DE69028935T2

DE69028935T2 - Methode zur Produktion von Glukagon

Info

Publication number: DE69028935T2
Application number: DE69028935T
Authority: DE
Inventors: Jun Ishizaki; Masaru Shin; Mikio Tamaki; Hiroshi Teraoka; Hiroshige Tsuzuki; Nobuo Yoshida
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1989-02-01
Filing date: 1990-01-30
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2010-01-31
Also published as: HUT54410A; DE69028935D1; CA2008824A1; AU634999B2; JPH03254692A; KR0161656B1; EP0381433B1; HU900614D0; CA2008824C; NZ232255A; DK0381433T3; GR3021965T3; NO900410D0; BR9000445A; NO900410L; ATE144551T1; IL93173A0; ZA90533B; ES2095236T3; EP0381433A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein effizientes Verfahren zur Herstellung von Glucagon durch Präparation eines Glucagon-Fusionsproteins und nachfolgender enzymatischer Behandlung und Gewinnung von Glucagon, eine in dem genannten Herstellungsverfahren verwendete, für Glucagon kodierende DNA-Sequenz, einen die genannte DNA-Sequenz umfassenden Expressionsvektor, und eine Transformante, die diesen Expressionsvektor enthält.
Glucagon ist ein von den A-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas sekretiertes Peptidhormon, welches zusammen mit dem von den B-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas sekretierten Insulin eine wichtige Rolle im Kohlenhydratstoffwechsel spielt. Glucagon ist auch als hyperglykämisch-glykogenolytischer Faktor (HGF) bekannt. Während Insulin den Glucosestoffwechsel verstärkt und Blutzucker-senkend wirkt, führt Glucagon zur Freisetzung von Glucose in das Blut und damit zu einer Steigerung des Blutzukkerspiegels. Aufgrund dieser Eigenschaften ist Glucagon geeignet bei der Untersuchung auf Sekretion von Wachstumshormonen, bei der Diagnose eines Insuloms, der Untersuchung der Glykogenspeicherung, der Notfallbehandlung von Hypoglykämie, der Vorbehandlung bei röntgenologischen und endoskopischen Untersuchungen des Verdauungstrakts, sowie bei anderen klinischen Anwendungen.
Die Aminosäuresequenz von Glucagon ist bereits bekannt. I)as Molekül ist ein einzelkettiges Peptid, welches aus 29 Aminosäureresten aufgebaut ist, beginnend mit Histidin am Aminoterminus und endend mit Threonin am Carboxyterminus (s. Figur 11). Die Aminosäuresequenzen des Glucagons sind beim Menschen, beim Schwein und beim Rind identisch, und daher erfolgt die industrielle Herstellung von Glucagon durch Isolierung und Reinigung aus dem Pankreas von Rindern oder Schweinen. Auf diese Weise hergestellte Glucagonrodukte sind im Handel erhältlich. Darüber hinaus ist die humane, für Glucagon kodierende DNA-Sequenz von James W. White und Grady F. Saunders aufgeklärt worden (Nucleic Acids Research, 14, 4719-4730 (1986)) (s. Figur 11). Deshalb ist der Möglichkeit der wirtschaftlichen Massenherstellung von Glucagon unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken Aufmerksam gewidmet worden.
Das Glucagon ist jedoch, wie bereits erwähnt, ein aus 29 Aminosäureresten zusainmengesetztes kurzkettiges Peptid und weist deshalb eine geringe relative Molekülmasse auf. Wenn derartige Proteine mit geringer relativer Molekülmasse durch rekombinante DNA-Techniken in Wirtszellen direkt exprimiert werden, können sie durch die in den Wirtszellen vorhandenen proteolytischen Enzyme (Proteasen) abgebaut werden. Daher ist die Expression derartiger niedermolekularer Proteine in Kombination mit anderen Proteinen in Form von stabileren Fusionsproteinen geeigneter Größe vorteilhaft. Das Zielprotein kann anschließend durch chemische oder enzymatische Behandlung dieser Fusionspro teine isoliert werden. Beispielsweise wird in der japanischen veröffentlichten Patentanmeldung Nr. 63-284196 ein Verfahren zur Gewinnung von Zielproteinen durch chemische Behandlung von Fusionsproteinen beschrieben. Die chemische Behandlung wird jedoch häufig von unerwünschten Nebenreaktionen begleitet. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Isolierung von Zielproteinen durch enzymatische Behandlung von Fusionsproteinen ist in der japanischen offengelegten Patentveröffentlichung Nr. 62-246600 beschrieben. Diese Veröffentlichung beschreibt die Gewinnung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) durch Behandlung eines EGF enthaltenden Fusionsproteins mit einer Glutaminsäure-spezifischen Protease. Es ist jedoch bekannt, daß das EGF-Molekül vier Glutaminsäurereste enthält, weshalb die Gewinnung von EGF in vollständiger Form unter Verwendung dieses Enzyms schwierig ist und die Ausbeute gering ausfällt. Bis heute ist kein effizientes Verfahren zur Isolierung von Glucagon aus Fusionsproteinen durch diesen Typ von enzymatischer Behandlung bekannt.
Die EP-A-0 189 998 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Glucagon in einem Fusionsprotein, bei dem Glucagon mit einem Leaderpeptid verknüpft wird. Insbesondere lehrt EP-A-0 189 998 die Herstellung von Glucagon in S. cerevisiae.
Die EP-A-0 234 888 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, welches den epidermalen Wachstumsfaktor in Verknüpfung mit einem Leaderpeptid enthält.
N. Kikuchi et al., J. Biochem., Vol 102, S. 607-612, 1987, beschreiben die Verwendung von γ-Interferon als Leaderpeptid.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Glucagon bereitgestellt, mit welchem die zuvor diskutierten und zahlreiche andere Nachteile und Mängel des Standes der Technik überwunden werden, bei dem man ein Fusionsprotein gemäß der folgenden Formel:
X-Glu-Glucagon
herstellt, wobei X eine Leadersequenz ist, die aus der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Phe in Position 95 von humanem Interferon-γ oder der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Ser in Position 135 von humanem Interferon-γ besteht, wobei Glu ein Glutaminsäurerest ist und Glucagon die Aminosäuresequenz von Glucagon repräsentiert, indem man durch Einführung eines Expressionsvektors zur Expression des Fusionsproteins in E. coli erhaltene Transformanten kultiviert, und man E. coli die Expression des Fusionsproteins erlaubt, und man das Fusionsprotein mit einem Enzym behandelt, welches die Peptidbindungen an den Carboxytermini der Glutaminsäurereste spezifisch hydrolysiert, wodurch das Fusionsprotein gespalten wird.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Aminosäuresequenz von Glucagon durch die folgende Formel wiedergegeben:
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Glucagon durch die folgende Vorgehensweise gewonnen, bei dem man:
(a) das Fusionsprotein mit einem geeigneten Denaturierungsmittel oder Tensid solubilisiert,
(b) die Konzentration des Denaturierungsmittels oder Tensids verringert,
(c) der in Stufe (b) erhaltenen Mischung das Enzym zugibt, wodurch eine Reaktionsmischung erhalten wird, die lösliche Intermediate enthält, welche aus dem partiellen Abbau des Fusionsproteins entstanden sind,
(d) die Reaktionsmischung entsalzt, um eine Fraktion zu erhalten, welche die Intermediate und das Enzym, nicht aber das Denaturierungsmittel oder das Tensid enthält,
(e) die Reaktion durch das in der Fraktion enthaltene Enzym zur Freisetzung des Glucagons voranschreiten läßt, und man
(f) das freigesetzte Glucagon isoliert.
Das zur Hydrolyse der Peptidbindungen eingesetzte Enzym ist vorzugsweise die von Staphylococcus aureus abgeleitete Protease V8.
Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor besitzt eine für das oben genannte Fusionsprotein kodierende DNA-Sequenz und führt zu einer effizienten Expression des Fusionsproteins in Escherichia coli-Wirtszellen.
Die erfindungsgemäßen Transformanten werden erhalten, indem der oben genannte Expressionsvektor in eine Escherichia coli Zelle eingeführt wird.
Ein erfindungsgemäß hergestelltes, gereinigtes Glucagon besitzt eine Reinheit von 99 % oder mehr, wobei die Reinheit durch Hochleistungsflüssigchromatographie bestimmt wird.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Glucagon bereitgestellt, bei dem man:
ein Fusionsprotein herstellt, indem man durch Einführung eines Expressionsvektors zur Expression eines Fusionsproteins gemäß Formel (I) in Escherichia coli erhaltene Transformanten kultiviert, und man Escherichia coli die Expression des Proteins der Formel (I) erlaubt:
X-Glu-Glucagon (I),
wobei X eine Leadersequenz ist, die aus der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Phe in Position 95 von humanem Interferon-γ oder der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Ser in Position 135 von humanem Interferon-γ besteht, wobei Glu ein Glutaminsäurerest ist und Glucagon die Aminosäuresequenz von Glucagon repräsentiert, wobei das Glucagon von einer DNA-Sequenz gemäß folgender Formel kodiert wird:
und man das Fusionsprotein mit einem Enzym behandelt, welches die Peptidbindungen an den Carboxytermini Glutaminsäurereste spezifisch hydrolysiert, wodurch das Fusionsprotein gespalten wird.
Demgemäß werden durch die vorliegend beschriebene Erfindung die folgenden Ziele ermöglicht:
(1) Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Glucagon, bei dem ein Glucagon enthaltendes Fusionsprotein hergestellt und das Glucagon durch eine enzymatische Behandlung mit hoher Effizienz gewonnen wird;
(2) Bereitstellung eines wirtschaftlichen Verfahrens zur Herstellung von Glucagon, welches mit natürlichem Glucagon nach dem zuvor genannten Verfahren identisch ist, bei dem eine kleine Menge von Enzymen verwendet wird;
(e) Bereitstellung eines Expressionsvektors, welcher über eine DNA-Sequenz verfügt, die für das zuvor genannte Fusionsprotein kodiert, und Ermöglichung der effizienten Expression der DNA-Sequenz in Escherichia coli, sowie einer Transformante, in die der Expressionsvektor eingeführt worden ist; und
(4) Bereitstellung eines gereinigten Glucagons mit einer Reinheit von 99 % oder mehr.
Zum besseren Verständnis der Erfindung und um zu zeigen, wie diese ausgeführt werden kann, wird, lediglich beispielhaft, auf die folgenden Zeichnungen Bezug genommen:
Figur 1 zeigt die für humanes Glucagon kodierende DNA-Sequenz.
Figur 2a ist ein schematisches Diagramm, welches die Herstellung des bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors Trp pAT huIFNγ/Glucagon verwendeten Plasmids pGA1 veranschaulicht.
Figur 2b ist ein schematisches Diagramm, welches die Herstellung des bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors Trp pAT huIFNγ/Glucagon verwendeten Plasmids Trp pAT huIFNγ/Kallikrein veranschaulicht.
Figur 2c ist ein schematisches Diagramm, welches die Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors Trp pAT huIFNγ/Glucagon veranschaulicht.
Figur 3 zeigt die Basensequenz der für Glucagon kodierenden DNA, welche im Expressionsvektor Trp pAT huIFNγ/Glucagon enthalten ist, sowie die benachbarten Regionen der stromauf- und stromabwärts gelegenen Seiten der DNA.
Figur 4a ist ein schematisches Diagramm, welches die Herstellung des bei der Herstellung des Expressionsvektors Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon verwendeten Plasmids Trp pAT ΔCys huIFNγ veranschaulicht.
Figur 4b ist ein schematisches Diagramm, welches die Herstellung des Expressionsvektors Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon veranschaulicht.
Figur 5 ist ein schematisches Diagramm, welches die Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon veranschaulicht.
Figur 6 ist ein schematisches Diagramm, welches die Herstellung des Expressionsvektors Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon veranschaulicht.
Figur 7a ist ein schematisches Diagramm, welches die Synthese des die für humanes IFNα80A2 kodierende Basensequenz enthaltenden DNA-Fragments durch das PCR-Verfahren veranschaulicht.
Figur 7b ist ein schematisches Diagramm, welches die Amplifikation der für Glucagon kodierenden Gensequenz sowie der stromauf- und stromabwärts gelegenen DNA-Segmente durch das PCR- Verfahren bei der Herstellung des Expressionsvektors Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon veranschaulicht.
Figur 7c ist ein schematisches Diagramm, welches die Herstellung des Expressionsvektors Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon veranschaulicht.
Figur 8 zeigt die DNA-Sequenz von humanem IFNα80A2 und die korrespondierende Aminosäuresequenz.
Die Figuren 9a und 9b sind Darstellungen, in denen die Ergebnisse der Umkehrphasen-HPLC- und Ionenaustausch-HPLC-Analysen des durch die rekombinante DNA-Technik erfindungsgemäß erhaltenen Glucagons veranschaulichen.
Die Figuren 10a und 10b sind Darstellungen, welche die Ergebnisse der Umkehrphasen-HPLC des unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Glucagons veranschaulichen.
Figur 10c ist eine Darstellung, in der das Ergebnis der Umkehrphasen-HPLC des im Handel erhältlichen natürlichen Glucagons dargestellt ist.
Figur 11 zeigt die Aminosäuresequenz von humanem Glucagon und die für dieses Glucagon kodierende humane DNA-Sequenz.
Bei dem durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Fusionsprotein X-Glu-Glucagon wird eine Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Phe in Position 95 von huinanem Interferon- γ oder von Gln in Position 4 bis Ser in Position 135 von humanem Interferon-γ, welche eine hohe Expressionsrate aufweist, als Leadersequenz ausgewählt, welche mit einem X gekennzeichnet ist.
Die Leadersequenz X ist derart, daß, wenn die für X kodierende Basensequenz in E. coli, einen geeigneten Wirt, zur Induktion der Expression eingeführt wird, das Fusionsprotein 20 % oder mehr der gesamten Proteinproduktion ausmacht, und ist ferner derart, daß das Fusionsprotein in der Wirtszelle Granula (d.h. Einschlußkörper) bildet.
Ein Expressionsvektor, der eine für ein Polypeptid kodierende DNA-Sequenz in einer Form besitzt, durch die die oben genannten Sequenzen über einen Glutaminsäurerest mit Glucagon verbunden werden, wird hergestellt, und E. coli wird mit diesem Expressionsvektor transformiert, wodurch die hocheffiziente Expression des Polypeptids in der Form stabiler Fusionsproteingranula ermöglicht wird.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren von Glucagon in der Reihenfolge der einzelnen Verfahrensschritte beschrieben. Die bei diesem Verfahren angewendeten rekombinanten DNA-Techniken können beispielsweise gemäß Darlegung in "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) ausgeführt werden.

Design und chemische Synthese von für Glucagon kodierenden DNA- Sequenzen

Die Aminosäuresequenzen der Glucagone vom Menschen, vom Schwein und vom Rind sind identisch und werden durch die folgende Formel wiedergegeben:
Die für humanes Glucagon kodierende DNA-Sequenz ist z.B. durch James W. White und Grady F. Saunders (oben) aufgeklärt worden. Die Aminosguresequenz von humanem Glucagon und die für dieses Glucagon kodierende humane DNA-Sequenz sind in Figur 11 dargestellt. Obgleich diese DNA-Sequenz erfindungsgemäß eingesetzt werden kann, ist der Einsatz von DNA-Sequenzen, bei denen vorzugsweise Kodons genutzt werden, welche mit hoher Frequenz in E. coli verwendet werden, besonders vorteilhaft. Demgemäß haben die Erfinder eine DNA-Sequenz geschaffen und synthetisiert, welche weitmöglichst Kodons enthält, die in E. coli mit hoher Frequenz verwendet werden. Diese DNA-Sequenz ist in Figur 1 dargestellt.
Die für Glucagon kodierende DNA-Sequenz ist vergleichsweise kurz und kann daher z.B. durch chemische Synthese erhalten werden. Diese synthetische DNA kann hergestellt werden, indem zB. zunächst die in Figur 1 angegebenen 15 Fragmente (Fr 1-15) mit einem automatischen Nukleinsäure-Synthetisiergerät synthetisiert werden, diese Fragmente durch chromatographie wie Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gereinigt werden, jedes Fragment mit Ligase behandelt wird und die Fragmente nach herkömmlichen Verfahren mit DNA-Ligase ligiert werden. Die durch Ligation dieser Fragmente erhaltene DNA wird anschließend durch herkömmliche Verfahren wie Phenol-Extraktion, Ethanol-Präzipitation, Agarose-Gelelektrophorese, etc., isoliert. Die DNA-Fragmente können aus dem Agarosegel durch Elution gewonnen werden, wie sie in Nucl. Acids Res., 8, 253-264 (1980), beschrieben wird.
Unter Verwendung dieser für Glucagon kodierenden DNA-Sequenzen anschließend rekombinante Plasmide (d.h. Expressionsvektoren) hergestellt werden.

Herstellung von Expressionsvektoren

Die Herstellung der Expressionsvektoren der vorliegenden Beschreibung, d.h. (a) Trp pAT huIFNγ/Glucagon, (b) Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon, (c) Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon, (d) Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon comparative, und (e) Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon, wird nachfolgend beschrieben.

(a) Herstellung von Trp pAT huIFNγ/Glucagon

Wie in Figur 2c dargestellt ist, wird der Expressionsvektor Trp pAT huIFNγ/Glucagon unter Verwendung der folgenden drei Komponenten hergestellt:
(1) einem Fragment von 19 Bp, welches eine Basensequenz enthält, die für die vordere Hälfte der Aminosäuresequenz von Glucagon kodiert;
(2) einem Fragment, welches eine Basensequenz enthält, die für die hintere Hälfte der Aminosäuresequenz von Glucagon kodiert; und
(3) dem Vektor Trp pAT huIFNγ/Kallikrein.
Die Struktur des DNA-Fragments (1) wird durch die nachfolgende Formel wiedergegeben:
Dieses Fragment ist zusammengesetzt aus einer DNA-Sequenz, die für die N-terminale Aminosäuresequenz des Glucagons umfassend Histidin (His), Serin (Ser), Glutamin (Gln), Glycin (Gly), plus einen Teil des Threonins (Thr) kodiert, an deren 5'-Ende das Glutaminsäure (Glu)-Kodon GAA angefügt worden ist. Ferner besitzt das Fragment am 5'-Terminus eine Schnittstelle für PstI und am 3'-Terminus eine Schnittstelle für KpnI. Dieses Fragment wird erhalten, indem die beiden Typen von einzelsträngigen, 19 Basen umfassenden Oligonukleotiden, die das Fragment bilden, chemisch synthetisiert und einem Annealing unterzogen werden.
Das Fragment (2) wird erhalten, indem der von ptac12 (Amman et al., Gene, 25, 167, 1983) als Prototyp gemäß Darlegung in Figur 2a hergestellte Klonierungsvektor pGA1 mit Restriktionsenzymen geschnitten wird. In spezifischer Weise wird pGA1 ausgehend von ptac12 anhand der folgenden Vorgehensweise hergestellt. Zunächst wird der durch die folgende Formel dargestellte synthetische Linker (V) in die Schnittstelle PvuII von ptac12 insertiert.
Das auf diese Weise erhaltene Plasmid (d.h. ptac12/SL1; es verfügt stromabwärts der PvuII-Schnittstelle über eine HindIII- Schnittstelle) wird anschließend mit PvuII und HindIII geschnitten, wonach das in Figur 1 dargestellte synthetische Gen von ungefähr 100 Bp insertiert wird. Anschließend wird das auf diese Weise erhaltene Plasmid pGA1 gemäß Darlegung in Figur 2c mit HindIII geschnitten, bevor die Enden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht werden, und das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment wird anschließend mit KpnI geschnitten, wodurch ein 90 Bp langes KpnI-HindIII/Klenow-Fragment entsteht.
Der Vektor Trp pAT huIFNγ/Kallikrein (3) wird wie folgt erhalten: Zunächst wird das Expressionsplasmid für PSTI, welches mit humanem Interferon-γ fusioniert ist (d.h. Trp pAT huIFNγ/PSTI, J. Biochem., 102, 607-612, 1987), gemäß Darstellung in Figur 2b mit SalI und BAP behandelt, und das größere der beiden resultierenden Fragmente (d.h. das SalI-SalI-Fragment) wird gewonnen. In einem getrennten Ansatz wird das Plasmid Trp pAT huIFNγ mit SalI und XbaI gespalten, wodurch ein SalI-XbaI-Fragment erhalten wird. Im nächsten Schritt wird der folgende Oligonukleotid-Adapter VI (enthaltend eine für die Erkennungsstelle (Phe-Arg) von humanem Plasma-Kallikrein kodierende DNA-Sequenz) synthetisiert.
Das vorgenannte SalI-SalI-Fragment, das SalI-XbaI-Fragment und der synthetische Oligonukleotid-Adapter VI werden anschließend mit T4 DNA-Ligase ligiert, um den Plasmidvektor Trp pAT huIFNγ/Kallikrein zu erhalten. Dieser Vektor Trp pAT huIFNγ/Kallikrein verfügt über eine Sequenz, die für das Segment von humanem Interferon-γ bis zum Serinrest an der Position 135 unter Kontrolle des Tryptophan-Promotors kodiert, gefolgt von der im unteren Abschnitt der Figur 2b dargestellten Sequenz im stromabwärts gelegenen Bereich.
Der zuvor genannte Vektor Trp pAT huIFNγ/Kallikrein (3) wird mit XbaI, Klenow-Fragment und PstI behandelt, und das größere der auf diese Weise erhaltenen Fragmente wird mit den zuvor genannten Fragmenten (1) und (2) auf herkömmliche Weise unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert, wodurch der Expressionsvektor Trp pAT huIFNγ/Glucagon erhalten wird (Figur 2c). Die den 5'- und 3'-Termini der für Glucagon kodierenden DNA benachbarten Basensequenzen dieses Expressionsvektors sind in Figur 3 dargestellt.

(b) Herstellung von Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon

Wie in Figur 4b dargestellt ist, wird der Expressionsvektor Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon unter Verwendung der folgenden drei Komponenten hergestellt:
(1) einem Fragment, welches eine Basensequenz enthält, die für die N-terminale Aminosäuresequenz (vordere Hälfte) von ΔCys huIFNγ kodiert;
(2) einem Fragment, welches eine für die C-terminale Aminosäuresequenz (hintere Hälfte) von ΔCys huIFNγ kodierende Basensequenz und eine für Glucagon kodierende Sequenz enthält; und
(3) einem Trp pAT-Vektor.
Wie in Figur 4b dargestellt ist, wird das DNA-Fragment (1) aus dem huIFNγ-Expressionsplasmid Trp pAT ΔCys huIFNγ (vgl. Figur 4a) erhalten, welches aus Trp pAT huIFNγ als Prototyp hergestellt worden war (Kiso to Rinsho, Bd. 20, S. 4029-4034 (1986), Japan). Die Herstellung von Trp pAT ΔCys huIFNγ aus Trp pAT huIFNγ ist wie folgt. Zunächst wird Trp pAT huIFNγ mit ClaI, AvaII und SphI verdaut, wodurch ein ClaI-SphI-Fragment und ein AvaII-SphI-Fragment erhalten wird. Anschließend wird das folgende Oligonukleotid (VII) synthetisiert.
Dieser synthetische Oligonukleotid-Adapter (VII) kodiert für den ersten Teil von ΔCys huIFNγ, beginnend mit den Glutamin (Gln)- und Asparaginsäure (Asp)-Resten am Aminoterminus von ΔCys huIFNγ. Das Oligonukleotid (VII) wird erhalten durch Synthese der beiden angegebenen einzeisträngigen Oligonukleotide mit jeweiligen Längen von 13 bzw. 14 Basen, und durch Annealing der beiden einzelsträngigen Oligonukleotide.
Der Plasmidvektor Trp pAT ΔCys huIFNγ wird anschließend hergestellt durch Ligation des zuvor genannten ClaI-SphI-Fragments, des AvaII-SphI-Fragments und des synthetischen Adapters (VII) mit T4 DNA-Ligase. Nachfolgend wird dieser Vektor Trp pAT ΔCys huIFNγ mit den Restriktionsenzymen ClaI und AsuII ver daut, wodurch ein 275 Bp langes Fragment erhalten wird. Dieses ClaI-AsuII-Fragment kodiert für den Bereich von humanem Interferon-γ, welcher am Glutaminrest an der Position 4 beginnt und bis zu einem Punkt reicht, der mit einer AsuII-Schnittstelle in der Basensequenz korrespondiert.
Das DNA-Fragment (2) ist das kleinere der aus der Spaltung des zuvor unter (a) erhaltenen Expressionsvektors Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon (Figur 2c) mit AsuII und SphI resultierenden Fragmente. Dieses AsuII-SphI-Fragment enthält eine Basensequenz, die für die hintere Hälfte der Aminosäuresequenz von humanem Interferon-γ kodiert, beginnend von dem mit der AsuII-Schnittstelle korrespondierendem Punkt innerhalb der für humanes Interferon-γ kodierenden Basensequenz, und enthält ferner stromabwärts hiervon eine für die Aminosäuresequenz von Glucagon kodierende Basensequenz.
Das DNA-Fragment (3) ist das größere der aus der Spaltung des in Figur 4b dargestellten, zuvor genannten Expressionsplasmids Trp pAT huIFNγ/Glucagon mit ClaI und SphI resultierenden Fragmente. Dieses ClaI-SphI-Fragment enthält die Basensequenz des Tryptophan-Promotors.
Der Expressionsvektor Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon wird erhalten, indem das zuvor genannte ClaI-AsuII-Fragment (1), das AsuII-SphI-Fragment (2) und das ClaI-SphI-Fragment (3) in üblicher Weise unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert werden (s. Figur 4b).
Dieser Vektor Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon besitzt eine Sequenz, die für das Segment von humanem Interferon-γ vom Gln- Rest an Position 4 bis zum Ser-Rest an der Position 135 unter Kontrolle des Tryptophan-Promotors kodiert, gefolgt von der im unteren Abschnitt der Figur 4b dargestellten Sequenz im stromabwärts gelegenen Bereich. Die den 5'- und 3'-Termini der für Glucagon kodierenden DNA in diesem Expressionsvektor benachbarten Basensequenzen sind die selben wie die in Trp pAT huIFNγ/Glucagon, welche in Figur 3 dargestellt sind.

(c) Herstellung von Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon

Wie in Figur 5 dargestellt ist, wird der erfindungsgemäße Expressionsvektor Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon hergestellt von dem unter (b) erhaltenen Expressionsvektor Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon (Figur 4b).
Der Vektor Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon wird in spezifischer Weise anhand der folgenden Vorgehensweise erhalten. Zunächst wird der Vektor Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon mit den Restriktionsenzymen AsuII und PstI geschnitten und mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht. Das größere der auf diese Weise erhaltenen Fragmente (AsuII/Klenow-PstI/Klenow-Fragment) wird anschließend in üblicher Weise mit T4 DNA-Ligase ligiert, wodurch der Vektor Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon erhalten wird.
Dieser Vektor Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon besitzt eine Gensequenz, die für das Segment von humanem Interferon-γ vom Glutamin-Rest an der Position 4 bis zum Phenylalanin (Phe) Rest an der Position 95 von humanem Interferon-γ unter Kontrolle des Tryptophan-Promotors kodiert, und er enthält stromabwärts hiervon im Anschluß an eine für Glycin- und Glutaminsäurereste kodierende zwischengeschaltete Sequenz eines Basensequenz, die für die Aminosäuresequenz von Glucagon kodiert. Die dem 5'-Terminus der für Glucagon kodierenden DNA in diesem Expressionsvektor benachbarte Basensequenz ist in der Figur 5 unten rechts dargestellt.

(d) Herstellung von Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon

Wie in Figur 6 dargestellt ist, wird der Expressionsvektor Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon unter Verwendung der folgenden drei Komponenten hergestellt:
(1) einem Fragment, welches eine Basensequenz enthält, die für huIFNα80A2 kodiert;
(2) einem Fragment, welches eine Basensequenz enthält, die für Glucagon kodiert; und
(3) einem Trp pAT-Vektor.
Wie in Figur 7a dargestellt ist, wird das DNA-Fragment (1) durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Saiki et al., Science, 239, S. 487, 1988) mit Trp pBR huIFNα80A2 (japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 61-56199) als Template erhalten. Zu diesem Zweck werden zunächst zwei einzelsträngige oligonukleotide chemisch synthetisiert, d.h. der 20 Nukleotide umfassende Sense-Primer (VIII) und der 25 Nukleotide umfassende Antisense-Primer (IX), wie sie durch die folgenden Formeln wiedergegeben sind. Sense-Primer Antisense-Primer
Wie in Figur 7a dargestellt ist, korrespondiert der Sense-Primer (VIII) mit dem hinteren Teil des Tryptophan-Promotors, während der Antisense-Primer (IX) mit dem hinteren Teil von huIFNα80A2 korrespondiert. Unter Verwendung dieser Primer wird ein DNA-Fragment, welches eine für huIFNα80A2 kodierende Sequenz enthält, durch Amplifikation des Fragments mit Taq-Polymerase erhalten. Diese DNA-Sequenz wird mit ClaI und PstI geschnitten, wodurch ein ClaI-PstI-Fragment erhalten wird. Dieses ClaI-PstI Fragment enthält eine Gensequenz, die für humanes IFNα80A2 bis zum Alaninrest an der Position 140 kodiert.
Das DNA-Fragment (2) ist das kleinere der aus der Spaltung des oben unter (a) erhaltenen Expressionsplasmids Trp pAT huIFNγ/Glucagon (Figur 2c) mit PstI und BamHI resultierenden Fragmente, wie in Figur 6 dargestellt ist. Dieses PstI-BamHI- Fragment besitzt eine DNA-Basensequenz, die für Cystein, Serin und Glutaminsäure kodiert, sowie eine DNA-Sequenz, die für Glucagon kodiert.
Das DNA-Fragment (3) ist das größere der aus der Spaltung des oben unter (a) erhaltenen Expressionsplasmids Trp pAT huIFNγ/Glucagon (Figur 2c) mit ClaI und BamHI resultierenden Fragmente, wie in Figur 6 dargestellt ist. Dieses ClaI-BamHI- Fragment enthält die Basensequenz des Tryptophan-Promotors.
Der Expressionsvektor Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon wird erhalten, indem das zuvor genannte ClaI-PstI-Fragment (1), das PstI-BamHI-Fragment (2) und das ClaI-BamHI-Fragment (3) in üblicher Weise mit T4 DNA-Ligase ligiert werden (Figur 6). Dieser Vektor Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon besitzt eine Gensequenz, die für das Segment von humanem IFNα80A2 bis zum Alanin (Ala)-Rest an der Position 140 unter Kontrolle des Tryptophan-Promotors kodiert, wobei sich an diese Sequenz stromabwärts die in Figur 6 unten rechts dargestellte Sequenz anschließt. Die gesamte Se quenz von huIFNα80A2 ist in Figur 8 dargestellt.
(e) Herstellung von Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon Wie in Figur 7c dargestellt ist, wird der erfindungsgemäße Expressionsvektor Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon aus dem vorstehend unter (b) beschriebenen Expressionsvektor Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon gebildet. Dies bedeutet, daß dieser Vektor erhalten wird, indem die Basensequenz CTGCAG, welche die einzige PstI-Schnittstelle in diesem Plasmid bildet, unter Verwendung eines eine Fehlpaarung aufweisenden oligonukleotids durch das PCR-Verfahren (oben) in CTCGAG umgewandelt wird. In spezifischer Weise werden das für Glucagon und benachbarte Sequenzen kodierende DNA-Fragment (1) und das größere Fragment (2) des Vektors Trp pAT ΔCys huIFNγ (beide werden nachfolgend beschrieben) mit T4 DNA-Ligase ligiert, um Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon zu erhalten.
Zunächst werden zwei einzelsträngige Oligonukleotide chemisch synthetisiert, d.h. der in den folgenden Formeln wiedergegebene, 21 Nukleotide umfassende Sense-Primer (X), und der 21 Nukleotide umfassende Antisense-Primer (XI): Sense-Primer: Antisense-Primer:
Wie in Figur 7b dargestellt ist, korrespondiert der Sense-Primer (X) mit einer Sequenz an der Verbindungsstelle zwischen huIFNγ und Glucagon, während der Antisense-Primer (XI) mit einer Sequenz korrespondiert, die an der carboxyterminalen Region des Glucagons beginnt und einen Teil der stromabwärts gelegenen Region einschließt
Ein für Glucagon und benachbarte Sequenzen kodierendes DNA- Fragment (1) wird wie folgt erhalten. Unter Verwendung der vorgenannten beiden Primer wird ein für Glucagon und benachbarte Sequenzen kodierendes DNA-Fragment unter Anwendung des oben genannten PCR-Verfahrens mit Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon als Template amplifiziert. Da der Sense-Primer (X) eine Fehlpaarung enthält, weicht die Basensequenz der amplifizierten DNA-Fragmente zum Teil von derjenigen des Template-Vektors ab. Demgemäß wird die PstI-Schnittstelle (CTGCAG), welche in der Basensequenz vorhanden ist, die für die Region kodiert, welche Interferon-γ mit Glucagon verknüpft, in der amplifizierten DNA-Sequenz in eine XhoI-Schnittstelle (CTCGAG) überführt. Als Ergebnis wird das Cystein-Kodon TGC in TCG umgewandelt, welches für einen Serinrest kodiert. Die amplifizierten DNA-Fragmente werden mit XhoI geschnitten, und die geschnittenen Enden werden mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht. Anschließend erfolgt eine Spaltung mit XbaI, wodurch das DNA-Fragment (1) erhalten wird.
Wie in Figur 7c dargestellt ist, wird das größere Fragment (2) des Vektors Trp pAT ΔCys huIFNγ erhalten durch Spaltung des Vektors Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon mit PstI und anschließende Behandlung mit dem Klenow-Fragment. Diese Sequenz wird sodann mit XbaI geschnitten, und das größere der resultierenden Fragmente ist das erforderliche Fragment (2).
Der Expressionsvektor Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon wird anschließend erhalten, indem das zuvor genannte Xho/Klenow-XbaI- Fragment (1) und das PstI/Klenow-XbaI-Fragment (2) auf übliche Weise mit T4 DNA-Ligase ligiert werden.
Dieser Vektor Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon besitzt eine Gensequenz, die für das Segment von humanem Interferon-γ vom Glutaminrest an der Position 4 bis zum Serinrest an der Position 135 unter Kontrolle des Tryptophan-Promotors kodiert, wobei diese Sequenz stromabwärts von der in der Figur 7c unten rechts dargestellten Sequenz begleitet wird.

Transformation von Wirtszellen und Expression

Die zuvor genannten Expressionsplasmide, d.h. (a) Trp pAT huIFNγ/Glucagon, (b) Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon, (c) Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon, (d) Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon und (e) Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon, werden unter Anwendung der in "Molecular Cloning" (oben) beschriebenen Verfahren in geeignete Wirtszellen eingeführt. Die Transformanten werden auf Tetracyclinresistenz selektiert. Die durch Einführung der zuvor genannten Expressionsplasmide (a), (b), (c) und (e) erhaltenen Transformanten produzieren ein Fusionsprotein, welches humanes Glucagon und humanes Interferon-γ oder Analoge derselben enthalten. Die durch Einführung des zuvor genannten Expressionsplasmids (d) erhaltenen Transformanten bilden ein Fusionsprotein, welches humanes Glucagon und IFNα80A2 enthält. Die verwendbaren Wirtsorganismen schließen die E. coli K12-Stämme C600, JM103, AG-1, etc., ein. Der Stamm K12 C600 ist besonders geeignet, und die Verwendung dieses Stammes erlaubt eine besonders effiziente Produktion von humanes Glucagon enthaltenden Fusionsproteinen.
Eine durch Einführung des zuvor genannten Expressionsvektors Trp pAT huIFNγ/Glucagon in den E. coli K12-Stamm C600 erhaltene Transformante wurde mit Trp pAT huIFNγ fused glucagon/C600 bezeichnet und am 20. Januar 1989 nach dem Budapester Vertrag beim Fermentation Research Institute Agency for Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, unter der Zugriffsnummer FERM BP-2250 hinterlegt.
Nach Kultivierung der erfindungsgemäßen Transformanten und Sammlung der Zellen bestätigte eine Western Blotting-Analyse unter Anwendung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- PAGE) mit polyklonalen Anti-Glucagon-Antikörpern, daß in den Wirtszellen tatsächlich humanes Glucagon in Form eines Fusionsproteins exprimiert wird. Dies bedeutet, daß die SDS-PAGE zu Banden von ungefähr 21 kD und ungefähr 14 kD führte, welche mit Fusionsproteinen mit humanem Interferon-γ bzw. Interferon-α korrespondieren. Die immunologische Reaktion dieser unmodifizierten Fusionsproteine mit polyklonalen Anti-Glucagon-Antikörpern wurde durch Western Blotting-Analyse bestätigt. Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ergab 1 l Kulturmischung, in der die Transformanten kultiviert worden waren, ungefähr 3,06 g, 2,43 g, 3,64 g, 0,24 g und 2,45 g Fusionsprotein, wenn die zuvor genannten Expressionsvektoren (a), (b), (c), (d) bzw. (e) zur Transformation des Wirtes verwendet wurden.

Solubilisierung des Fusionsproteins, Hydrolyse durch V8-Protease, Isolierung und Reinigung von Glucagon

Um Glucagon aus den zuvor genannten Fusionsproteinen (X- Glu-Glucagon) zu gewinnen und da das Fusionsprotein in den Wirtszellen in Form von granulärem Protein angesammelt wird, wird dieses granuläre Protein zuerst gewonnen und löslich gemacht.
Hierfür werden beispielsweise die Zellen zunächst durch Zentrifugieren der Kulturmischung in üblicher Weise gesammelt, bevor die Zellen aufgebrochen und pelletiert werden. Diese Niederschläge werden durch Zugabe eines Denaturierungsmittels oder Tensids löslich gemacht. Die zu diesem Zweck anwendbaren Denaturierungsmittel schließen Guanidin (Guanidinchlorid), Harnstoff, etc. ein. Dieses Denaturierungsmittel wird nach Zugabe zu einer Pufferlösung in ausreichender Menge verwendet, um die Niederschläge löslich zu machen. Es können gesättigte Lösungen von Guanidin oder Harnstoff verwendet werden, aber gewöhnlich sind Konzentrationen im Bereich von 6-8 M bevorzugt. Tween 80 (Marke) ist ein für diesen Zweck geeignetes Tensid und sollte gewöhnlich in Konzentrationen von 0,05 bis 0,2 Gew.-% verwendet werden. Unter Berücksichtigung der folgenden enzymatischen Behandlung sollte der pH-Wert der Pufferlösung vorzugsweise nahe dem optimalen pH-Wert des in diesem Verfahren zu verwendenden Enzyms eingestellt werden. Beispielsweise wäre im Falle der Verwendung der von Staphylococcus aureus abgeleiteten Protease V8 (Sigma Chemical Co., Nr. P-8400) als Enzym ein pH-Wert von 7,8 wünschenswert, und daher sollte in derartigen Fällen eine Pufferlösung mit einer starken Pufferkapazität in der Nähe von pH- Wert 7,8, beispielsweise ein Ammoniumhydrogencarbonatpuffer verwendet werden. Wenn das bei der enzymatischen Behandlung zu verwendende Enzym Verunreinigungen wie neutrale Enzyme, etc. enthält, kann der Pufferlösung auch ein Enzym-Inhibitor wie EDTA zugegeben werden, um die Aktivität dieser Verunreinigungen zu inhibieren.
Die das auf diese Weise solubilisierte Material enthaltende Mischung enthält Denaturierungsmittel oder Tenside in einer Konzentration, die ausreichend hoch ist, damit die Wirkung des bei der folgenden enzymatischen Behandlung zu verwendenden Enzyms behindert wird. In derartigen Fällen sollte die Mischung gewöhnlich mit einem geeigneten Verdünnungsmittel wie der zuvor genannten Pufferlösung ohne Denaturierungsmittel oder Tenside verdünnt werden. Das Ausmaß der Verdünnung sollte derart sein, daß der solubilisierte Zustand des Proteins aufrechterhalten werden kann, und daß die bei der nachfolgend beschriebenen enzymatischen Behandlung zu verwendenden Enzyme hinreichend effektiv wirken können. Beispielsweise sollte die Mischung bei Verwendung von Guanidin oder Harnstoff als Denaturierungsmittel derart verdünnt werden, daß die Konzentration dieses Denaturierungsmittels 4 M oder niedriger und vorzugsweise etwa 2 M oder niedriger ist. Es sollte jedoch beachtet werden, daß die Proteinkonzentration in der das solubilisierte Material enthaltenden Mischungen 1-5 mg/ml, vorzugsweise 2-3 mg/ml betragen sollte.
Im nächsten Schritt wird das Glucagon durch enzymatische Behandlung vorn Protein X abgetrennt. Das gewünschte Glucagon ist vorhanden in einer partiell denaturierten, mit dem Protein X über einen dazwischenliegenden Glutaminsäurerest fusionierten Form. Da Glucagon selbst keine Glutaminsäurereste enthält, kann das Glucagon aus dem Fusionsprotein in vollständiger Form freigesetzt werden, indem es mit einem Enzym behandelt wird, welches die Peptidbindung am Carboxyterminus des Glutaminsäurerests spezifisch spaltet. Für diesen Zweck geeignete Enzyme schließen die von Stadhylococcus aureus abgeleitete Protease V8 (Sigma Chemical Co., Nr. P-8400) ein, wobei dieses Enzym jedoch keineswegs die einzige Auswahlmöglichkeit darstellt und prinzipiell jedes Enzym hierzu verwendet werden könnte, welches die Peptid bindung am Carboxyterminus des Glutaminsäurerests spezifisch spaltet. Beispielsweise kann die von Staphylococcus aureus, NPCC Nr. 12600, stammende Protease V8 bevorzugt verwendet werden. Die verwendete Enzymmenge beträgt, bezogen auf die Gesamtmenge an Protein in der zuvor genannten verdünnten Zellpräparation, 1/50 bis 1/1000 (Gew./Gew.), vorzugsweise etwa 1/500 (Gew./Gew.). Die durch Zugabe dieses Enzyms zu der vorgenannten verdünnten Zellpräparation in dieser Weise erhaltene Reaktionsmischung läßt man unter vorsichtigem Rühren der Mischung bei einer Temperatur zwischen gewöhnlicher Raumtemperatur bis 40 ºC für eine Zeitdau er von 30 Minuten bis 7 Stunden reagieren. Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit der zugegebenen Enzymmenge. Wenn das Enzym beispielsweise in einem Verhältnis von ungefähr 1/500 (Gew./Gew.) zugegeben worden ist, ist eine Reaktionszeit von ungefähr 4 Stunden wünschenswert.
Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe einer Säure wie Salzsäure, Essigsäure, etc., wodurch der pH-Wert auf etwa 3 abgesenkt wird, abgebrochen. Die auf diese Weise erhaltene enzymatische Reaktionsmischung enthält das Endprodukt Glucagon und Intermediate mit einer niedrigeren relativen Molekülmasse als derjenigen des Fusionsproteins X-Glu-Glucagon. Diese Intermediate entstehen vermutlich aus der Spaltung von Glutaminsäureresten im Protein X. Diese Intermediate bleiben ebenfalls löslich, selbst wenn die in der Mischung enthaltenden Denaturierungsmittel und Tenside entfernt werden. Die folgenden Faktoren können beispielsweise zur Bildung dieser Intermediate beitragen.
(i) Eine transiente Denaturierung des in der vorgenannten Reaktionsmischung enthaltenden Enzyms durch das Denaturierungsmittel oder Tensid, was zu einer starken Reduktion der enzymatischen Aktivität führt;
(ii) Inhibierung der enzymatischen Wirkung durch die niedermolekularen Abbauprodukte, die durch die Spaltung der Glutaminsäurereste im Protein X gebildet werden; oder
(iii) die Target-Schnittstelle am Target-Glutaminsäurerests in dem Fusionsprotein wird aufgrund der Faltung oder anderer Veränderungen in der höheren Ordnungsstruktur des Proteins weniger empfänglich für die enzymatische Wirkung.
Die Ausbeute an Glucagon kann durch weitere Behandlung und Spaltung dieser Intermediate erhöht werden. Ein wirksames Mittel hierfür schließt die Eliminierung des Denaturierungsmittels oder Tensids wie auch der niedermolekularen Abbauprodukte aus der enzymatischen Reaktionsmischung ein, die durch Spaltung von Glutaminsäureresten im Protein X gebildet worden sind. Die Eliminierung dieser Substanzen kann in wirksamer Weise herbeigeführt werden durch Entsalzungsverfahren wie Gelfiltration, Dialyse, etc., wobei die Gelfiltration ein besonders geeignetes Verfahren darstellt. Die Gelfiltration sollte vorzugsweise unter solchen Bedingungen durchgeführt werden, daß die Enzyme und die Intermediate im Verfahren zur Eliminierung des Denaturierungsmittels oder des Tensids und der niedermolekularen Abbauprodukte in derselben Fraktion eluiert werden. Die durch Gelfiltration erhaltenen und die Intermediate und das Enzym enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, und durch Einstellung des pH-Wertes auf den optimalen pH-Wert des Enzyms wird das Enzym denaturiert und es wirkt auf die solubilisierten Intermediate ein. Das Glucagon wird anschließend durch enzymatische Reaktion unter denselben Bedingungen wie oben freigesetzt.
Das auf diese Weise von dem Fusionsprotein abgespaltene Glucagon wird anhand einer geeigneten Kombination herkömmlicher Techniken gereinigt, wie z.B. durch verschiedene Chromatographieformen wie Gelfiltrations-Chromatographie, Affinititäts Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Gelchromatographie, oder zentrifugale Trennverfahren, etc.
Das oben beschriebene Verfahren zur Gewinnung von Glucagon erfordert zur Spaltung der Glutaminsäurereste eine vergleichsweise kleine Enzymmenge und ist daher wirtschaftlich.
Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ergab 1 l des Kulturmediums, in dem die Transformanten kultiviert worden waren, ungefähr 150 mg, 160 mg und 170 mg an gereinigtem Gluca gon, wenn die zuvor genannten Expressionsvektoren (a), (b) bzw. (e) zur Transformation des Wirtes verwendet wurden. In derselben Weise wurde gereinigtes Glucagon auch aus jenem Fusionsprotein erhalten, welches unter Verwendung der den Expressionsvektor c) oder (d) aufweisenden Transformante exprimiert worden war. Die Reinheit, die Aminosäurezusammensetzung, die Aminosäuresequenz und die biologische Aktivität des in der oben geschilderten Weise erhaltenen gereinigten Glucagons wurden untersucht, und die Ergebnisse bestätigten, daß diese Substanz tatsächlich humanes Glucagon war und keine Verunreinigungen enthielt sowie im Hinblick auf die Aminosäurezusammensetzung als auch auf die biologische Aktivität mit natürlichem Glucagon vollständig identisch war. Das durch das oben beschriebene Verfahren erhaltene Glucagon kann daher beispielsweise bei der Untersuchung auf Sekretion von Wachstumshormen, bei der Diagnose eines Insuloms, der Untersuchung der Glykogenspeicherung, der Notfallbehandlung von Hypoglykämie, der Vorbehandlung bei röntgenologischen und endoskopischen Untersuchung des Verdauungstrakts sowie bei anderen klinischen Anwendungen genauso verwendet werden wie herkömmliche Typen von Glucagonpräparaten.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verfahren zur Herstellung von humanem Glucagon in Form eines Fusionsproteins beschränkt. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Vektoren zur Expression des genannten Fusionsproteins sowie Transformanten ein, die durch Einführung dieser Vektoren erhalten werden.
Demgemäß wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäß obiger Darlegung bereitgestellt, um aus Fusionsproteinen der Form X-Glu-Glucagon durch ein einfaches, effizientes und wirtschaftliches Verfahren unter Verwendung lediglich kleiner Enzymmengen ein mit natürlichem Glucagon identisches Glucagon zu erhalten. Dieses Glucagon wird durch Nutzbarmachung von rekombinanten DNA-Techniken gebildet und kann daher in großen Mengen zu niedrigen Kosten produziert werden. Darüber hinaus birgt die klinische Verabreichung aufgrund der vollständigen Identität der Aminosäuresequenz des vorliegenden Produkttyps mit derjenigen von natürlichem humanen Glucagon kein Risiko von allergischen Reaktionen, und das Produkt kann daher genauso verwendet werden wie die bisher üblicherweise in der klinischen Praxis verwende ten Glucagonpräparate.

Beispiel

Die nachfolgend beschriebenen Experimente der Gen-Rekombination erfolgten in Übereinstimmung mit den Verfahren gemäß "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Alle verwendeten Enzyme wurden von Takara Shuzo Co., Ltd., bezogen.

(A) Design und chemische Synthese einer für Glucagon kodierenden DNA-Sequenz

Die für die Aminosäuresequenz von humanem Glucagon kodierende DNA-Sequenz wurde unter prinzipieller Verwendung der von E. coli mit höchster Frequenz genutzten Kodons entworfen. Die auf diese Weise geschaffene DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz von dem ersten Histidinrest bis zum 29. Threoninrest kodiert, ist in Figur 1 dargestellt.
Die in Figur 1 angegebenen 15 kurzkettigen Fragmente wurden unter Verwendung eines automatisierten Nukleinsäure-Synthesizers chemisch synthetisiert. Diese Fragmente wurden anschließend einem Annealing unterzogen, wodurch die in Figur 1 dargestellte DNA-Sequenz mit der doppelsträngigen Struktur erhalten wurde. Diese DNA-Sequenz besitzt ein für Methionin kodierendes ATG- Kodon sowie eine Alui-Schnittstelle am 5'-Terminus, und zwei TAA-Terminations-Kodons und eine HindIII-Schnittstelle am 3'- Terminus.

(B) Herstellung eines Expressionsvektors

Durch Anwendung des folgenden Verfahrens wurden fünf Plasmidvektoren hergestellt, die in der Lage sind, humanes Glucagon in E. coli zu exprimieren, d.h. (a) Trp pAT huIFNγ/Glucagon, (b) Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon, (c) Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon, (d) Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon und (e) Trp pAt ΔCysII huIFNγ/Glucagon.

(a) Herstellung von Trp pAT huIFNγ/Glucagon

Dieser Expressionsvektor wurde hergestellt, indem die nachfolgend unter (1)-(3) erhaltenen DNA-Fragmente ligiert wurden.
Die Herstellung dieses Expressionsvektors ist schematisch in den Figuren 2a-2c dargestellt.
(1) Ein 19 Bp langes PstI-KpnI-Fragment, welches die für die vordere Hälfte der Aminosäuresequenz von Glucagon kodierende Basensequenz enthält, wurde wie folgt hergestellt. Diese Basensequenz wurde geschaffen durch Hinzufügung des Kodons GAA für Glutaminsäure und einer PstI-Schnittstelle an den 5'-Terminus der für die vordere Hälfte des Glucagons, bestehend aus Histidin, Serin, Glutamin, Glycin und einem Teil eines Threonin-Kodons, kodierenden DNA-Sequenz, und durch Schaffung einer KpnI- Schnittstelle am 3'-Terminus. Diese Basensequenz ist vorstehend in Formel (IV) dargestellt. Anschließend wurden die beiden 19 Nukleotide umfassenden Oligonukleotide zur Bildung dieser Basensequenz chemisch synthetisiert und einem Annealing unterzogen, wodurch ein 19 Bp langes Fragment erhalten wurde, das eine Basensequenz, die für die vordere Hälfte der Aminosäuresequenz von Glucagon kodiert, sowie eine PstI-Schnittstelle stromaufwärts und eine KpnI-Schnittstelle stromabwärts enthält.
(2) Ein Koni-HindIII/Klenow-Fragment des Plasmids pGA1 wurde wie folgt hergestellt. Wie in Figur 2a dargestellt ist, wurde der Klonierungsvektor pGA1 unter Verwendung des Plasmids ptac12 (oben) als Prototyp wie folgt hergestellt. Zunächst wurde der in der obigen Formel (V) dargestellte 15 Bp lange synthetische Linker in die Schnittstelle PvuII von ptac12 insertiert, wodurch ein Plasmid (ptac12/SL1) mit einer HindIII-Schnittstelle stromabwärts der PvuII-Schnittstelle geschaffen wurde. Dieses Plasmid ptac12/SL1 wurde anschließend mit PvuII und HindIII geschnitten, und das oben unter (A) erhaltene synthetische Gen von ungefähr 100 Bp (d.h., die in Figur 1 dargestellte DNA-Sequenz) wurde insertiert, wodurch ein Plasmid mit der Bezeichnung pGA1 erhalten wurde.
Im nächsten Schritt wurde das Plasmid pGA1 wie in Figur 2c dargestellt mit HindIII verdaut und mit dem Klenow-Fragment zur Schaffung glatter Enden behandelt, wonach das geschnittene Plasrnid mit KpnI gespalten und das kürzere der auf diese Weise erhaltenen Fragmente, d.h. ein 90 Bp langes KpnI-HindIII/Klenow- Fragment gewonnen wurde. Wie in Figur 1 dargestellt ist, kodiert dieses KpnI-HindIII/Klenow-Fragment für die hintere Hälfte der Aminosäuresequenz von Glucagon, beginnend von der KpnI-Schnittstelle an einer intermediären Position in der vorgenannten Basensequenz, die für die Aminosäuresequenz von Glucagon kodiert.
(3) Ein XbaI-PstI-Fragment des Plasmidvektors Trp pAT huIFNγ/Kallikrein wurde in der folgenden Weise hergestellt. Wie in Figur 2b dargestellt ist, wurde ein Expressionsplasmid für ein Fusionsprotein, gebildet durch humanes Interferon-γ und PSTI (Trp pAT huIFNγ/PSTI, J. Biochem., 102, 607-612, 1987 (oben)) 1 Stunde lang bei 37 ºC mit SalI verdaut, wonach das Produkt 2 Stunden lang bei 37 ºC mit BAP behandelt wurde, bevor das größere Fragment (SalI-SalI-Fragment) isoliert wurde. In einem getrennten Ansatz wurde das Plasmid Trp pAT huIFNγ mit SalI und XbaI verdaut, und das kleinere XbaI-SalI-Fragment wurde gewonnen. Anschließend wurden das vorgenannte SalI-SalI-Fragment, das vorgenannte XbaI-SalI-Fragment und der zuvor durch die Formel (VI) bezeichnete synthetische Oligonukleotid-Adapter (enthaltend eine für die Erkennungsstelle (Phe-Arg) von humanem Plasma Kallikrein kodierende DNA-Sequenz) mit T4 DNA-Ligase ligiert.
Der auf diese Weise geschaffene Plasmidvektor erhielt die Bezeichnung Trp pAT huIFNγ/Kallikrein. Dieser Vektor Trp pAT huIFNγ/Kallikrein enthält eine Gensequenz, die für das Segment von humanem Interferon-γ bis zum Serinrest an der Position 35 unter Kontrolle des Tryptophan-Promotors kodiert, stromabwärts gefolgt von der in Figur 2b unten dargestellten Sequenz. Nach Spaltung dieses Vektors Trp pAT huIFNγ/Kallikrein mit XbaI gemäß Darstellung in Figur 2c wurden die geschnittenen Enden mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht. Im nächsten Schritt wurde dieses Fragment mit PstI geschnitten, und das größere der resultierenden DNA-Fragmente (XbaI-PstI-Fragment, 3,6 kbp) wurde isoliert.
Die vorgenannten DNA-Fragmente (1)-(3) (welche jeweils durch Agrarose-Gelelektrophorese in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß Nucleic Acids Res., 8, 253-264, 1980, isoliert worden waren) wurden gemäß Darstellung in Figur 2c mit T4 DNA- Ligase ligiert, wodurch ein Expressionsvektor erhalten wurde, der die Bezeichnung Trp pAT huIFNγ/Glucagon erhielt. Im nächsten Schritt wurde die Basensequenz des DNA-Fragments, welches in dieses Expressionsplasmid eingeführt worden war, in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5464-5467, 1977, untersucht, wobei nachgewiesen wurde, daß das besagte DNA-Fragment tatsächlich in korrekter Weise für die gesamte, 29 Aminosäuren umfassende Sequenz von humanem Glucagon kodiert. (b) Herstellung von Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon Dieser Expressionsvektor wurde hergestellt, indem die nachfolgend unter (1)-(3) erhaltenen drei DNA-Fragmente ligiert wurden. Die Herstellung dieses Expressionsvektors ist schematisch in den Figuren 4a und 4b dargestellt.
(1) Ein ClaI-AsuII-Fragment des Expressionsplasmids Trp pAT ΔCys huIFNγ für humanes Interferon-γ wurde wie folgt hergestellt. Das besagte Expressionsplasmid Trp pAT ΔCys huIFNγ für humanes Interferon-γ wurde gemäß Darstellung in Figur 4a mit Trp pAT huIFNγ (oben) als Prototyp hergestellt. Zunächst wurde Trp pAT huIFNγ mit ClaI, AvaII und SphI geschnitten, wodurch ein ClaI-SphI-Fragment und ein AvaII-SphI-Fragment erhalten wurden. Zusätzlich wurde der zuvor genannte synthetische Oligonukleotid- Adapter (VII) synthetisiert. Anschließend wurden dieses ClaI- SphI-Fragment, das AvaII-SphI-Fragment und der synthetische Adapter (VII) mit T4 DNA-Ligase ligiert. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung Trp pAT ΔCys huIFNγ.
Im nächsten Schritt wurde dieses Plasmid Trp pAT ΔCys huIFNγ gemäß Darstellung auf der rechten Seite der Figur 4b 1 Stunde lang bei 37 ºC mit ClaI und AsuII verdaut, und es wurde aus dem Produkt ein Fragment von 275 Bp (ClaI-AsuII-Fragment) isoliert.
(2) Ein AsuII-SphI-Fragment des oben unter (a) erhaltenen Expressionsplasmids Trp pAT huIFNγ/Glucagon wurde hergestellt, indem Trp pAT huIFNγ/Glucagon 1 Stunde lang bei 37 ºC mit AsuII und SphI verdaut und das kleinere Fragment anschließend isoliert wurde.
(3) Darüber hinaus wurde ein ClaI-SphI-Fragment des oben unter (a) erhaltenen Expressionsplasmids Trp pAT huIFNγ/Glucagon hergestellt, indem Trp pAT huIFNγ/Glucagon 1 Stunde lang bei 37 ºC mit ClaI und SphI verdaut und anschließend das größere Fragment isoliert wurde.
Die vorgenannten DNA-Fragmente (1)-(3) (welche jeweils durch Agarose-Gelelektrophorese nach dem Verfahren gemäß Nucleic Acids Res., 8, 253-264, 1980, isoliert worden waren) wurden gemäß Darstellung in Figur 4b mit T4 DNA-Ligase ligiert, wodurch ein Expressionsvektor erhalten wurde, der die Bezeichnung Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon erhielt. Im nächsten Schritt wurde die Basensequenz des DNA-Fragments, welches in diesen Expressionsvektor Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon eingeführt worden war, in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5464-5467, 1977, untersucht, wodurch nachgewiesen wurde, daß dieses DNA-Fragment tatsächlich in korrekter Weise für die gesamte, 29 Aminosäuren umfassende Sequenz von humanem Glucagon kodierte.

(c) Herstellung von Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon

Ein Expressionsvektor wurde wie folgt hergestellt. Die Vorgehensweise zur Herstellung dieses Expressionsvektors ist in Figur 5 schematisch dargestellt.
Das oben unter (b) erhaltene Expressionsplasmid Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon wurde 1 Stunde lang bei 37 ºC mit AsuII und PstI geschnitten, und die geschnittenen Enden wurden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht. Das größere der resultierenden Fragmente (AsuII/Klenow-PstI/Klenow-Fragment) wurde anschließend mit T4 DNA-Ligase religiert, wodurch ein Expressionsvektor erhalten wurde, der die Bezeichnung Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon erhielt. Im nächsten Schritt wurde die Basensequenz des DNA-Fragments, welches in das Expressions plasmid Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon eingeführt worden war, in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5464-5467, 1977, untersucht, wodurch bestätigt wurde, daß dieses DNA-Fragment tatsächlich in korrekter Weise für die gesamte, 29 Aminosäuren umfassende Sequenz von humanem Glucagon kodierte.

(d) Herstellung von Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon

Dieser Expressionsvektor wurde hergestellt, indem die nachfolgend unter (1)-(3) erhaltenen drei DNA-Fragmente ligiert wurden. Die Herstellung dieses Expressionsvektors ist schematisch in Figur 6 dargestellt.
(1) Ein eine für huIFNα80A2 kodierende Basensequenz enthaltendes ClaI-PstI-Fragment wurde wie folgt hergestellt. Zunächst wurden zwei einzelsträngige oligonukleotide synthetisiert, d.h. ein 20 Nukleotide umfassender Sense-Primer (Formel (VIII), oben), welcher mit dem hinteren Bereich des Trp-Promotors des Expressionsplasmids Trp pBR huIFNα80A2 (oben) für humanes IFNα80A2 korrespondiert, und ein 25 Nukleotide umfassender Antisense-Primer (Formel (IX), oben), der für den hinteren Bereich von huIFNα80A2 kodiert. Unter Verwendung dieser Primer und der Taq-Polymerase wurde ein eine für huIFNα80A2 kodierende Basensequenz enthaltendes DNA-Fragment erhalten, indem das Fragment nach dem PCR-Verfahren (oben) amplifiziert wurde. Dieses amplifizierte Fragment wurde 1 Stunde lang bei 37 ºC mit ClaI und PstI verdaut, und das resultierende ClaI-PstI-Fragment wurde isoliert.
(2) Ein eine für Glucagon kodierende Basensequenz enthaltendes PstI-BamHI-Fragment wurde hergestellt, indem das oben unter (a) erhaltene Expressionsplasmid Trp pAT huIFNγ/Glucagon 1 Stunde lang bei 37 ºC mit PstI und BamHI verdaut und das kleinere Fragment isoliert wurde (Figur 6).
(3) In ähnlicher Weise wurde ein ClaI-BamHI-Fragment des Plasmidvektors Trp pAT huIFNγ/Glucagon hergestellt, indem das oben unter (a) erhaltene Expressionsplasmid Trp pAT huIFNγ/Glucagon 1 Stunde lang bei 37 ºC mit ClaI und BamHI verdaut und das größere Fragment isoliert wurde (Figur 6).
Die vorgenannten DNA-Fragmente (1)-(3) (welche jeweils durch Agarose-Gelelektrophorese in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß Nucleic. Acids Res., 8, 253-264, 1980, isoliert worden waren) wurden mit T4 DNA-Ligase gemäß Darstellung in Figur 6 ligiert, wodurch ein Expressionsvektor erhalten wurde, der die Bezeichnung Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon erhielt. Im nächsten Schritt wurde die Basensequenz des DNA-Fragments, welches in dieses Expressionsplasmid Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon eingeführt worden war, in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5464-5467, 1977, untersucht, wodurch bestätigt wurde, daß dieses DNA-Fragment tatsächlich in korrekter Weise für die vollständige, 29 Aminosäuren umfassende Sequenz von humanem Glucagon kodierte.

(e) Herstellung von Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon

Dieser Expressionsvektor wurde aus dem oben unter (b) erhaltenen Plasmid Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon abgeleitet. Die Herstellung dieses Expressionsvektors ist schematisch in Figur 7c dargestellt.
Zunächst wurden ein 21 Nukleotide umfassender Sense-Primer (Formel (X), oben) und ein 21 Nukleotide umfassender Antisense- Primer (Formel (XI), oben) synthetisiert. Unter Verwendung dieser Primer und der Taq-Polymerase mit Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon als Template wurde unter Anwendung des PCR-Verfahrens ein DNA-Fragment von ungefähr 130 Basenpaaren arnplifiziert. Dieses amplifizierte DNA-Fragment wurde 1 Stunde lang bei 37 ºC mit XhoI verdaut, mit Klenow-Fragment behandelt, und anschließend 1 Stunde lang bei 37 ºC mit XbaI verdaut, wodurch ein DNA-Fragment (1) mit ungefähr 110 Basenpaaren erhalten wurde.
Im nächsten Schritt erfolgte die Herstellung eines DNA- Fragments (2) aus dem Vektor Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon, indem dieser Vektor Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon 1 Stunde lang bei 37 ºC mit PstI verdaut, nachfolgend mit dem Klenow-Fragment behandelt und anschließend 1 Stunde lang bei 37 ºC mit XbaI verdaut wurde, wonach sich die Gewinnung des großen Fragments (2) anschloß.
Der Expressionsvektor Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon wurde hergestellt, indem die oben erhaltenen DNA-Fragmente mit T4 DNA- Ligase ligiert wurden. Im nächsten Schritt wurde die Basensequenz des DNA-Fragments, welches in diesen Expressionsvektor eingeführt worden war, nach dem Verfahren gemäß Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5464-5467, 1977, untersucht, wodurch bestätigt wurde, daß dieses DNA-Fragment tatsächlich in korrekter Weise für die vollständige, 29 Aminosäuren umfassende Sequenz von humanem Glucagon kodierte.

(C) Transformation von Wirtszellen und Genexpression

Unter Verwendung von E. coli K12-Stamm C600 (F&supmin;, thi&supmin;¹, thr&supmin;¹, leuB6, lacY1, tonA21, supE44) als Wirtszellen wurde ene Transformation mit jedem der gemäß obiger Beschreibung hergestellten Expressionsplasmide durchgeführt, d.h. (a) Trp pAT huIFNγ/Glucagon, (b) Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon, (c) Trp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon, (d) Trp pAT huIFNα80A2/Glucagon und (e) Trp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon. Da die Transformanten, in die diese Expressionsplasmide eingeführt wurden, sämtlichst gegenüber Tetracyclin resistent wurden, wurden die Zellen über Nacht bei 37 ºC auf einem tetracyclinhaltigen Medium kultiviert (LB-Plattenmedium enthaltend 15 µg/ml Tetracyclin), wonach die Kolonien bildenden Zellen selektiert wurden. Im nächsten Schritt wurden die Kolonien 24 Stunden lang bei 37 ºC in einem modifizierten M9-Medium weiter kultiviert, wonach die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in einer für die SDS-Gelanalyse geeigneten Pufferlösung suspendiert wurden (0,1 M Tris-HCI, 1 % SDS, 20 % Sucrose und 1 % β-Mercaptoethanol, pH-Wert 6,8). Diese Suspension wurde einer SDS-PAGE zugeführt, und die Bildung eines Glucagon enthaltenden Fusionsproteins wurde untersucht durch Färbung des Gels mit Coomassie-Brillantblue R sowie durch Western Blotting-Analyse unter Verwendung polyklonaler Anti-Glucagon-Antikörper. Die Ergebnisse zeigten, daß in den mit den vorgenannten Expressionsplasmiden (a), (b), (d) und (e) transformierten Wirten ein granuläres Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 21 kD produziert wurde, während die mit dem vorgenannten Expressionsplasmid (c) transformierten Wirte ein granuläres Protein von ungefähr 14 kD bildeten, und überdies, daß die genannten Proteine in dieser Form ohne weitere Modifikation mit Anti-Glucagon-Antikörpern reagierten. Demgemäß bestätigten die Ergebnisse, daß alle Transformanten ein das erwünschte Glucagon enthaltendes Fusionsprotein produzierten.

(D) Solubilisierung des Fusionsproteins, Hydrolyse durch V8- Protease Isolierung und Reinigung von Glucagon

Nachdem die mit den zuvor genannten Expressionsvektoren (a), (b), (c), (d) und (e) transformierten Wirtszellen 24 Stunden lang bei 37 ºC in modifiziertem M9-Medium kultiviert worden waren, wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in Pufferlösung A (8 g/l Natriumchlorid, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 2,9 g/l Dinatriumhydrogenphosphat 12H&sub2;O, 0,2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 5 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol und 10 mM Benzamidin, pH-Wert 6,65) suspendiert. Nach gründlichem Rühren wurde die Suspension zentrifugiert, wonach die auf diese Weise erhaltenen Zellen gewaschen wurden. Die Zellen wurden anschließend in der zuvor genannten Pufferlösung A resuspendiert. Anschließend wurde Lysozym bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/g Zellen (Feuchtgewicht) zugegeben, und man ließ die Mischung 1 Stunde lang bei 35 ºC reagieren. Im nächsten Schritt wurde die Reaktionsmischung mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert, und die granuläre Fraktion wurde in Form eines pelletierten Präzipitats gewonnen. Das Glucagon wurde schließlich aus diesen Sedimenten der granulären Fraktion isoliert durch eine einstufige oder eine zweistufige enzymatische Reaktion, wie sie nachfolgend unter (D-1) bzw. (D-2) beschrieben werden.

(D-1) Isolierung durch einstufige enzymatische Reaktion

Die aus den unter Verwendung des vorgenannten Expressionsvektors (a) transformierten Wirtszellen erhaltenen Niederschläge der granulären Fraktion wurden in Pufferlösung A (enthaltend 6 M Guanidinhydrochlorid) suspendiert, wobei die Menge der Pufferlösung 1/6 des anfänglichen Volumens der verwendeten Zellkultur betrug. Nach gründlichem Rühren und Ultraschallbehandlung ließ man die Mischung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen, um eine Solubilisierung herbeizuführen. Im nächsten Schritt wurde die Fraktion, welche nach dieser Vorgehensweise nicht solubihsiert wurde, durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde anschließend über Nacht gegen Pufferlösung B (50 mM Ammoniumbicarbonat, 5 mM EDTA, pH-Wert 7,8) enthaltend 2 M Guanidinhydrochlorid dialysiert. Das Dialysat wurde anschließend mit einem gleichen Volumen an Pufferlösung B vermischt, um eine Guanidinhydrochlorid-Konzentration von 1 M zu erreichen, und das resultierende Probenmaterial wurde mit (a) bezeichnet. Eine SDS- PAGE-Analyse des Materials (a) ergab, daß 1 g (ungefähr 50 µmol) von humanem Interferon-γ pro Liter Kulturbrühe produziert worden war. Dem Probenmaterial (a) wurde die Protease VB (Sigma Chemical Co., Nr. P-8400), welche von Staphylococcus aureus stammt und in spezifischer Weise die Peptidbindungen von Glutaminsäureresten spaltet, in einem Verhältnis von 1/10 (Gew./Gew.) zugegeben, wobei das Verhältnis auf die Gesamtmenge an in dieser Mischung vorhandenem Protein bezogen ist, und man ließ die Mischung 1 Stunde lang bei 37 ºC reagieren. Da das erwünschte Glucagon mit Interferon-γ über einen Glutaminsäurerest fusioniert ist, und da innerhalb des Glucagonmoleküls keine Glutaminsäurereste vorhanden sind, erlaubt diese Behandlung mit Protease V8 die Abtrennung des gesamten Glucagonmoleküls in vollständiger und unmodifizierter Form. Das auf diese Weise erhaltene Probenmaterial (b) enthielt jedoch auch eine Beimischung von Peptiden verschiedener Länge, die aus dem Abbau von Glucagon und humanern Interferon-γ resultierten. Um diese verschiedenen Größen von Peptidverunreinigungen zu eliminieren, wurde das Probenmaterial (b) zentrifugiert, das Präzipitat entfernt, und der Überstand wurde einer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C&sub1;&sub8;- Säule (4,6 mm i.D. × 250 mm) zugeführt. Das verwendete anfängliche Elutionsmittel war ein gemischtes 32 % Acetonitril-0,1 % Trifluoressigsäure-Lösungsmittel, und die Elution erfolgte unter Steigerung der Konzentration an Acetonitril um 0,5 %/Minute beginnend von den ersten 5 Minuten nach Start der Elution, bis eine Konzentration von 42 % erreicht war.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 9a dargestellt. Unter identischen Bedingungen wurde ein Glucagon-Standard einer HPLC-Analyse zugeführt und an einer Position nachgewiesen, die mit einer Retentionszeit von 19,7 Minuten korrespondiert. Daher wurde die an der Position, welche mit etwa 20 Minuten in Figur 9a korrespondiert, eluierte Fraktion gesammelt, wonach diese Fraktion durch Ionenaustausch-HPLC gereinigt wurde. Die Glucagon enthaltende Fraktion wurde in eine Säule (7,5 mm i.D. × 75 mm) eingeführt, die mit Anionenaustausch-Harz DEAE-5PW gepackt und mit 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5) enthaltend 20 % Acetonitril (Pufferlösung C) gepuffert wurden. Nach dem Waschen für ene Dauer von 5 Minuten mit Pufferlösung C wurde das Material in Pufferlösung C unter Anwendung eines linearen Konzentrations gradienten von 0-0,1 M Natriumchlorid eluiert (d.h., die Konzentration an Natriumchlorid wurde über einen 30minütigen Zeitraum bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min von 0 auf 0,1 M erhöht). Das Ergebnis ist in Figur 9b dargestellt. Auf der Grundlage der eluierten Position des Glucagon-Standards wurde bestätigt, daß die vorherrschende Komponente des Analyts (Retentionszeit 19,3 Minuten, Probenmaterial (b)) Glucagon war. Das Probenmaterial (b) wurde anschließend unter Anwendung der nachfolgend beschriebenen Verfahren einer Analyse über die Aminosäurezusammensetzung und einer Aminosäure-Sequenzierung zugeführt. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in den Tabellen 1 bzw. 2 dargestellt.

Analyse der Aminosäurezusammensetzung

Das Analyt wurde durch HPLC (Aquapore RP-300 column, Brownlee) entsalzt und 24 Stunden lang bei 110 ºC mit 4 M Methansulfonsäure (enthaltend 0,2 % 3-(2-Aminoethyl)indol) hydrolysiert. Die Aminosäurezusammensetzung dieses Hydrolysats wurde anschließend mit Hilfe eines Aminosäureanalysiergerätes mit der Bezeichnung Model 835 von Hitachi bestimmt.

Aminosäuresequenzierung

Nach dem Entsalzen durch HPLC (Aquapore RP-300 column, Brownlee) wurde die Aminosäuresequenz des Analyts bestimmt unter Anwendung eines Protein-Sequenziergerätes mit der Bezeichnung 477A von Applied Biosystems.
Durch das oben beschriebene Reinigungsverfahren wurden ausgehend von 1 g (ungefähr 50 µmol) Fusionsprotein ungefähr 33 mg (etwa 10 µmol) gereinigtes Glucagon erhalten, d.h. ungefähr 33 mg an gereinigtem Glucagon wurden pro Liter Kulturbrühe erhalten. Das vorliegende Verfahren zur Aufreinigung erfordert jedoch eine große Menge an Enzym, um die Peptidbindung des Glutaminsäurerests zu spalten. Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung Tabelle 2 Analyse der Aminosäuresequenz

(D-2) Isolierung durch zweistufige enzymatische Reaktion

Nach dem folgenden Verfahren wurde aus den Pellets der granulären Fraktion, welche aus den mit den zuvor genannten Expressionsvektoren (a), (b), (c), (d) und (e) transformierten E. coli-Zellen erhalten worden waren, Glucagon hergestellt. Zunächst wurde 1 g der sedimentierten granulären Fraktion in ml der Pufferlösung 1 (8 M Guanidinhydrochlorid, 50 mM Ammoniumbicarbonat, 5 mM EDTA und 10 mM DTT, pH-Wert 7,8) gelöst. Anschließend wurden 105 ml der Pufferlösung 2, welche kein Guanidinhydrochlorid enthielt (50 mM Ammoniumbicarbonat, 5 mM EDTA und 10 mM DTT, pH-Wert 7,8), zugegeben, wodurch die Konzentration der Lösung an Guanidinhydrochlorid auf 2 M und die Proteinkonzentration auf 2-3 mg/ml eingestellt wurden (gemessen mit einem Proteinassay-Kit, Biorad Co.). Dieser Lösung wurde sodann die von Staphylococcus aureus abgeleitete Protease VB (Sigma Chemical Co., Nr. P-8400) in einer Menge zugegeben, die 1/500 (Gew./Gew.) der in dieser Mischung vorhandenen Proteinmenge entspricht, und es erfolgte eine Umsetzung unter vorsichtigem Rühren der Mischung bei 25 ºC. Nach 4 Stunden wurde die Reaktion durch Zugabe von Salzsäure, wodurch der pH-Wert der Lösung auf 3,0 eingestellt wurde, abgebrochen. Die Reaktionsprodukte wurden untersucht, indem der Mischung sowohl während als auch nach dem Abbruch der enzymatischen Reaktion Proben entnommen wurden, und die Proben einer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac Protein C&sub4;-Säule (0,46 mm i.D. × 15,0 cm) zugeführt wurden. Das verwendete anfängliche Elutionsmittel war ein gemischtes 25 % Acetonitril-0,1 % Trifluoressigsäure-Lösungsmittel, und die Elution erfolgte, indem die Konzentration an Acetonitril über eine Zeitdauer von 25 Minuten beginnend vom Start der Elution linear bis zu 35 % erhöht wurde. Die Ergebnisse dieser Assays zeigten, daß bei voranschreitender Reaktion sowohl Intermediate aus dem partiellen Abbau des Fusionsproteins als auch kleine Mengen an Glucagon progressiv generiert wurden.
Folglich wurden die in der Reaktionsmischung vorhandenen unlöslichen Stoffe nach der enzymatischen Reaktion mittels Zen trifugation entfernt, und der Überstand wurde durch Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer Sephadex G-15-Säule (5 cm i.D. × 30 cm, Kapazität 590 ml) entsalzt. Das verwendete Elutionsmittel war 50 mM Essigsäurepufferlösung (pH-Wert 3,3), enthaltend 5 mM EDTA, und die hochmolekulare Fraktion, welche die Intermediate und die Protease V8 enthielt, wurde rückgewonnen. Diese Fraktion wurde mit Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt, und es erfolgte erneut eine Umsetzung unter vorsichtigem Rühren der Mischung bei 25 ºC. Demgemäß wurde die Protease V8 in der Reaktionsmischung renaturiert und wirkte auf die Intermediate ein, und innerhalb von ungefähr 5 Stunden war das Glucagon aus den Intermediaten vollständig freigesetzt. Anschließend wurde dieser Reaktionsmischung Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 6 M zugegeben, und der pH-Wert der Mischung wurde sodann mit Essigsäure auf 5,0 eingestellt, wodurch das Endvolumen auf ungefähr 200 ml gebracht wurde. Diese Mischung wurde anschließend einer Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung einer Sephadex-Säule (2,0 cm i.D. × 20,0 cm, Kapazität 63 ml, fast flow-Typ) zugeführt, welche zuvor mit der Pufferlösung 3 (6 M einer mit Essigsäure auf pH-Wert 5,0 eingestellten Harnstofflösung) equilibriert worden war. Die nicht- adsorbierte Fraktion wurde entfernt, indem die Säule nachein ander mit 120 ml der Pufferlösung 3 und anschließend mit 120 ml einer Pufferlösung enthaltend 0,05 M Natriumchlorid gewaschen wurde. Im nächsten Schritt erfolgte die Elution unter Anwendung eines Natriumchloridgradienten mit linearem Konzentrationsverlauf, wodurch die Konzentration an Natriumchlorid in der Pufferlösung 3 von 0,05 auf 0,15 M erhöht wurde (durch Verwendung des Elutionsmittels in einem Volumen, welches der 15fachen Kapazität der Säule entspricht), und das Glucagon wurde mit jem ungefähr 0,1 M Natriumchlorid enthaltenden Puffer eluiert. Die Glucagonfraktion (ungefähr 70 ml) wurde unmittelbar durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer Sephadex G-15- Säule entsalzt, welche mit 50 mM Essigsäure equilibriert worden war (5 cm i.D. × 30 cm, Kapazität 590 ml). In dieser Stufe betrug die Reinheit des Glucagons ungefähr 97-98 %, und demgemäß wurde das Produkt durch Fraktionierung mittels HPLC weiter gereinigt.
Die Glucagon enthaltende Fraktion, welche wie oben be schrieben durch Gelfiltration erhalten worden war, wurde in eine Vydac Protein C&sub4;-Säule (2,2 cm i.D. × 25 cm, 10-15 µm Packung, Porengröße 300 Å) eingeführt, welche mit 25 % Acetonitril-0,1 % Trifluoressigsäure equilibriert worden war, wobei die Trennung und Reinigung von Glucagon durch Anwendung eines linearen Konzentrationsgradienten, durch den die Konzentration an Acetonitril über einen Zeitraum von 120 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min von 25 auf 30 % erhöht wurde, erreicht wurde. Das Glucagon wurde hierdurch etwa 90 Minuten nach Verfahrensbeginn eluiert. Die Ausbeute an auf diese Weise erhaltenem gereinigten Glucagon pro Gramm der pelletierten granulären Fraktion betrug für E. coli-Zellen, die mit den Expressionsvektoren (a), (b) und (e) transformiert worden waren, ungefähr 16,3 mg, ungefähr 21,9 mg bzw. ungefähr 23,1 mg, während die korrespondierenden Ausbeuten pro Gramm Fusionsprotein 49,0 mg, 65,8 mg bzw. 69,4 mg betrugen. Das gereinigte Glucagon wurde auch in einer ähnlichen Weise erhalten( wenn zur Transformation die Expressionsvektoren (c) und (d) verwendet worden waren.
Das aus den mit dem Expressionsvektor (a) transformierten E. coli-Zellen erhaltene Glucagon wurde unter Anwendung der folgenden Verfahren im Hinblick auf (1) Reinheit, (ii) Aminosäurezusammensetzung, (iii) Aminosäuresequenz und (iv) biologische Aktivität analysiert.

(i) Reinheit

Die Reinheit wurde ermittelt durch Umkehrphasen-Chromatographie unter Verwendung einer Vydac Protein C&sub4;-Säule (0,46 cm i.D. × 15,0 cm). Das verwendete anfängliche Elutionsmittel war ein gemischtes 25 % Acetonitril-0,1 % Trifluoressigsäure-Lösungsmittel, und die Elution erfolgte durch lineare Steigerung der Konzentration an Acetonitril über einen Zeitraum von 25 Minuten beginnend mit dem Start der Elution bis zu 35 %. Das auf diese Weise erhaltene HPLC-Diagramm ist in Figur 10a dargestellt, während die Figur 10c das korrespondierende Diagramm für im Handel erhältliches natürliches Glucagon zeigt (Sigma Chemical Co.). Wie der Figur 10a zu entnehmen ist, zeigt das Elutionsdiagramrn der vorliegenden Varietät des gereinigten Glucagons lediglich einen einzigen Peak, und daher enthält dieses Glucagon keine Verunreinigungen (d.h. eine Reinheit von 100 %). Darüber hinaus war die Retentionszeit (23,016 Minuten) zur Elution der vorliegenden Varietät von gereinigtem Glucagon nahezu identisch mit der entsprechenden Zeit für natürliches Glucagon gemäß Darstellung in Figur 10c, d.h. 23,088 Minuten, was darauf hinweist, daß die vorliegende Varietät von Glucagon tatsächlich identisch ist mit dem natürlichen Typ. Das HPLC-Diagramm einer anderen Probe von Glucagon, welche nach dem obigen Verfahren erhalten wurde, ist in Figur 10b dargestellt. Die Retentionszeit zur Elution der vorliegenden Varietät von gereinigtem Glucagon betrug 20,404 Minuten. Die Reinheit dieses Glucagons betrug 99,3 %. Eine Analyse der gereinigten Glucagonpräparate, die aus den mit den Expressionsvektoren (b)-(e) geschaffenen Transformanten erhalten wurden, ergab im wesentlichen die selben Ergebnisse.

(ii) Aminosäurezusammensetzung

Vor der Analyse der Aminosäureszusammensetzung wurde das Analyt 24 Stunden lang bei 110 ºC mit 4 M Methansulfonsäure (enthaltend 0,2 % 3-(2-Aminoethyl)indol) hydrolysiert. Die Aminosäurezusammensetzung dieses Probenmaterials wurde anschließend mit Hilfe eines Aminosäure-Analysiergerätes mit der Bezeichnung Model 835 von Hitachi bestimmt. Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse dieser Analyse zeigen, daß die entsprechenden Aminosäureanteile des gereinigten Glucagons, welches aus den mit dem Expressionsvektor (a) transformierten E. coli-Zellen erhalten wurde, mit den theoretischen Werten identisch waren. Eine Analyse der gereinigten Glucagonpräparate, wie sie aus den mit den Expressionsvektoren (b)-(e) geschaffenen Transformanten erhalten wurden, ergaben im wesentlichen die selben Ergebnisse.

(iii) Aminosäuresequenzierung

Die Aminosäuresequenz des aus den mit dem Expressionsvektor (a) transformierten Wirtszellen erhaltenen gereinigten Glucagons wurde unter Verwendung eines Protein-Sequenziergerätes mit der Bezeichnung 477A von Applied Biosystems bestimmt. Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse dieser Analyse zeigen, daß die Aminosäuresequenzen des gereingten Glucagons, welches aus den mit dem Expressionsvektor (a) transformierten E. coli-Zellen erhalten wurde, mit denjenigen von natürlichem Glucagon identisch waren. Eine Analyse der gereinigten Glucagonpräparate, welche aus den mit den Expressionsvektoren (b)-(e) geschaffenen Transformanten erhalten wurden, ergaben im wesentlichen die selben Ergebnisse. Tabelle 3 Aminosäurezusammensetzung Tabelle 4 Analyse der Aminosäuresequenz

(iv) Biologische Aktivität

Als Hinweise auf die biologische Aktivität wurden ein Rezeptor-Assay unter Verwendung einer Membranfraktion der Rattenleber sowie ein CAMP-Assay unter Verwendung freier Rattenleberzellen und die Freisetzung von Glucose durch perfundierte Leberproben untersucht und analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß das gereinigte Glucagon, welches aus E. coli-Zellen erhalten wurde, welche mit den Expressionsvektoren (a)-(e) transformiert worden waren, in sämtlichen dieser Assays dieselbe Aktivität wie natürliches Glucagon zeigte, wodurch wiederum bestätigt wird, daß diese Produkte mit natürlichem Glucagon identisch sind.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Glucagon, bei dem man ein Fusionsprotein gemäß der folgenden Formel:

X-Glu-Glucagon

herstellt, wobei X eine Leadersequenz ist, die aus der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Phe in Position 95 von humanem Interferon-γ besteht, wobei Glu ein Glutaminsäurerest ist und Glucagon die Aminosäuresequenz von Glucagon repräsentiert, indem man durch Einführung eines Expressionsvektors zur Expression des genannten Fusionsproteins in Escherichia coli erhaltene Transformanten kultiviert, und man Escherichia coli die Expression des Fusionsproteins erlaubt; und

man das Fusionsprotein mit einem Enzym behandelt, welches die Peptidbindungen an den Carboxytermini der Glutaminsäurereste spezifisch hydrolysiert, wodurch das Fusionsprotein gespalten wird.

2. Verfahren zur Herstellung von Glucagon, bei dem man ein Fusionsprotein gemäß der folgenden Formel:

X-Glu-Glucagon (I)

herstellt, wobei X eine Leadersequenz ist, die aus der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Ser in Position 35 von humanem Interferon-γ besteht, wobei Glu ein Glutaminsäurerest ist und Glucagon die Aminosäuresequenz von Glucagon repräsentiert, indem man durch Einführung eines Expressionsvektors zur Expression des Fusionsproteins in Escherichia coli erhaltene Transformanten kultiviert, und man Escherechia coli die Expression des Fusionsproteins erlaubt; und man das Fusionsprotein mit einem Enzym behandelt, welches die Peptidbindungen an den Carboxytermini der Glutaminsäurereste spezifisch hydrolysiert, wodurch das Fusionsprotein gespalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Aminosäuresequenz von Glucagon durch die nachfolgende Formel wiedergegeben wird:

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem das Glucagon durch das folgende Verfahren gewonnen wird, bei dem man

(a) das Fusionsprotein mit einem geeigneten Denaturierungsmittel oder Tensid solubilisiert,

(b) die Konzentration des Denaturierungsmittels oder Tensids verringert,

(c) der in Stufe (b) erhaltenen Mischung das Enzym zugibt, wodurch eine Reaktionsmischung erhalten wird, die lösliche Intermediate enthält, welche aus dem partiellen Abbau des Fusionsproteins entstanden sind,

(d) die Reaktionsmischung entsalzt, um eine Fraktion zu erhalten, welche die Intermediate und das Enzym, nicht aber das Denaturierungsmittel oder das Tensid enthält,

(e) die Reaktion durch das in der Fraktion enthaltene Enzym zur Freisetzung des Glucagons voranschreiten läßt, und man

(f) das freigesetzte Glucagon isoliert.

5. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem das Enzym die aus Staphylococcus aureus abgeleitete Protease V8 ist.

6. Expressionsvektor umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionsprotein gemäß der folgenden Formel kodiert:

X-Glu-Glucagon (I),

wobei X eine Leadersequenz ist, die aus der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Phe in Position 95 von humanem Interferon-γ besteht, wobei Glu ein Glutaminsäurerest ist und Glucagon die Aminosäuresequenz von Glucagon reprasentiert.

7. Expressionsvektor umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionsprotein gemäß der folgenden Formel kodiert:

X-Glu-Glucagon (I),

wobei X eine Leadersequenz ist, die aus der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Ser in Position 135 von humanem Interferon-γ besteht, wobei Glu ein Glutaminsäurerest ist und Glucagon die Aminosäuresequenz von Glucagon respräsentiert.

8. Expressionsvektor nach Anspruch 6 oder 7, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Trp pAT ΔCys huIFNγ/Glucagon, Irp pAT ΔCys short huIFNγ/Glucagon und Irp pAT ΔCysII huIFNγ/Glucagon.

9. Transformante, erhalten durch Einführung eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 6, 7 oder 8 in eine Escherichia coli Zelle.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Escherichia coli- Zellen einem K12-Stamm angehören.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der K12-Stamm ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C600, JM103 und AG-1.

12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der K12-Stamm K12 C600 ist.

13. Expressionsvektor nach Anspruch 6, 7 oder 8, wobei der Expressionsvektor in Escherichia coli exprimiert wird.

14. Expressionsvektor nach Anspruch 13, wobei der Expressionsvektor im Escherichia coli-Stamm K12 exprimiert wird.

15. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei der K12-Stamm K12 C600 ist.

16. Verfahren zur Herstellung von Glucagon, bei dem man:

ein Fusionsprotein herstellt, indem man durch Einführung eines Expressionsvektors zur Expression eines Fusionsproteins gemäß Formel (I) in Escherichia coli erhaltene Transformanten kultiviert, und man Escherichia coli die Expression des Proteins der Formel (I) erlaubt:

X-Glu-Glucagon (I),

wobei X eine Leadersequenz ist, die aus der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Phe in Position 95 von humanem Interferon-γ besteht, wobei Glu ein Glutaminsäurerest und Glucagon die Aminosäuresequenz von Glucagon repräsentiert, wobei das Glucagon von einer DNA-Sequenz gemäß folgender Formel kodiert wird:

und man das Fusionsprotein mit einem Enzym behandelt, welches die Peptidbindungen an den Carboxytermini der Glutaminsäurereste spezifisch hydrolysiert, wodurch das Fusionsprotein gespalten wird.

17. Verfahren zur Herstellung von Glucagon, bei dem man:

X-Glu-Glucagon (I),

wobei X eine Leadersequenz ist, die aus der Aminosäuresequenz von Gln in Position 4 bis Ser in Position 135 von humanem Interferon-γ besteht, wobei Glu ein Glutaminsäurerest ist und Glucagon die Aminosäuresequenz von Glucagon repräsentiert, wobei das Glucagon von einer DNA-Sequenz gemäß folgender Formel kodiert wird: