DE69121018T2

DE69121018T2 - Lipopeptid Deacylase

Info

Publication number: DE69121018T2
Application number: DE69121018T
Authority: DE
Inventors: Adam Joseph Kreusman; Wu-Kuang Yeh
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1990-06-07
Filing date: 1991-06-03
Publication date: 1996-12-19
Anticipated expiration: 2011-06-04
Also published as: DE69121018D1; HU215232B; HUT61587A; TW197471B; KR0169994B1; US5573936A; DK0460882T3; IL98349A; EP0460882A2; KR920000919A; GR3021292T3; IE75885B1; IL98349A0; CA2043762C; ES2089133T3; ATE140728T1; EP0460882A3; CA2043762A1; HU911897D0; IE911939A1

Description

Die Erfindung betrifft die Enzymtechnologie. Insbesondere betrifft sie eine Lipopeptiddeacylase in gereinigter Form, die von dem Organismus Actinoplanes utahensis gebildet wird und die lipophilen Seitenkeffen der Antipilzmetaboliten Echinocandin B (ECB), Aculeacin und Analoga von ECB deacyliert.
Echinocandin und Aculeacin sind bekannte cyclische Hexapeptide, die jeweils die Linoleoyl- und Palmitoylseitenketten aufweisen. L. D. Boeck et al., 1988, 3. Antibiot. (Tokyo), 41, 1085-1092, L. D. Boeck et al., 1989, J. Antibiot. (Tokyo), 42, 382-388 und Y. Kimura et al. 1987, Agri. Biol. Chem 51, 1617-1623 berichten von der Deacylierung der Linoleoylgruppe von ECB mit ganzen Zellen von Actinoplanes utahensis und Pseudomonas Arten. H. Takeshima et al., 1989, J. Biocheim 105, 606-610 beschreiben die Reinigung und teilweise Charakterisierung der Deacylase von A. utahensis, die Aculeacin deacyliert.
Strukturelle Modifizierungen der natürlichen Antipilzmittel führten zu potentiell brauchbaren therapeutischen Mitteln, wie Cilofungin und Daptomycin. M. Debono et al., 3. Antibiot. (Tokyo) 42, 389-397, M. Debono et al., 1988, Aim. N.Y. Acad. Sci. 544, 152-167, R.S. Gordee et al., 1988, Ann. N.Y. Acad. Sci. 544, 294-309 und L.D. Boeck et al. 1988, 3. Antibiot. (Tokyo), 41, 1085-1092. Beispielsweise wurde ECB mit ganzen Zellen von A. utahensis unter Abspaltung der lipophilen Acylseitenkette deacyliert, um den Cyclohexapeptidkern von ECB bereitzustellen. Die Reacylierung des Kerns durch chemische Mittel liefert die Acyl-ECB-Verbindungen, wie Cilofimgin, mit verbesserten Antipilzeigenschaften.
Aufgrund des Bedarfs an verbesserten Antipilzmitteln zur Behandlung von systemischen Pizinfektionen sind Verfahren für ihre Herstellung wichtig. Enzymatische Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen sind besonders wünschenswert, da sie irn allgemeinen einfachere und ökonomischere Verfahren darstellen, als chemische Verfahren. Demnach ist die Vertügbarkeit von Enzymen, die für solche Umwandlungen brauchbar sind, äußerst wünschenswert.
Die Actinoplanes utahensis Deacylase wird in gereinigter Form bereitgestellt. Das Enyzin katalysiert die Abspaltung der Linoleoylgruppe von ECB und der Palmitoylgruppe von Aculeacin. Das Fnyzm ist ein Heterodimer, das aus 63 kDa und 18 kDa Untereinheiten besteht, und das optimal bei pH 6,0 und 60ºC aktiv ist. Das Enzym ist zellassoziiert und wird nicht beeinflußt durch Cofaktoren, Metallionchelatbildnern oder Sullhydrykeagenzien.
Das Enzym ist in einem Verfahren zur Herstellung von Cyclohexapeptidkernen und in einem Verfahren zur Herstellung des Cyclopeptidkerns der A21978C Antibiotika brauchbar.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Reinigung des Deacylaseenyms fast bis zur Homogenität, das hydrophobe Interaktion, Kationenaustausch, Farbstoffligandenchromatographien und Gelfiltrationen umfaßt.
Die durch die Erfindung bereitgestellte Deacylase von Actinoplanes utahensis wird hierin einfach als ECB Deacylase bezeichnet. Das Enzym, das im wesentlichen vollkommen zellassoziiert ist, hat in seinem gereinigten Zustand die folgenden physikalischen, katalytischen und kinetischen Eigenschaften.
Die ECB Deacylase ist ein 81 Kilodalton (kDa) Heterodinier, das 63 kl)a und 18 kDa Untereinheiten umfaßt. Die aminoterminale Sequenz der großen und kleinen Untereinheiten lauten jeweils folgendermaßen.
Ser-Asn-Ala-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ala-Gln-Ala-Thr-Val-Asn-Gly-Ser-Gly-Met-Val-Leu-Ala-Asn- Pro-His-Phe-Pro-(Trp)-Gln--- Ma-Glu-(Arg)-Phe-Tyr
His-Asp-Gly-Gly-Tyr-Ala-Ala-Leu-Ile-Arg-Arg-Ser-Tyr-Gly-Val-(Pro)-His-Ile-Thr-Ala-Asp- Asp-Phe
In den obigen Sequenzen zeigen die Aminosäurereste in Klammern vermutliche Zuordnungen all, während "---" anzeigt, daß der Rest noch nicht identifiziert wurde.
Die Aininosäurezusammensetzung des gereinigten Enzyms ist im folgenden in der Tabelle I gezeigt. Die Zusammensetzung wurde durch das von J.E. Dotzlaf und W-K Yeh, 1987, J. Bacteriol. 169, 1611-1618 beschriebene Verfahren bestimmt. Tabelle I Aminosäurezusammensetzung der A. utahensis Deacylase Aminosäure Anzahl der Rest pro Dalton a Bestimmt durch Extrapolation auf den Zeitpunkt Null der Hydrolyse b Bestimmt durch Cysteinsäure c Bestimmt durch Hydrolyse in Gegenwart von mioglykolsäure
Das durch Gelfiltration mit Ultrogel AcA 44 bestimmte Molekulargewicht der ECB Deacylase beträgt 46 000. Die Molekulargewichte der oben beschriebenen Untereinheiten wurden durch SDS-PAGE bestimmt. Das durch Gelfiltration bestimmte Molekulargewicht ist eine deutliche Unterschätzung, die auf ein anormales Gelelutionsverhaken des Enyzms zurückgeführt werden kann. Das anormale Elutionsverhalten des Enzyms am Gel ist typisch für ein membrangebundenes Protein, das der gewöhnlich hohen Hydrophobizität des Makromoleküls zugeschrieben werden kann.
Die ECB Deacylase ist ein einfaches Enzym (obwohl es zwei Untereinheiten enthält), das exogen kein Phospholipid, keinen Cofaktor, kein Metallion oder Reduktionsmittel für die Expression seiner Aktivität benötigt. Ferner stimuliert keiner der gewöhnlichen Cofaktoren, Metallionen oder Reduktionsmittel die Deacylase. Überraschenderweise fördert N-Ethylmaleinimid (NFM) die Umwandlungsrate von ECB zum ECB-Kern um das etwa 6-7 fache und die gereinigte Deacylase.
Eine wichtige Eigenschaft der gereinigten Deacylase ist deren erhöhte Aktivität in Gegenwart von hohen Salzkonzentrationen. Die Aktivität wird bis zum dreifachen in Gegenwart von mehreren gewöhnlichen mono- und divalenten Metallsalzen erhöht. Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Natrium- oder Kaliumnitrat sind unter anderem solche stimulierenden Salze. Ein bevorzugtes Salz für diesen Zweck ist Kaliumchlorid. Salzkonzentrationen von etwa 0,1 moh bis zu 3,0 mol/l scheinen am bevorzugtesten zu sein. Eine erhöhte Aktivität wird bei niedrigeren Salzkonzentrationen beobachtet.
Die fehlende Auftrennung, die für die Deacylase durch Nativ-PAGE bei pH 7 und 9 beobachtet wird, deutet an, daß der isoelektrische Punkt des Enyzins über 9 liegt. Die Nativ-PAGE wird gemäß P.J. Blackshear (1984) Methods Enzymol., 104, 237-255 durchgeführt.
Das zur Untersuchung der kinetischen und katalytischen Eigenschaften des gereinigten Enzyms verwendete Substrat ist Echinocandin B (ECB). ECB ist im wesentlichen in wäßrigen Lösungen unlöslich. Unter mehreren wassermischbaren Lösemitteln, die für die Solubilisierung von ECB in wäßrigen Medien getestet wurden, ist Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer niedrigen Konzentration von etwa 15 % oder niedriger am kompatibelsten mit der durch die Deacylase katalysierten Reaktion und der anschließenden Analyse der Enzymaktivität durch HPLC.
Das Enyzm ist optimal aktiv bei pH 6,0 und 60ºC in 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; Puffer. Es wurde festgestellt, daß das Enzym mindestens zweimal so aktiv ist, wenn die Reaktion (ECB zum ECB Kern) mit dem Enzym statt dem Substrat gestartet wird.
Der Km der Deacylase für Echinocandin B beträgt durch die Lineweaver-Burk Methode bestimmt 50 µM.
Die Vmax für die ECB Reaktion beträgt 10-11 µmol gebildetes Peptid (ECB Kern) pro Minute pro Milligramm Protein.
Wenn man die Reaktionsstöchiometrie betrachtet, beträgt das Verhältnis von gebildetem ECB Kern zur ECB Abnalune etwa 52,4 %. Das geringe Konversionsverhäknis kann auf das Auftreten einer anderen Reaktion oder möglicherweise auf einen leichten Abbau zurückzuführen sem.
Wie es oben erwähnt wurde, ist die Deacylase von A. utahensis zellassioziiert. Beispielsweise sind in einer typischen 90 Stunden Kulturbrühe von A. utahensis, die eine hohe Gesamtaktivität der ECB Acylaseaktivität aufweist, über 99 % der Deacylaseaktivität zellassoziiert. Weniger als 5 % der zellassoziierten Deacylaseaktivitat wird durch Inkubation der Zellen in 0,01 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 6,0 für einen Tag freigesetzt. Die Erhöhung der lonenstärke dieses und anderer Puffer hat nur eine geringe Wirkung bei der Gewinnung einer löslichen Deacylase. Jedoch wurde festgestellt, daß durch die Behandlung der Zellen mit Salzen, wie Kalium- oder Natriumchlorid, Kalium- oder Natriumnitrat und Magnesium- oder Calciumsalzen eine hohe Ausbeute (60 bis 80 %) löslicher Deacylase realisiert wird. Die Wirkung dieser Salzbehandlung ist in der folgenden Tabelle II gezeigt. Tabelle II Solubilisierung der ECB Deacylase von A. utahensis Zellbehandlung Aktivitätsverteilung (%) Spezifische Aktivität (E/mg Protein) KCl/KH&sub2;PO&sub4; und Ultrabeschallung Überstandsfraktion Pelletfraktion
a A. utahensis Zellen werden in 0,8 M KCl/0,05 M KH&sub2;PO&sub4; oder nur 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; pH 6, resuspendiert, wenn es angegeben ist, kontinuierlich für eine Minute ultrabeschallt, und bei 48 000 x g für eine Stunde zentritugiert.
Die ECB Deacylase wird durch Kultivierung von Actinoplanes utahensis unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen gebildet. Das Fermentationsverfahren und die verwendeten Bedingungen smd bekannt, L.D. Boeck, D.S. Fukuda, B.J. Abbott und M. Debono, 1989, J. Antibiot. (Tokyo), 42, 382-388. Die maximale Produktion der Deacylaseaktivität tritt nach etwa 90 Stunden nach dem Beimpfen des Kulturmediums auf Wie oben und später in Beispiel 1 beschrieben wird das Enzym in roher Form durch Salzbehandlung der ganzen Zellen vorzugsweise mit Kaliumchlorid solubilisiert.
Das rohe solubilisierte Enzym wird fast bis zur Homogenität im erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt, das hydrophobe Interaktionschromatographie, Kationenaustauschchromatographie und Gelfiltrationsschritte umfaßt. Wie oben beschrieben verhält sich die ECB Deacylase als lose zellgebundenes Protein und wird unterschiedlich durch die Behandlung ganzer Zellen von A. utahensis mit einem anorganischen Salz solubilisiert. Vorzugsweise wird Kaliumchlorid verwendet. Die solubilisierte Enzyinlöswlg wird wünschenswerterweise filtriert und das Filtrat wird durch Ultrafiltration konzentriert, um eine konzentriertere Deacylaselösung für die folgenden Schritte bereitzustellen.
Im ersten Schritt des Verfahrens wird der konzentrierte Zellextrakt für eine Stunde auf etwa 60ºC aufgeheizt und wird warm mit 14 % Ammoniumsulfat und 1,2 M Kaliumchlorid behandelt. Die Hitzebehandlung verursacht die Fällung von Proteinen in der Lösung, die bei 60ºC instabil sind. Die ECB Deacylase ist bei 60ºC stabil und bleibt solubilisiert.
Der hitzebehandelte Extrakt wird dann einer hydrophoben Interaktionschromatographie bei einer Temperatur von etwa 25ºC auf einem hydrophoben Interaktionschromatographiematerial unterzogen, wie Lipid-substituierte Agarose, beispielsweise die im Handel erhältliche Octyl- Sepharose (Pharmacia). Die Säule wird mit etwa 0,05 M Kaliumdihydrogenphosphat oder einem anderen geeigneten Puffer, 1,2 M Kaliumchlorid und 14 % Ammoniumsulfat bei pH 6 äquilibriert. Die Säule wird wünschenswerterweise mit demselben Puffer gewaschen und das gebundeile Protein wird mit einem simultanen linearen Gradienten aus KCl (1,2-0,1 M) und (NH4)&sub2;SO&sub4; (14-0%) in 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; Puffer bei pH 6 eluiert. Die ECB Deacylase wird als ein einzelner, asymmetnscher Aktivitätspeak eluiert.
Die etwa 95 % der gesamten Deacylaseaktivität enthaltenden Peakfraktionen werden vereinigt und einer Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen. Die 10-36 % (NH4)&sub2;SO&sub4; Fraktion wird gesammelt und einer Gelfiltration in einem 0,8 M KCl enthaltenden Puffer bei pH 6 unterzogen. Geltypen, die verwendet werden können, können unterschielich sein, jedoch ist Sephacryl 5-200 HR ein geeignetes Gel. Das Enzym wird als ein Hauptaktivitätspeak und ein Nebenaktivitätspeak eluiert. Die Peakfraktionen, die 90 % der Deacylaseaktivität vom Hauptpeak enthalten, werden vereinigt und bei pH 5,6 auf 0,05 M KCl eingestellt. Die vereinigten Fraktionen werden einer Kationenaustauschchromatographie über ein geeignetes Kationenaustauscherharz unterzogen, wie eines der im Handel erhältlichen Trisacrylharze, beispielsweise Trisacryl-CM (IBF Biotechnics). Die Säule wird mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 5,6 und 0,05 M KCl äquilibriert Die Säule wird mit demselben Puffer gewaschen und die gebundenen Proteine werden mit einem linearen KCl Gradienten (0,05 M - 0,5 M) im selben Puffer eluiert. Das Deacylaseenzym eluiert als zwei Aktivitätspeaks.
Die die Deacylaseaktivüät von jedem Peak enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, auf 0,05 M KCl eingestellt und auf ein Farbstoffligandengel aufgetragen, wie Red-Sepharose (Pharmacia, Inc.) oder Dyematrex Blue A (Amicon). Das Gel wird vor der Verwendung mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 6,0 und 0,05 M KCl äquilibriert Die gebundenen Proteine werden vorzugsweise mit einem stufenweisen KCl Gradienten (0,05-2 - 3,3 M) im selben Puffer von der Red- Sepharose oder vorzugsweise mit einem linearen KCl Gradienten (0,05-2,5 M) im selben Puffer vom Blue A Gel eluiert. Man erhält einen breiten und asymmetrischen Aktivitätspeak von der Farbstoftligandenchromatographie.
Die etwa 80 % der gesamten Aktivität enthaltenden Peakfraktionen vom Farbstoffligandengel werden vereinigt und einer Gelfiltration über ein Gel vom Typ wie Ultragel AcA 44 (IBF Biotecbnics) unterzogen, das vorher mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 6,0 und 0,2 M KCl äquilibriert wurde. Das Enzym eluiert als einzelner Aktivitätspeak und die Peakfraktionen, die die gesamte Deacylase enthalten, werden vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen werden auf 0,04 M KCl bei pH 7,0 eingestellt und erneut einer Kationenaustauschchromatographie über ein negativ geladenes Harz, wie Trisacryl-CM unterzogen. Das Harz wird vor der Verwendung mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0 und 0,04 M KCl Puffer äquilibriert und die gebundene Deacylase wird mit einem stufenweisen KCl Gradienten (0,04 - 0,5- 2 M) im selben Puffer eluiert. Man beobachtet einen breiten Aktivitätspeak und einen scharfen Nebenaktivitätspeak. Die Fraktionen aus diesen zwei Aktivitätspeaks des gereinigten Enzyms können bei -70ºC zur weiteren Verwendung gelagert werden.
Während des vorangegangenen achtstufigen Verfahrens zur Reinigung der ECB Deacylase werden zwei Größenformen und zwei Ladungsformen des Enzyms beobachtet. Der mit der letzten Kationenaustauschchromatographie erhaltene Hauptpeak wird durch SDS-PAGE analysiert und zeigt zwei langsam dicht aneinander laufende Banden und zwei schnelle dicht aneinander läufende Banden. Der Nebenpeak aus der Kationenaustauschchromatographie zeigt eine einzelne langsam laufende Bande und zwei schnell laufende Banden. Das Fehlen der zweiten langsam laufenden Bande legt nahe, daß dieses Protein wahrscheinlich ein Abbauprodukt der ersten langsam laufenden Bande ist.
Die durch das ertindungsgemäße Verfahren bereitgestellte gereinigte ECB Deacylase ist in einem Verfahren zur Deacylierung von Lipocyclopeptiden unter Bildung des Cyclopeptidkerns hiervon brauchbar. Insbesondere deacyliert das Enzym die Cyclohexapeptide Echinocandin B und Aculeacin. Ferner spaltet das gereinigte Enzym die Fettsäureseitenkette von den Cyclopeptid A21978 Antibiotikumfaktoren einschließlich Daptomycin ab.
Das ertindungsgemäße Verfahren ist gekennzeichnet durch das Mischen bei einer Temperatur zwischen etwa 25ºC und 75ºC in einem wäßrigen Medium bei einem pH zwischen etwa 5 wid etwa 7 eines durch die Formel A oder B dargestellten Cyclopeptids
mit Echüocandin B Deacylase, worin in Formel A R für Linoleoyl, Myristoyl oder Palmitoyl steht und in Formel B R' für Decanoyl, 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl oder 10- Methyldodecanoyl steht, unter Bereitstellung der Verbindung der Formel A oder B, worin R und R' für Wasserstoff stehen.
Das Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 55ºC und etwa 65ºC durchgeführt. Der pH des Mediums kann mit einem geeigneten Puffer gehalten werden. Ein Salz, wie ein Alkalimetallchlorid, beispielsweise KCl oder NaCl oder ein Alkalimetatrat, beispielsweise KNO&sub3;,scheint eine fördernde Wirkung auf die Aktivität des Enzyms zu haben und kann in das wäßrige Medium eingearbeitet werden. Vorzugsweise ist das Salz KCl in einer Konzentration von etwa 0,05 M bis etwa 3,0 M.
Ein wassermischbares Lösemittel kann auch in dem Fall zum Medium gegeben werden, wenn die Wasserlöslichkeit des Substrats zu gering ist. Beispielsweise hat Echinocandin B eine geringe Löslichkeit in Wasser. Dimethylsulfoxid (DMSO) kann zum Reaktionsmedium gegeben werden, um dessen Löslichkeit zu erhöhen. DMSO ist auch mit der Deacylase kompatibel. Im allgemeinen kann DMSO in Mengen zwischen etwa 5 % und 15 % V/V zugegeben werden, wie dies im Fall von ECB und Aculeacin gezeigt wird.
Das Verfahren wird vorzugweise durch Bilden einer Lösung des Substrats im gepufferten wäßrigen Medium, Erwärmung des Gemisches auf die Reaktionstemperatur und Zugabe des Enzyms durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird gerührt, geschüttelt oder anders bewegt, um einen guten Kontakt von Substrat und Enzym zu gewährleisten. Das Reaktionsgemisch kann von Zeit zu Zeit durch Testen von kleinen Aliquots des Gemisches mittels des später beschriebenen Testverfahrens verfolgt werden. Mternativ dazu kann die Substratlösung zur gepufferten Enzymlösung gegeben werden. Jedoch erhält man im allgemeinen bessere Deacylierungsergebnisse, wenn man das Enzym zum Substrat gibt.
Falls die Reaktion zu langsam läuft oder vorzeitig stoppt, wie dies durch Verfolgung der Reaktion bestimmt wird, kann zusätzlich frisches Enzym zugegeben werden, um die Reaktion zu vervollständigen.
Das Verfahren kann auch mit einer immobilisierten Form des Enzyms ausgeführt werden. Das Enzym kann an einen geeigneten inerten Harzträger gebunden werden und in eine Säule gepackt werden. Die wäßrige gepufferte Lösung kann auf die Säule aufgetragen und mit Puffer durchgewaschen werden. Es kann ein Recycling erforderlich sein, um eine vollständige Umsetzung zu erreichen.
Eine bevorzugte Ausflihrngsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist gekennzeichnet durch die Deacylierung von Echinocandin B (Formel A, R = Linoleoyl) zum Echinocandin B Kern (Formel A, R = H). Eine weitere bevorzuge Ausfiihriingsform ist gekennzeichnet durch die Deacylierung von Aculeacin (Formel A, R = Palmitoyl) zum selben ECB Kern.
Mit der gereinigten Deacylase der Erfindung durchgeführte Substratspezifitätsuntersuchungen zeigen eine ziemlich breite Spezifität für die Cyclopeptide vom Echinocandin B Typ der Formel A und vom A21978 Antibiotikumtyp der Formel B. Die A21978 Substrate sind bekannte Metaboliten, die in der US-A 4 537 717 beschrieben sind. Bestimmte Derivate des ECB Kerns, die durch Acylierung des Kerns hergestellt wurden, sind ebenfalls Substrate für die Deacylase. Beispiele für solche Acylderivate werden durch die obige Formel A dargestellt, wenn R steht für eine 3-Phenylpropionylgruppe, die in der Paraposition durch C&sub7;H&sub1;&sub5;O-(30 %), C&sub5;H&sub1;&sub1;O-(12 %) substituiert ist, eine Phenylacetylgruppe, die in der Paraposition durch C&sub8;H&sub7;O-(30 %) oder eine C&sub1;&sub1;H&sub2;&sub3;C(O)NH-Gruppe (5 %) substituiert ist, eine Benzoylgruppe, die in der Paraposition durch eine C&sub1;&sub1;H&sub2;&sub3;C(O)NH-Gruppe substituiert ist, oder eine Cinnamoylgruppe, die in der Paraposition durch eine C&sub1;&sub1;H&sub2;&sub3;C(O)NH-Gruppe (15 %) substituiert ist. Die Zahlen in Klammern sind die prozentuale Aktivität relativ zur Deacylaseaktivität von 100 % für ECB selbst.
Das folgende Beispiel erläutert und beschreibt die Erfindung weiter, soll deren Schutzumfang jedoch nicht beschränken.

Beispiel 1

Herstellung und Reinigung der ECB Deacylase

A. Fermentation von Actinoplanes utahensis

Actinoplanes utahensis NRRL 12052 wird in einem 150 Lüer Fermenter unter den von L.D. Boeck, D.S. Fukuda, B.J. Abott und M. Debono 1989, 3. Antibiot. (Tokyo), 42, 382-388 beschriebenen Bedingungen angezogen. Zellen, die eine hohe Aktivität an Echinocandin B Deacylase enthalten (90 Stunden nach der Beimpfung) werden durch Zentrifligation geerntet, mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; pH 6,0 gewaschen und zur Enzmisolierung und Reinigung verwendet.

B. Enzymsolubilisierung und Reinigung

Falls nichts anderes angegeben ist werden die folgenden Isolierungs- und Reinigungsverfahren bei einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und 4ºC ausgeführt.
Ein Test mit 100 Litern Fermentationsmedium nach 90 Stunden zeigt, daß im wesentlichen die ganze Deacylaseaktivität zellassoziiert ist. Das in diesem Beispiel verwendete Testverfahren wird später beschrieben.
Frische Zellen (7,9 kg Naßgewicht) werden in 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; pH 6,0 mit 0,8 M KCl in einem Gesamtvolumen von 57 Litern resuspendiert und die Suspension wird kontinuierlich für einen Tag gerührt. Die meiste zellassoziierte Deacylaseaktivität wird durch diese Salzbehandlung unterschiedlich löslich.
Die solubilisierte Deacylase wird durch ein Whatman Nr.1 Papier filtriert und das Filtrat wird auf ein Volumen von 3,3 Litern mit einer Amicon YM 30 Spiralultrafiltrationskartnsche konzentriert. Der konzentrierte Extrakt wird für eine Stunde auf 60ºC erhitzt.
Der hitzebehandelte Enzymextrakt wird mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei einer Konzentration von 14 % und KCl bei 1,2 M behandelt und auf eine Octyl-Sepharosesäule (5 x 36 cm) aufgetragen, die vorher mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 6,0, 1,2 M KCl und 14 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; äquilibriert wurde. Die Säule wird mit zwei Bettvolumen desselben Puffers gewaschen und gebundene Proteine werden mit einem gleichzeitigen linearen Gradienten aus KCl (1,2-0,1 M) und (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (14 - 0 %) in 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 6,0 eluiert. Diese Chromatographie (hydrophobe Interaktionschromatographie) wird bei einer Temperatur von etwa 25ºC durchgeführt. Die ECB Deacylase eluiert als einzelner aber asymmetrischer Aktivitätspeak.
Die 95 % der gesamten Deacylaseaktivität enthaltenden Peakfraktionen werden vereüiigt und mit (NH4)&sub2;SO&sub4; fraktioniert. Die 10-36 % (NH4)&sub2;SO&sub4; Fraktion wird auf eine Sephacryl S-200 HR Säule (5 x 69 cm) aufgetragen, die vorher mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, pH 6,0 und 0,8 M KCl äquilibriert wurde (Puffer A). Die Deacylase wird als ein Hauptaktivitätspeak und ein Nebenaktivitätspeak eluiert. Die Peakfraktionen, die 90 % der Enzymaktivität vom Hauptpeak enthaken, werden vereinigt, bei pH 5,6 auf 0,05 M KCl eingestellt und auf eine Trisacryl-CM Säule (2,5 x 33 cm) aufgetragen, die vorher mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; und 0,05 M KCl bei pH 5,6 (Puffer B) äquilibriert wurde. Die Säule wird mit zwei Bettvolumina Puffer B gewaschen und die gebundenen Proteine werden mit einem linearen KCl Gradienten (0,05-0,5 M) in Puffer B eluiert. Die Deacylaseaktivität eluiert als zwei Aktivitätspeaks.
Die die Deacylaseaktivität von jedem der zwei Peaks enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, wobei ein Pool pro Peak entsteht. Die zwei Enzympools werden auf 0,05 M KCl eingestellt und ein Pool wird auf eine Red-Sepharosesäule (3,2 x 15,5 cm) aufgetragen und der andere auf eine Dyematrex Blue A Säule (2,2 x 22 cm). Beide Säulen wurden vorher mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; und 0,05 M KCl bei pH 6,0 (Puffer C) äquilibriert Nachdem beide Säulen mit zwei Bettvolumina Puffer C gewaschen wurden, wird das gebundene Protein von der Red- Sepharosesäule mit einem stufenweisen KCl Gradienten (0,05-2 - 3,3 M) in Puffer C und von der Blue A Säule mit einem linearen KCl Gradienten (0,05-2,5 M) in Puffer C eluiert. Man beobachtet einen breiten und asymmetrischen Aktivitätspeak von jeder Farbstoffiigandenchromatographie.
Die 80 % der gesamten Deacylaseaktivität des Red-Sepharosepeaks enthaltenden Peakfraktionen werden vereinigt und auf eine Ultragel AcA 44 Säule (1 x 118 cm) aufgetragen, die vorher mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; und 0,2 M KCl bei pH 6,0 (Puffer D) äquilibriert wurde. Die Deacylase eluiert als einzelner Aktivitätspeak.
Die die gesamte Deacylaseaktivität enthaltenden Peakfraktionen werden vereinigt, auf 0,04 M KCl bei pH 7,0 eingestellt und auf eine Trisacryl-CM Säule (1 x 34 cm) aufgetragen, die vorher mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; und 0,04 M KCl bei pH 7,0 (Puffer E) äquilibriert wurde. Nachdem die Säule mit zwei Bettvolumina Puffer E äquilibriert wurde, werden die gebundenen Proteine mit einem stufenweisen KCl Gradienten (0,04-0,5 - 2 M) in Puffer E eluiert. Man beobachtet einen breiten Hauptaktivitätspeak und einen scharfen Nebenaktivitätspeak. Die Fraktionen aus diesen zwei Aktivitätspeaks werden einzeln bei -70ºC gelagert, bis sie benötigt werden.
Die folgende Tabelle III zeigt die Ergebnisse, die mit jedem Isolierungs- und Reinigungsschritt der ECB Deacylase, wie sie oben beschrieben wurden, erhalten wurden. Tabelle III Reinigung der ECB Deacylase Schritt Protein Aktivität Ausbeute Löslicherextrakt Hitzebehandelter Extrakt Octyl-Sepharoseeluat 10-36%(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;fraktion Sephacryls-200 Eluat Trisacryl-CM Eluat, Red-Sepharoseeluat Blueaeluat(B1) Ultrogel AcA 44 Eluat (Ala) Trisacryl-Cmeluat, pH7,0 (Alal) Trisacryl-CM Fluat, pH 7,0 (Ala2)
Wie oben beschrieben werden zwei Aktivitätspeaks bei der ersten und der zweiten Kationenaustauschchromatographie mit Trisacryl-CM beobachtet. Die Fraktionen von jedem der zwei Peaks A und B der ersten Chromatographie werden gesammelt und einzeln wie gezeigt analysiert. Die vereüiigten A Fraktionen werden einer Red-Sepharose Farbstoffiigandenchromatographie (Al) unterzogen, whrend die des zweiten Aktivitätspeaks B der Dyematrex Blue A Farbstoffligandenchromatographie (Bl) unterzogen werden. Wenn die Eluate jeder Farbstoffligandenchromatographie analysiert werden, nimmt die speziiische Aktivität bei der Red-Sepharosebehandlung zu, während sich die spezifische Aktivität bei der Blue A nur leicht erhöht. Demnach wird in diesem Fall das Eluat der Red-Sepharosesäule zur weiteren Reinigung durch Ultrogelfiltration (Ala) gefolgt von einer Kationenaustauschchromatographie mit Trisacryl-CM ausgewählt. Erneut werden die zwei Aktivüätspeaks (Enzymformen), wie bei der vorhergehenden Kationenaustauschchromatographie, gesammelt und getrennt analysiert.

Enzymtest

Der hierin verwendete Test zur Bestimmung und Messung der Decylaseaktivität verwendet Echlnocandin B als Substrat. Ein typisches Reaktionsgemisch von 1 ml für den ECB Deacylasetest enthält 425 µmol ECB und 0,000003 bis 0,003 Einheiten des Enzyms in 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; bei pH 6,0 in Gegenwart von 0,68 M KCl und 15 % DMSO, um die Lösung des ECBs zu bewirken. Die enzymatische Reaktion wird durch die Zugabe des Enzyms gestartet und wird für 20 min bei 60ºC fortgesetzt, bevor sie durch die Zugabe von Phosphorsäure gestoppt wird. Nach einer Zentritugation mit geringer Geschwindigkeit zur Entfernung des präzipitierten Proteins wird die Deacylaseaktivität durch das Verfolgen der Bildung des ECB Kerns bei 225 nm mittels HPLC bestimmt.
Die HPLC Komponenten smd ein IBM PS/2 Model 80 und ein Farbdisplay (IBM, Armonk, N.Y.), ein Water 715 Ultra WISP Probenprozessor (Waters Assoziates, Milford, MA) und ein Beckman System Gold programmierbares Lösemittelmodul 126 und ein Scanningdetektormodul 167 (Beclaman, Fullerton, CA).
Der ECB Kern wird von einer Apex Octadecyl 3 µ Säule (4,6 x 10 cm) (Jones Chromatography, Littleton, Co.) mit einer mobilen Phase aus 3,9 % CH&sub3;CN/0,1 % Trifluoressigsäure und einer Flußrate von 1 ml/min eluiert. Die Kernbildung ist mit der Zeit während den Tests linear. Zweifache HPLC Analysen haben eine mittlere Abweichung von 2-3 %. Wie sie hierin verwendet wird, ist eine Einheit der Enzymaktivität als die Menge an Deacylase definiert, die zur Bildung von emem µmol des ECB Kerns pro Minute aus ECB unter den oben beschriebenen Reaktionsbedingungen erforderlich ist.
Die spezifische Aktivität (Tabelle III) wird als Einheiten pro mg Protein definiert. Der Proteingehalt wird durch das Verfahren von Bradford mittels Rinderserumalbumin als Standard bestimmt (M.M. Bradford (1976), Anal. Biochent 72, 248-254.

Claims

1. Echinocandin-B-Deacylase in gereüiigter Form, die ein 81 Kilodalton Heterodimer mit der folgenden Aminosäurezusammensetzung ist Aminosäure Anzahl der Reste pro 81000 Dalton

die eine spezifische Aktivität zwischen etwa 10 E/mg und etwa 11,25 E/mg aufweist, die eine Untereinheit mit 63 Kilodalton mit der folgenden aminoterminalen Sequenz aufürveist:

Ser-Asn-Ala-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ala-Gln-Ala-Thr-Val-Asn-Gly-Ser-Gly-Met-Val-Leu-Ala-Asn- Pro-His-Phe-Pro-(Trp)-Gln -- Ala-Glu-(Arg)-Phe-Tyr und eine Untereinheit mit 18 Kilodalton mit der folgenden aminoterminalen Sequenz aufweist: His-Asp-Gly-Gly-Tyr-Ala-Ala-Leu- Ile-Arg-Arg-Ala-Ser-Tyr-Gly-Val-(Pro)-His-Ile-Thr-Ala-Asp-Asp-Phe und die bei der Deacylierung von Echinocandin B als Substrat eine optimale katalytische Aktivität bei etwa pH 6, bei etwa 60ºC in 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; Puffer aufweist.

2. Verfähren zur Herstellung der gereüiigten Deacylase nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Schritte 1) Erhitzen einer bei etwa pH 6,0 gepufferten wäßrigen Lösung der rohen Deacylase für etwa eine Stunde bei einer Temperatur von etwa 60ºC, 2) Chroniatographie des bei pH 6,0, 1,2 M KCl und 14 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gepufferten hitzebehandelten Extrakts über ein hydrophobes Interaktionschromatographiematerial, 3) Fraktionierung des 95 % der Deacylaseaktivität enthaltenden Eluats von Schritt 2 durch (NH4)&sub2;SO&sub4; und Abtrennung der 10 % bis 36 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; Fraktion, 4) Gelfiltration dieser (NH4)&sub2;SO&sub4; Fraktion in 0,8 M KCl enthaltendem Puffer mit pH 6,0 und Vereinigen der Eluatsfraktion, die 90 % der Deacylaseaktivität enthält, 5) Chromatographie dieser Fraktionen in einem 0,05 M KCl Puffer mit pH 5,6 auf einem Kationenaustauchchromatographiematerial und Elution dieses Chromatographiematerials mit einem linearen KCl Gradienten (0,05-0,5 M) in diesem Puffer, 6) Einstellen des die Deacylase enthaltenden Eluats von Schritt 5 auf 0,05 M KCl, Chromatographie dieses Eluats auf einem Farbstoftligandenchromatographiematerial in einem Puffer aus 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, und 0,05 M KCl mit pH 6,0 und Elution dieses Chromatographiematerials mit einem linearen KCl Gradienten (0,05 M-2,5 M), 7) Geltiltration der vereinigten Eluatfraktionen von Schritt 6, die 80 % der Deacylaseaktivität enthalten in einem Puffer aus 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; und 0,2 M KCl mit pH 6,0 und 8) Einstellen des die Deacylase enthaltenden Eluats von Schritt 7 auf 0,04 M KCl bei pH 7, Chromatographie dieses Eluats auf einem Kationenaustauscherchromatographiematerial in einem Puffer aus 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; und 0,04 M KCl mit pH 7,0 und Elution der gereinigten Deacylase mit einem stufenweisen KCl Gradienten (0,04-0,5-2 M).

3. Verfahren zur Deacylierung eines Cyclopeptids der Formel A oder B

gekennzeichnet durch Mischen dieses Cyclopeptids bei einer Temperatur zwischen etwa 25ºC und etwa 75ºC in einem wäßrigen Medium bei einem pH zwischen etwa 5 und etwa 7 mit der gereüiigten Deacylase nach Anspruch 1, worin in Formel A R für Linoleoyl, Myristoyl oder Palmitoyl steht und in Formel B R' für Decanoyl, 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl oder 10-Methyldodecanoyl steht, unter Bereitstellung der Verbindung der Formel A oder B, worin R oder R' für Wasserstoff steht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Temperatur bei etwa 55ºC bis etwa 65ºC gehalten wird.

5. Verfähren nach Anspruch 3, worin das wäßrige Medium ein anorganisches Salz enthält, das aus emem Alkalimnetallchlorid oder einem Alkalimetatrat ausgewählt ist.

6. Verfähren nach Anspruch 5, worin das Salz Kaliumchlorid in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 Mbis etwa 3,0 Mist.

7. Verfahren nach Anspruch 3, worin in Formel A R für Linoleoyl steht.

8. Verfahren nach Anspruch 3, worin in Formel A R für Palmitoyl steht.

9. Verfahren nach Anspruch 3, worin in Formel B R' für Decanoyl steht.

10. Verfahren nach Anspruch 3, worin das wäßrige Medium Dimethylsulfoxid in einer Konzentration zwischen etwa 5 % und etwa 15 % enthält.