DE2462373C2

DE2462373C2 - Asparaginyl-glycyl-seryl-glutaminyl-methionin

Info

Publication number: DE2462373C2
Application number: DE2462373A
Authority: DE
Inventors: Seishi Prof. Tokyo Kuwabara; Toru Prof. Tsumita
Original assignee: Mitsui Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Mitsui Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1973-03-28
Filing date: 1974-02-07
Publication date: 1982-08-26
Also published as: DD109879A5; DD114595A5; JPS5328966B2; JPS49118822A; SU582745A3; DE2462373A1; NL7311641A; DE2405907A1; ZA734124B; CA994267A

Description

Die Erfindung betrifft Asparaginyl-glycyl-seryl-glutaminyl-methionin der Formel

H-Asn-Gly-Ser-Gln-Met-OH

Es handelt sich um ein reines Tuberkulinpeptid.

Es ist bekannt, daß das gereinigte Proteindeiivat (PPDs), das von extracellurarem alten Tuberkulin (OT) gereinigt wurde, ausschließlich für die Diagnose von Tuberkulose verwendet wurde. Leider enthält PPDs zusätzlich zu Tüberkulinproteinen andere inaktive Proteine, Nucleinsäuren, Polysaccharide und Fettsäuren. Da reine Tuberkulinproteine nicht erhalten wurden, wurden ihre physikochemischen Eigenschaften und Aminosäuresequenzen nicht bestimmt

Im Rahmen der Erfindung wurden aus den Zellen von Tuberkelbazillen Tuberkulinproteine in kristallinen Formen isoliert. Anschließend wurden die Aminosäuresequenzen der kristallinen Tuberkulinproteine bestimmt. Ferner wurde das aktive Tuberkulinpeptid durch Hydrolyse der kristallinen Tuberkulinproteine erhalten.

Die Tuberkulinproteine werden aus den Zellen von Tuberkelbazillen durch Behandlung der Tuberkelbazil len mit organischen Lösungsmitteln, Digerieren der erhaltenen Materialien mit Nucleasen, Dialysieren der erhaltenen wasserlöslichen Proteine und Fraktionieren der erhaltenen Dialysate durch Chromatographie und/oder Gel-Filtration erhalten.

Die erfindungsgemäß verwendeten Tuberkelbazillen sind Mycobacterium tuberculosis vom Menschen- und Rinder-Typ einschließlich Bacille de Calmette et Gu6rin (BCG) und anderen. Die erhältlichen Tuberkulinproteine hängen von den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Tuberkelbazillen ab. Zum Beispiel setzt sich das kritalline Tuberkulinprotein vom Mycobacterium tuberculosis vom Menschen-Typ, Aoyama B aus 89 Aminosäureresten pro Molekül oder 9 700 g zusammen. Andererseits setzt sich das Tuberkulinprotein aus BCG aus 135 Aminosäureresten pro Molekül oder 13 500 g so zusammen.

Die Tuberkelbazillen werden mit organischen Lösungsmitteln, wie Ketone, Alkohole und Carbonsäuren behandelt Vorzugsweise werden Aceton, Methanol oder Essigsäure vei-wendet Diese Lösungsmittel können selbstverständlich mit Wasser verwendet werden. Die Lösungsmittel-behandelten Materialien werden mit Nucleasen, wie Ribonucleasen und Desoxyribonucleasen digeriert Die wasserlöslichen Proteine werden aus der erhaltenen Mischung abgetrennt und gegen Puffer vom pH 53 bis 7,8 dialysiert, wie ein Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Puffer vom pH 7,0, das Äthylendiamintetraessigsäure enthält oder ein dibasisches Natriumphosphat/monobasisches CaIiumphosphat-Puffer vom pH 7,2, das Äthylendiaminte-' traessigsäure enthält

Die dialysierten Proteine werden durch Chromatographie und/oder Gel-Filtration fraktioniert Vorteilhafter Weise wird insbesondere die Säulenchromatographie unter Verwendur.g von Ionenaustauscher-Cellulose oder die Gel-Filtration unter Verwendung von überbrückten Dextran-Polymeren verwendet Die Ionenaustauscher-Cellulosen, die verwendet werden _ können, um die vorstehenden Dialysate zu fraktionie- || ren, können zum Beispiel sein, Aminoäthyl (AE)-CeIIuIose, Diäthylaminoätiiy] (DEAE)-Cellulose, Triäthylaminoäthyl (TEAE)-Cellulose oder Epichlorhydrin-Triäthanolamin (ECTEOLAJ-Cellulose. Die überbrückten Dextran-Polymere, die verwendet werden körnen, um die vorstehenden Dialysate zu fraktionieren, können zum Beispiel sein, Sephadex® (Handelsname der Pharmacia Co.) der G-Reihen (G-20-G-200) oder Ionenaustauscher-Sephadex, wie Carboxymethyl (CM)-Sephadex, Sulfoäthyl (SE)-Sephadex. Die dialysierten Proteine werden mit den vorstehenden Puffern eluiert

Die kristallinen Tuberkulinproteine sind wasserlöslich, und deren Molekulargewichte — im Bereich von 3 000 bis 35 000 — hängen von der Art der zur Herstellung verwendeten Tuberkelbazillen ab. Tuberkulin-Hauttests zeigen an, daß die erfindungsgemäßen Tuberkulinproteine gegenüber Meerschweinchen, die mit Hitze-abgetötetem Mycobacterium tuberculosis Stamm Aoyama B oder BCG sensibilisiert worden waren, 10 bis 100 mal stärker sind, als dasjenige von PPDs.

Das erfindungsgemäße Tuberkulinpeptid wird durch Hydrolyse der vorstehenden kristallinen Tuberkulinproteine hergestellt und durch Fraktionierung ihrer Hydrolysate durch Chromatographie und/oder Gel-Filtration erhalten.

Die Tuberkulinproteine können chemisch oder enzymatisch hydrolysiert werden. Die chemische Hydrolyse wird mit einer Mineralsäure durchgeführt. Die enzymatische Hydrolyse wird mit einem proteolytischen Enzym, wie Trypsin, Chymotripsb, Pepsin, ™ Papain, bakterielle Proteinasen, Carboxypeptidase A | oder B durchgeführt. ^

Die erhaltenen Hydrolysate werden durch Säulenchromatographie, Papierchromatographie, Hochspannungspapierelektrophorese, Gel-Filtration und dergleichen fraktioniert Die Gel-Filtration wird durch Eluierung mit einem Ammoniumacetatpuffer vom pH 5,9 durch Sephadex® G-25 oder CM-Sephadex, mit einem Pyridinacetatpuffer vom pH 4,5 durch SE-Sephadex C-50 oder mit einem Pyridinacetatpuffer vom pH 3,1 durch Dowex® 50-X2 oder 1-X2 durchgeführt

Das erfindungsgemäße Tuberkulinpeptid ist ein weißer kristalliner Feststoff, der in Wasser löslich ist und ein Molekulargewicht von 535 aufweist Die Tuberkulin-Hauttests zeigen an, daß das erfindungsgemäße Tuberkulinpeptid gegenüber Meerschweinchen, die mit Hitze-abgetötetem Mycobacterium tuberculosis Stamm Aoyama B· oder BCG sensibilisiert worden waren, Aktivitätswerte aufweist, die denjenigen von PPDs annähernd gleich sind.

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung und Reinigung der Tuberkulinproteine und des erfindungsgemäßen Tuberkulinpeptids.

Beispiel 1

Die Kulturzellen (100 g) von Mycobacterium tubercu- | losis Stamm Aoyama B wurden durch Erhitzen auf 120⁰C während 30 Minuten abgetötet Die Zellen wurden durch Filtration von dem Kulturmedium abgetrennt, dann durch Schall auseinandergerissen, bzw. zerrissen und mit Aceton behandelt Der erhaltene

Rückstand wurde mit Ribonuclease und Desoxyribonuclease digeriert, und das digerierte Gemisch wurde zentrifugiert, um die wasserlöslichen Proteine abzutrennen. Die so erhaltenen wasserlöslichen Proteine wurden gegen einen 0,001 molaren tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Puffer vom pH 7,0, der 0,0001 Mol Äthylendiamintetraessigsäure enthielt, dialysierL

Das erhaltene Dialysat wurde auf DEAE-Cellulose chromatographiert Das Eluieren erfolgte in einem Natriumchlorid-Gradienten. Praktisch die ganze Tuberkulin-Aktivität wurde in der zweiten Protein^craktion gefunden. Es wurde weiter auf Sephadex G-200 im

iO gleichen Puffer, wie vorher chromaitographiert und in drei Fraktionen fraktioniert Fast das ganze aktive Material wurde in der Proteinhaupifraktion gefunden. Das aktive Material kristallisierte spontan aus, als die Lösung bei 4° C in der gemischten Lösung desselben Puffers mit gereinigtem Aceton aufbewahrt wurde. Aus 100 g Zellen (Naßgewicht) vom Mycobacterium tuberculosis, Aoyama B, wurden 25 mg kristallines Tuberkulinprotein erhalten.

Das so erhaltene Tuberkuiinprotein war aus 89 Aminosäure-Resten zusammengesetzt, und seine Aminosäure-Sequenz wurde als die folgende ermittelt:

Ii I 4 !» d 7 X ·) |(]

H -Arg-Leu-Leu-Asp-Asp-Thr-Pro-Glu-Val-Lys-

-Cys- · · · -Cys- ■ ■ ■ -Asn-Gly-Ser-Gln-Met- · · · -Ala-Lys- OH

Der Tuberkulin-Hauttest zeigte an, daß dieses Tuberkuiinprotein gegenüber Meerschweinchen, die mit Hitze-abgetötetem Aoyama B oder BCG sensibilisiert worden waren, 100 mal stärker war, als das von PPDs.

Das erhaltene kristalline Tuberkuiinprotein wurde bei 37°C 6 Stunden in einer 1 prozentigen Trypsinlösung bei pH 8,4 enzymatisch hydrolysiert

Die zweidimensionale Hochspannungselektrophorese der erhaltenen Hydrolysate auf Whatman-Papier wurde bei 75 V/cm in einem Pyridinacetat-Puffer vom pH 4,5 durchgeführt, woran sich die Papierchromatographie anschloß, die in Butanol/Essigsäure/Wasser (4/1/4 Volumenteile) durchgeführt wurde.

Die vorstehende Entwicklung führte zur Trennung einiger aktiver Peptide. Eines davon war ein Pentapeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz.

H-Asn-Gly-Ser-Gln-Met-OH

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 erhaltene kristalline Tuberkuiinprotein wurde in einer 0,5prozentigen Chymotripsinlösung hydrolysiert Die erhaltenen Hydrolysate wurden an einer Sephadex® G-25-Säule chromatographiert, wobei mit einem Ammoniumacetat-Puffer vom pH 5,9 eluiert

25

30

35

40 wurde. Die so erhaltenen aktiven Tuberkulinpeptide wurden an einer Dowex® 1-X2-Säule mit Pyridinacetat-Puffer vom pH 3,1 weiter fraktioniert.

Das so erhaltene Tuberkulinpentapeptid war dasselbe wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 wurde aus BCG das aktive Tuberkuiinprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 13 500 hergestellt

Die Aminosäure-Sequenz dieses Tuberkulinproteins, das aus 135 Aminosäure-Resten bestand, wurde ermittelt. Die N-terminalen und C-terminalen Aminosäuren und dessen Primärstruktur waren im wesentlichen dieselben wie in dem Protein aus dem Hitze-abgetöteten Aoyama B.

Tuberkulin-Hauttests zeigten an, daß dieses Tuberkuiinprotein gegenüber Meerschweinchen, die mit Hitzeabgetötetem Aoyama B oder BCG sensibilisiert worden waren, eine annähernd gleiche Aktivität, wie diejenige des Tuberkulinproteins von Hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis Aoyama B aufwies.

Das erhaltene Tuberkuiinprotein wurde wie vorstehend behandelt. Es wurde dasselbe Tuberkuiinpentapeptid wie in Beispiel 1 erhalten.

Claims

Patentanspruch:

Asparagmyl-glycyl-seryl-glutaminyl-methionin der Formel

H-Asn-Gly-Ser-Gln-Met-OH

15

10