Amylaseinhibitor-Komplex durch Chromatographie an Molekularsieben, beispielsweise an Biogel ^vty P in seine Komponenten aufgetrennt werden.

Die erfindungsgemäß erhaltene oc-Amylase enthält, wie die chromatographische Untersuchung zeigt, keinerlei Fremdproteine.

Zur Erläuterung der Reinheit der erfindungsgemäß angereicherten a-Amylase sollen die Zeichnungen der Disc-Elektrophorese dienen. Die zahlreichen Proteinbanden des Ausgangsmaterials der oc-Amylaseanreieherung (siehe Figur 1 b) wurden durch das einstufige Verfahren auf zwei Banden reduziert (siehe Figur 1 a), die, wie Figur 2 zeigt, beide a-Amylaseaktivität aufweisen. Es handelt sich somit um zwei Isoenzyme der a-Amylase,

Das Elektropherogramm der nach Beispiel B 1 hergestellten O-Amylase ist in Figur 1 a dargestellt. Die Elektrophorese wurde in 7,5 tigern Polyacrylamidgel ohne Obergel in einem Trispuffersystem pH 9,5 durchgeführt. Bei einer konstanten Stromstärke von 4 mA pro Röhrchen und einer Spannung von 150 - 200 Volt betrug die Laufzeit 60 Minuten. Die Anfärbung erfolgte mit Coomassic Brilliantblau 2 S.

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Das Gel wurde hierauf mit dem Vitron-Extinktionsschreiber bei 620 mn densitometrisch ausgewertet.

Figur 1 a (Röhrchen 1):

Nach Beispiel B 1 hergestellte Otf-Amylase. Aufgetragen wurden 20/ul durch Ultrafiltration konzentriertes Eluat (10 E).

Figur 1 b (Röhrchen 2):

Extrakt aus Schweinepankreas. Dieser Extrakt wurde als Ausgangsmaterial zur Anreicherung der O-Amylase gemäß Beispiel B 1 verwendet. Die spezifische Aktivität betrug 97 E/mg Protein. Aufgetragen wurden 10 E.

In Figur 2 ist die Aktivitätsverteilung der durch Disc-Elektrophorese erhaltenen Fraktionen der erfindungsgemäß angereicherten QC-Amylase angegeben. Die Elektrophorese wurde wie bei Figur 1 angegeben durchgeführt; jedoch wurde die Laufzeit auf 100 Minuten verlängert. Aufgetragen wurden 40 yul des gemäß Beispiel B 1 hergestellten Präparates (19 E). Ein Röhrchen wurde mit Coomassic Brilliantblau 2 S angefärbt, ein parallel hierzu angefertigtes Röhrchen wurde in Fraktionen geschnitten, die jeweils mit 10 ml 0,02 m Puffer pH 6,9 eluiert wurden. In den Eluaten wurde die O-Amylaseaktivität bestimmt.

Die Eigenschaften von ot-Amylase, insbesondere die Beschreibung ihrer biochemischen Wirkung, sind in folgender Literaturstelle beschrieben: E. H. Fischer, E. A. Stein, The Enzymes, Vol. 4, Seite 313 - 343, Academic Press, New York, London (1960).

Die erfindungsgemäß hergestellte OC-Amylase kann in bekannter Weise für mannigfaltige Zwecke eingesetzt werden, beispielsweise ist sie ein wesentlicher Bestandteil von Verdauungsenzym-Präparaten.

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A) Herstellung der trägergebundenen Gt-Amylaseinhibitoren Beispiel A 1

Ein perlförmiges Copolymerisat aus 70 $ Tetraäthylenglykoldimethylacrylat, 20 fi Methacrylsäure und 10 °ß> Maleinsäureanhydrid wurden nach der Vorschrift der Deutschen Patentanmeldung P 22 15 512.0 (DBP ) hergestellt. 100 g dieses Anhydridharzes wurden in 3 1 Wasser suspendiert und eine Lösung von 25 g Amylaseinhibitor aus Weizenkleie mit 267 Amylase-Inhibitor-Einheiten pro mg, hergestellt nach DOS 2 003 934, in 1 1 Wasser zugegeben. Das pH wurde mit Hilfe eines pH-Staten durch Zugabe von 2 N-Natronlauge auf 6,3 konstant gehalten. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Anschließend wurde über eine Glasfritte G 3 abgesaugt, mit je 2 1 0,05 m Phosphatpuffer pH 7,5, der 1 m Natriumchlorid enthält, und anschließend mit 2 1 desselben Puffers ohne Natriumchlorid nachgewaschen. Nach dem Absaugen wurden 446 g feuchtes Inhibitorharz erhalten.

Beispiel A 2
_«_{v &} w,«^^«.^ 4 B wurden auf einer Glasf ritte mit 10 1 Wasser gewaschen, in 100 ml Wasser suspendiert und bei einer Temperatur von 20⁰C zu einer Lösung von 3 g Bromcyan in 150 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert der Suspension wurde mit Hilfe eines pH-Staten durch Zugabe von 2 η Natronlauge bei pH 11,5 gehalten. Dann wurde abgesaugt und mit 1 1 Wasser und 2 1 0,1 m Natriumbicarbonatlösung nachgewaschen. Das Gel wurde anschließend in 100 ml Wasser suspendiert und mit einer Lösung von 1,5 g des Amylaseinhibitors aus Weizen mit einer

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Aktivität von 267 Amylase-Inhibitor-Einheiten pro mg in 100 ml Wasser, das 15 ml 0,02 m lnosphatpuffer pH 7,0 enthielt, versetzt. Der Reaktionsansatz wurde über Nacht im Kühlraum gerührt. Dann wurde das Gel abgesaugt und auf einer Säule mit einem Durchmesser von 30 mm nacheinander mit 4 1 0,5 m Kochsalzlösung, 2 1 0,02 m Natriumglycerophosphatpuffer pH 6,9mit 0,002 m Calciumchlorid und 2 1 Wasser gewaschen.

Beispiel A 3

Ein Copolymerisat wuide.nach der Vorschrift der DOS 1 908 aus 4,7 $> Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid, 71,5 % Acrylamid und 23,8 $ Maleinsäure hergestellt. 50 g dieses Harzes in der Anhydridform wurden wie in Beispiel A 1 angegeben mit 10g Amylaseinhibitor umgesetzt. Nach dem Absaugen wurden 550 g feuchtes Inhibitorharz erhalten.

Beispiel A 4

10 g Biogel ^ P 10 wurden in 100 ml 1,2-Diaminoäthan suspendiert und 3 Minuten unter Rückflußkühlung gekocht. Die Reaktionsmischung gab man zu 500 ml kaltem Wasser. Das stark aufgequollene Biogel wurde abfiltriert und nacheinander mit je 5 1 Wasser und 0,1 M Natriumchloridlösung neutral gewaschen. Nach dem Absaugen wurden 59 g feuchtes Aminoäthyl-Biogel erhalten.

4 g Amylaseinhibitor aus Actinomyceten mit einer Aktivität von 3.300 AIE/mg (Amylase-Inhibitor-Einheiten), hergestellt gemäß DOS 2 064 092, wurden in 150 ml Wasser gelöst und mit 2 η Natronlauge auf pH 11,0 gestellt. Bei 20⁰C wurden unter Rührung 400 mg Bromcyan zugefügt und die Lösung durch Zugabe von 2 η Natronlauge bei pH 11,0 gehalten. Nach beendeter

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Alkaliaufnahme (ca. 15 Minuten) wurden 50 g des zuvor dargestellten Aminoäthyl-Biogels zugegeben. Die Mischung rührte man über Nacht bei 4⁰G und filtrierte das Gel ab. Es wurde intensiv mit Wasser und 0,2 m Kochsalzlösung gewaschen.

B) Gewinnung der reinen a-Amylase
Beispiel B 1

440 g des nach Beispiel A 1 hergestellten feuchten Inhibitorharzes wurden mit Wasser in eine Säule mit einem Durchmesser von 50 mm eingeschlämmt. Durch die Säule wurde 1,0 1 eines wäßrigen Extraktes aus Schweinepankreas, hergestellt gemäß DBP 910 580 mit einem Gehalt von 1500 E/ml (X-Amylase = 1.500.000 E, filtriert. Nachgewaschen wurde mit 1 1 0,2 m Natriumchloridlösung und 10 1 0,002 m Calciumchloridlösung. Im Eluat war keine a-Amylase enthalten. Das Enzym wurde mit 2 1 einer Lösung von 5 # Stärke (Stärke nach Zulkowsky) in 0,02 m Natriumglycerophosphatpuffer pH 6,9 mit Zusatz von 0,002 m Calciumchlorid eluiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug 80 ml pro Stunde. Im Eluat waren insgesamt 945.000 E Amylase enthalten, entsprechend 63 i<> bezogen auf die Aktivität des Ausgangsmaterials. Das Eluat wurde im Vakuum auf 1000 ml eingeengt und bei 4⁰C unter Rührung mit 200 g Ammoniumsulfat versetzt. Nach Stehen über Nacht zentrifugierte man ab, löste den Niederschlag in 0,002 m Calciumchloridlösung auf und dialysierte gegen 0,002 m Calciumchloridlösung. Nach Gefriertrocknen wurde a-Amylase mit einer spezifischen Aktivität von 350 E/mg Protein erhalten.

Beispiel B 2

200 g des gemäß Beispiel A 2 hergestellten Inhibitorharzes wurden in einer Säule mit einem Durchmesser von 30 mm ein-

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geschlämmt. Auf die Säule wurcre eine Lösung von 500 mg roher a-Amylase mit einer Aktivität von 68 E/mg in 10 ml 0,02 m Puffer pH 6,9 aufgetragen (insgesamt 34.000 E). Nachgewaschen wurde mit 2 1 0,02 m Puffer pH 6,9, dann wurde mit 250 ml 5 %iger Stärkelösung nach Zulkowsky bei einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/Std. eluiert. Im Eluat waren insgesamt 18.500 E o-Amylase, entsprechend 54$ bezogen auf die Aktivität des Ausgangsmaterials, enthalten. Die a-Amylase wurde aus dem Eluat gemäß Beispiel B 1 durch Ammoniumsulfatfällung isoliert und enthielt 315 E/mg.

Beispiel B 3

550 g des nach Beispiel A 3 hergestellten feuchten Inhibitorharzes wurden wie im Beispiel B 1 beschrieben zur Herstellung von Oi-Amylase eingesetzt. Als Ausgangsmaterial wurden 900 ml eines wäßrigen Extraktes aus Schweinepankreas mit einem Gehalt von 1500 E/ml, hergestellt gemäß DBP 910 580, entsprechend 1.35O.OOO E a-Amylase, eingesetzt. Nach Elution mit Stärkelösung wurden 801.000 E a-Amylase (59 9^ bezogen auf das Ausgangsmaterial) erhalten.

Beispiel B 4

10 g des nach Beispiel A 4 hergestellten feuchten Inhibitorharzes wurden in eine Säule mit einem Durchmesser von 15 mm eingeschlämmt. Durch die Säule wurden 25 ml einer Lösung von 25 mg a-Amylase mit einer Aktivität von 246 E/mg, entsprechend 6.150 E, filtriert. Nachgewaschen wurde mit 150 ml 0,002 m Calciumchloridlösung, 100 ml 0,2 m Natriumchloridlösung und 50 ml Wasser. Alle Eluate enthielten keine Oi-Amylase. Das Enzym wurde mit 400 ml einer Lösung von 5 $ Stärke (Stärke nach Zulkowsky) in 0,02 m Natriumglycerophosphatpuffer pH 6,9 mit Zusatz von 0,002 m Calciumchlorid eluiert. Die Pließ-

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geschwindigkeit betrug 20 ml/Stunde. Im Eluat waren insgesamt 3.5OO E Ot-Amylase, entsprechend 57 9^ bezogen auf die Aktivität des Ausgangsmaterials, enthalten.

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Claims

Patentansprüche|4-

1) Verfahren zur Herstellung von reiner Ού-Amylase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Rohextrakt aus biologischem Material mit einem trägergebundenen O-Amylaseinhibitor in Berührung bringt, den gebildeten Enzym-Inhibitorkomplex mit wäßrigen Lösungen wäscht und die oc-Amylase desorbiert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Enzym-Inhibitorkomplex die Ct-Amylase mit Stärkelösung desorbiert.

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen an das Trägerharz gebundenen a-Amylaseinhibitor aus Weizenkleie verwendet.

4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen an das Trägerharz gebundenen Inhibitor aus Actinomyces-Stämmen verwendet..

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