JPH03254692A - グルカゴンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、グルカゴンを融合タンパクとして生産した後
に酵素で処理してグルカゴンを単離することにより、グ
ルカゴンを効率よく製造する方法。

該方法に使用されるグルカゴンをコードするＤＮＡ配列
、該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター、および該発現ベ
クターを有する形質転換体、さらに、高速液体クロマト
グラフィーにより測定したときの純度が９９％以上であ
る精製グルカゴンに関する。

（従来の技術） グルカゴンは、膵臓のランゲルハンス島Ａ細胞から分泌
されるペプチドホルモンの一つであり。

膵臓のランゲルハンス島Ｂ細胞から分泌されるインシュ
リンとともに炭水化物の代謝に重要な役割を果たしてい
る。グルカゴンは血糖上昇性グリコゲン分解因子（ｈｙ
ｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ−ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｌｙｔｉ
ｃｆａｃｔｏｒ、　ＨＧＦ）とも呼ばれ、インシュリン
が糖代謝を亢進させて血糖値を低下させるのに対し、血
中へブドウ糖を放出させ、血Ｉｉａを上昇させる作用を
有する。そのため、グルカゴンは、成長ホルモン分泌機
能検査、インシュリノーマ（島細胞腫）の診断、肝糖原
検査、低血糖時の救急処置、消化管のＸ線および内視鏡
検査の前処置などに有用である。

グルカゴンはアミノ酸配列が公知であり、Ｎ末端ヒスチ
ジンに始まりＣ末端トレオニンに終る２９個のアミノ酸
残基からなる単鎖ペプチドである（第１１図）。グルカ
ゴンは、ヒト、ブタおよびウシにおいてアミノ酸配列が
同一であるため、工業的にはウシまたはブタの膵臓から
単離・精製することにより得られている。このようにし
て得られたグルカゴンを製剤化した製品が、すでに市販
されている。さらに、ヒトのグルカゴンをコードするＤ
ＮＡ配列も、　Ｊａｍｅｓ　Ｗ、　１ｒｈｆｔｅおよび
Ｇｒａｄｙ　Ｆ、５ａｕｎｄｅｒｓ　（Ｎｕｅｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４．４７１９−
４７３０（１９８６））により明らかにされている（第
１１図）。

そのため、グルカゴンを遺伝子組換え技術を用いて大量
・安価に生産することが可能であると期待される。

しかし、グルカゴンは上述のように２９個のアミノ酸残
基からなる短鎖長ペプチドであるため分子量が小さく、
このような低分子タンパクを遺伝子組換え技術により宿
主細胞内で直接的に発現させた場合には、宿主細胞内の
タンパク分解酵素（プロテアーゼ）により分解されてし
まう恐れがある。

そのため、４このような低分子タンパクは、他のタンパ
クと融合させである程度の大きさにした融合タンパクと
して発現させた方が安定であり都合がよい。融合タンパ
クを化学的にまたは酵素的に処理することにより、目的
のタンパクを単離することができる。例えば、特開昭６
３−２８４１９６号公報には。

融合タンパクを化学的に処理して目的のタンパクを得る
方法が記載されている。しかし、化学的処理はしばしば
副反応を伴うため好ましくない。酵素処理により融合タ
ンパクから目的のタンパクを単離した例としては、特開
昭６２−２４６６００号公報が挙げられる。この公報で
は、ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む融合タンパクを
Ｇｌｕ特異的プロテアーゼ処理することによりＥＧＦを
得ている。しかし。

ＥＧＦ分子内には、４つのＧｌｕ残基があることが知ら
れており、この酵素を用いてＥＧＦを完全な形で得るこ
とは容易ではなく、収率もよくない。このような酵素的
処理により融合タンパクからグルカゴンを効率よく単離
する方法は知られていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、グルカゴンを融合タンパクと
して生産した後に酵素で処理してグルカゴンを単離する
ことにより、グルカゴンを効率よく製造する方法を提供
することにある。

本発明の他の目的は、上記融合タンパクをコードするＤ
ＮＡ配列を有し、かつ該ＤＮＡ配列の情報を大腸菌にお
いて効率よく発現し得る発現ベクターおよび該発現ベク
ターが大腸菌に導入された形質転換体を提供することに
ある。

本発明のさらに他の目的は、グルカゴンをコードし、か
つ大腸菌の使用頻度の高いコドンからなるＤＮＡ配列を
提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明のグルカゴンの製造法は９次式（■）：Ｘ　−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕｃａｇｏｎ　　　　　　（Ｉ　）（式中、
Ｘはアミノ酸７０〜１７０個のリーダー配列。

（式中、Ｘはアミノ酸残基、　Ｇｌｕｃａｇｏｎはグル
カゴンのアミノ酸配列を表す）で示される融合タンパク
を得るこ、と；および該融合タンパクをＧｌｕのＣ末端
部分を特異的に切断し得る酵素により切断し、グルカゴ
ンを採取すること；を包含する。

好適な実施態様においては、上記グルカゴンは。

次の工程を含むプロセスにより採取される：前記融合タ
ンパクを変性剤または界面活性剤により可溶化する工程
；得られた可溶化液を希釈して変性剤または界面活性剤
の濃度を下げる工程。

該希釈液に前記酵素を加え、該融合タンパクが部分的に
分解した可溶性の中間体を含有する反応液を得る工程；
該反応液を脱塩することにより、該中間体および酵素を
含有し、力１つ変性剤または界面活性剤、を含有しない
画分を得る工程；該画分に含まれる酵素による反応を引
き続いて行い、グルカゴンを遊離させる工程；および該
グルカゴンを単離する工程。

本発明の発現ベクターは、上記融合タンパクをコードす
るＤＮＡ配列を有し、上記融合タンパクを大腸菌体内で
効率よく発現する。

本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを大腸菌に導
入して得られる。

（以下余白） 本発明は、下記式（ｍ）で示されるグルカゴンをコード
するＤＮＡ配列を包含する： ５°−ＣＡＣＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＣＴＴ
ＣＣＧＡＣＴＡＣＴＣＴＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＣＴＣ
ＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧ
ＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣ−３°　　　　　　　
（ｍ）本発明の精製グルカゴンは、高速液体クロマトグ
ラフィーにより測定したときの純度が９９％以上である
。

本発明方法において調製される融合タンパク　Ｘ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕｃａｇｏｎ（ｒ　）において、Ｘで示される
リーダー配列としては発現レベルが高くなるようなアミ
ノ酸配列が遺択される。適当な宿主である大腸菌内でＸ
をコードする配列を導入して発現させた場合に、融合タ
ンパクが、生産される全タンパクの２０％以上となり、
さらに、菌体内で該融合タンパクが、顆粒（ｉｎｃｌｕ
ｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）を形成するような配列が好適であ
る。分子量はｌＯ〜２０にダルトン（７０〜１７０アミ
ノ酸）が適当である。Ｘとしては１例えば、　インター
フェロンγ、△Ｃｙｓインターフェロンγ、インターフ
ェロンα８０Ａ２．　　インターフエロンσ、インター
ロイ牛ンー１β、ウシ成長ホルモン、β−ガラクトシダ
ーゼ、ヒトインターロイキン−８，大腸菌のピルビン酸
キナー−ｄＩ、　　アミノグリコシド３°−ホスホトラ
ンスフェラーゼ（ＡＰＲ）。

これらのポリペプチドのＮ末端部分を含む配列などが挙
げられる。特に、インターフェロンγ、△Ｃｙｓインタ
ーフェロング、およヒインターフェロンα８０Ａ２のＮ
末端の９０−１４０アミノ酸部分を含む配列が好適であ
る。これらの配列がＧｌｕ残基を介してグルカゴンに結
合した形態のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有
する発現ベクターを構築し、該発現ベクターで大腸菌を
形質転換することにより。

グルカゴンを大腸園内′で高効率でしかも安定した融合
タンパク顆粒として発現させることができる。

（以下余白） 以下に２本発明のグルカゴン製造法を工程の順に説明す
る。この工程においてのＤＮＡ組換え方法は９例えば、
モレキュラークローニング（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ、　１９８２）に記載されている方法により行うこと
ができる。

グルカゴンは、ヒト、ブタ、ウシにおいてアミノ酸配列
が同一であり１次式（■）： Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔ
ｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＴｙｒＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ
　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　
ＧｌｎＡｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅ
ｕ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　　（ＩＩ）で示される。

例えば、ヒトのグルカゴンをコードするＤＮＡ配列は、
　Ｊａｍｅｓ　Ｗ、　ＷｈｉｔｅおよびＧｒａｄｙＦ、
５ａｕｎｄｅｒｓ　（前出〉によりすでに明らかされて
いる。ヒトグルカゴンのアミノ酸配列およびヒト由来の
ヒトグルカゴンをコードするＤＮＡ配列を第１１図に示
す。本発明には、このＤＮＡ配列が使用され得るが１例
えば、宿主細胞として大腸菌を選択する場合には、大腸
菌に利用される頻度の高いコドンを優先して使用したグ
ルカゴンのＤＮＡ配列を使用するのが有利である。本発
明者らは、大腸菌に利用される頻度の高いコドンを有す
るグルカゴンのＤＮＡ配列を設計し、これを合成した。

そのＤＮＡ配列を第１図に示す。

グルカゴンをフードするＤＮＡ配列は比較的短鎖である
ため１例えば、化学合成により得ることができる。この
ようなりＮＡは１例えば、第１図に示す１５種類のフラ
グメン）（Ｆｒｌ〜１５）を核酸自動合成機を用いて合
成し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの
クロマトグラフィーにより精製し、各フラグメントにリ
ン酸基を付加してリガーゼにより連結する常法により合
成され得る。連結して得られたＤＮＡは、フェノール抽
出、エタノール沈澱、アガロースゲル電気泳動などの常
法を用いて単離される。アガロースゲル電気泳動におけ
るＤＮＡ断片の回収は、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、、　生、２５３〜２６４、　１９１１０に記載の方
法に従って、アガロースゲルからの溶出により行うこと
ができる。

グルカゴンをコードするＤＮＡ配列を用いて２組換え体
プラスミド（発現ベクター）が構築される。

ベクターの 本発明の発現ベクター　（ア）　Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕ
ｌＦＮ７／ｇｌｕｃａｇｏｎ、　　　　（イ）Ｔｒｐ　
　ｐＡＴ　　△Ｃｙｓ　　ｈｕｌＦＮ７　／ｇｌｕｃａ
ｇｏｎ。

（つ）Ｔｒｐ　　ｐＡＴ　　△Ｃｙｓ　　５ｈｏｒｔ　
　ｈｕｌＦＮ７／ｇｌｕｃａｇｏｎ、　　　（１）Ｔｒ
ｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮａ８０Ａ２／ｇｌｕｃａｇｏｎ
、　　および（オ）　ＴｒｐｐＡＴ△Ｃｙｓ　ＩＩ　ｈ
ｕｌＦＮ　７　／ｇｌｕｃａｇｏｎの構築を、以下に述
べる。

（ア）Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕｃａｇｏ
ｎの構築本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌ
ＦＮ７　／ｇｌｕｃａ−ｇｏｎは、第２図（Ｃ）に示さ
れるように、■グルカゴン製造法をコードする塩基配列
を含む１９ｂｐの断片。

■グルカゴン後半部をコードする塩基配列を含む断片、
および■Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮ７　／Ｋａｌｌｉ
ｋｒｅｉｎベクターを用いて形成される。

（以下余白） ■のＤＮＡ断片は１次のような断片（ＩＶ）である：１
　２　３　４ ＧｌｕＨｉｓＳｅｒＧｌｎＧｌｙ（Ｔｈｒ）ＧＣＧＡＡ
ＣＡＣＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＣＡＣＧＴＣＧＣＴＴＧＴ
ＧＡＧＡＧＴＣＣ工■　　　　　　　■リ　　（ＩＶ） ｐＧＡ　１を制限酵素で切断処理して得られる。ｐＧＡ
ｌは。

ｐｔａｃＬ２から次のようにして形成される。まず。

ｐｔａｃ１２のとＩ［切断部位に次に示す合成リンカ−
（Ｖ）を挿入する： この断片は、ヒスチジン（Ｉｔｓ）、　　セリン（Ｓｅ
ｔ）　。

グルタミン（Ｇｉｎ）　、　　グリシン（Ｇｌｙ）　、
　　およびトレオニン（Ｔｈｒ）の一部からなるグルカ
ゴン前半部をコードするＤＮＡ配列の５゛末端に、グル
タミン酸（Ｇｌｕ）をコードするＧＡＡおよびＰｓｔ　
Ｉ切断部位が付加され、３°末端に■す切断部位を有す
るものである。この断片は、該断片を構威し得る１９ヌ
クレオチド長の１本鎖オリゴヌクレオチド２種を化学合
成し、これらをアニールすることにより得られる。

■のＤＮＡ断片は、第２図（ａ）に示すように。

ｐｔａｃ１２　（Ａｍｍａｎら、　Ｇｅｎｅ、　２５．
１６７．１９８３）を原型として構築されたクローニン
グ用ベクターである得られたプラスミド（ｐｔａｃ１２
／　ＳＬＩ　；工■切断部位の下流にＢｉｎｄｍ切断部
位を有する）を、　　工ＩＩおよびＢｉｎｄｍで切断し
、第１図に示す約１００ｂｐの合成遺伝子を挿入する。

得られたプラスミドｐＧＡ１を第２図（ｅ）に示すよう
に、　Ｂｉｎｄｍで切断し、　Ｋｌｅｎｏｖフラグメン
ト処理により切断面を平滑化し、さらにわ阻Ｉで切断す
ることにより、　　９０ｂｐのＬｕｌ−肛■ｍ／Ｈｅｎ
ｏｖ断片が得られる。

■のＴｒｐ　ｐＡＴｈｕｌＦＮ７　／ｌ［ａｌｌｉｋｒ
ｅｉｎベクターは。

次のようにして得られる。まず、第２図（ｂ）に示すよ
うに、ヒトインターフェロンγ融合ＰＳＴ　Ｉ発現プラ
スミド（Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮ７／ＰＳＴＩ：　
Ｊ、、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、、　１０２．６０７−６１
２．１９８７）をＳａｌ　ＩおよびＢＡＰで処理し、大
きい方の断片（Ｓａｔ　Ｉ　−５ａｔ　Ｉ断片）を得る
。別に、　Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮγプラスミドを
５ａｌＩおよびＸｂａ　Ｉで切断処理し、むま■−≧■
断片を得る。さらに、下記に示す合成オリゴヌクレオチ
ドアダプター（■）（ヒト血漿カリクレインの認識部位
（Ｐｈｅ−Ａｒｇ）をコードするＤＮＡ配列を有する）
を合成する： Ｓａｔ　Ｉ　　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　　Ｐ
ｓｔ　Ｉ　　Ｘｂａ　Ｉ上記勤ユｌ−５ａｌＩ断片、　
５ａｌＩ−ＸｂａＩ断片および合成アダプター（Ｖｌ）
をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結することによりプ
ラスミドベクターＴｒｐ　ｐＡＴｈｕｌＦＮ７　／Ｉａ
ｌｌｉｋｒｅｉｎが得られる。このＴｒｐ　ｐＡＴｈｕ
ｌＦＮ７　／ｌ：ａｌｌｉｋｒｅｉｎは、　トリプトフ
ァン（Ｔｒｐ）遺伝子のプロモータ支配下にヒトＩＦＮ
γの１３５番目のＳｅｒ残基までをコードする遺伝子配
列を有し。

さらに、その下流に第２図（ｂ）の下部に示す配列が続
いている。

上記■のＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮｙ　／Ｋａｌｌｉ
ｋｒｅｉｎを、ＸｂａＩ。

ｋｌｅｎｏｖフラグメントおよびＰｓｔＩで処理し、得
られる大きい方の断片と、上記■および■の断片をＴ４
ＤＮＡ　リガーゼを用いて常法により連結し１発現ベク
ターＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮｙ　／ｇｌｕｃａｇｏ
ｎが得られる（第２図（Ｃ））。この発現ベクターのグ
ルカゴンをコードするＤＮＡの５゛および３°末端接続
部付近の配列を第３図に示す。

（イ）Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮｙ　／ｇｌ
ｕｃａｇｏｎの構築本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡ
Ｔ△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮｙ　／ｇｌｕｃａｇｏｎは、第
４図（ｂ）に示されるように、■ΔＣｙｓ　ｈｕｌＦＮ
γ前半部をコードする塩基配列を含む断片、■△Ｃｙｓ
　ｈｕｒＦＮγ後半部をコードする塩基配列およびグル
カゴンをコードする塩基配列を含む断片、および■Ｔｒ
ｐ　ｐＡＴベクターを用いて形成される。

■のＤＮＡ断片は、第４図（ａ）および（１））に示す
ように。

Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕＩＦＮ７を原型として構築された
ｈｕｌＦＮγ発現プラスミドＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　
ｈｕｌＦＮｙ　　から得られる（基礎と臨床、２０巻、
　　４０２９−４０３４頁、　　１９１１６年）。

Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕＩＦＮ７は、　Ｔｒｐ　
ｐＡＴ　ｈｕＩＦＮ７から次のようにして形成される。

まず、　Ｔｒｐ　ｐＡＴｈｕｌＦＮγをＣ１ａ　Ｉ　、
　ＡｖａＩ［および砧止１で切断し、Ｃ１ａＩ−虱■断
片およびＡｖａ　ＩＩ　−５５２４１断片を得る。さら
に。

次に示す合成オリゴヌクレオチドアダプター（■）を合
成する： ＭｅｔＧｌｎ　（Ａｓｐ） ５°−ＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧ　　　　−３゜３°
−ＴＡＴＧＡＴＡＣＧＴＣＣＴＧ−５’　　　　（■）
Ｃ１ａ　Ｉ　　　　　　　　Ａｖａ　ＩＩこの合成オリ
ゴヌクレオチドアダプター（■）は。

ΔＣｙｓ　ｈｕＩＦＮ７のＮ末端がグルタミン（Ｇｉｎ
）、　　アスパラギン酸（Ａｓｐ）から始まるΔＣｙｓ
　ｈｕｌＦＮγ前半部をコードする。この合成オリゴヌ
クレオチドアダプター（■）は、１３ヌクレオチド長お
よび１４ヌクレオチド長の２種類の１本鎖オリゴヌクレ
オチドを合成し、これらをアニールすることにより得ら
れる。

上記Ｃ１ａ　Ｉ　−滋１断片、　Ａｖａ　ＩＩ　−濾Ｉ
断片および合成アダプター（■）をＴ４　ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結することにより、プラスミドベクターＴ
ｒｐｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮｙが構築される。この
Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮｙを制限酵素Ｃ１
ａ　ＩおよびＡｓｕ　Ｕで切断処理し、　２７５ｂｐの
断片を得る。このＣ１ａＩ　−Ａｓｕｌｌ断片は、ヒト
ＩＦＮγの４番目のＧｉｎから、　　ＩＦＮγをコード
する塩基配列の途中にあるＡｓｕ　ｎ切断部位までをコ
ードする。

■のＤＮＡ断片は、上記（７）項で得られる発現ベクタ
ーＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕＩＦＮ７　／ｇｌｕｃａｇｏｎ
　（第２図（Ｃ））を。

ＡｓｕＴｌおよびＩＩで切断した小さい方の断片である
。このＡｓｕ　ＩＩ　−論１断片は、ヒトＩＦＮγをコ
ードする塩基配列の途中にあるＡｓｕｌｌ切断部位から
始まるヒトＩＦＮγの後半部をコードする塩基配列を含
み。

その下流側にはグルカゴンのアミノ酸配列をフードする
塩基配列を含む。

■のＤＮＡ断片は、上記発現プラスミドＴｒｐ　ｐＡＴ
ｈｕｌＦＮ７　／ｇｌｕｃａｇｏｎを、第４図（ｂ）に
示すように。

Ｃ１ａ　ＩおよびガΔＩで切断した大きい方の断片であ
る。このＣ１ａ　Ｉ　−Ｓｐｈ　Ｉ断片は、　　Ｔｒｐ
遺伝子のプロモーターをフードする塩基配列を含む。

上記の■Ｃ１ａ　Ｉ　−Ａｓｕ　ＩＩ断片、■Ａｓｕ　
ＩＩ　−Ｓｐｈ　Ｉ断片および■Ｃ１ａ　Ｉ　−５５ｊ
４　Ｉ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて常法により
連結することにより１発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃ
ｙｓ　ｈｕｌＦＮ　７　／ｇｌｕｃａｇｏｎが得られる
（第４図（ｂ））。

このＴｒｐ　ｐＡｒ△Ｃｙｓ　ｈｕＩＦＮ７　／ｇｌｕ
ｃａｇｏｎは、　Ｔｒｐ遺伝子のプロモータ支配下にヒ
トＪＰＮγ　の４番百のＧｌｎから　１３５番目のＳｅ
ｒ残基までをコードする遺伝子配列を有し、その下流に
第４図（ｂ）の右下部に示す配列が続いている。この発
現ベクターのグルカゴンをコードするＤＮＡの５°およ
び３°末端接続部位付近の配列は上記（ｒ）項で得られ
るＴｒｐ　ｐＡＴｈｕｌＦＮ　７　／ｇｌｕｃａｇｏｎ
と同じであり、その配列を第３図に示す。

（り）Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｈｕＩＦ
Ｎ７　／ｇ１ｕｃａｇｏｎの構築本発明の発現ベクター
Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｈｕＩＦＮ　７
　／ｇｌｕｃａｇｏｎは、第５図に示されるように、上
記（イ）項で得られる発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃ
ｙｓ　ｈｕｌＦＮｙ　／ｇｌｕｃａｇｏｎ　（第４図（
ｂ））から構築される。

Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｈｕＩＦＮ７　
／ｇｌｕｃａｇｏｎを得るには、まず、　　Ｔｒｐ　ｐ
ＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕＩＦＮ７　／ｇｌｕｃａｇｏｎを制
限酵素Ａｓｕ　ＩＩおよびＰｓｔ　Ｉで切断し、　　ｋ
ｌｅｎｏｗフラグメント処理により切断面を平滑化する
。得られた大きい方の断片（Ａｓｕ　Ｕ　／ｋｌｅｎｏ
ｖ　−Ｐｓｔ　Ｉ　／ｋｌｅｎｏｖ断片）を７４ＤＮＡ
リガーゼを用いて常法により連結することにより、　Ｔ
ｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｈｕｌＦＮγ／ｇ
ｌｕｃａｇｏｎが得られる０ このＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｈｕＩＦＮ
７　／ｇｌｕｃａｇｏｎは。

Ｔｒｐ遺伝子のプロモータ支配下にヒ）ＩＦＮγの４番
目のＧｉｎカら９５番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）
残基までをコードする遺伝子配列を有し、その下流にＧ
ｔｙおよびＧｌｕ残基をコードする塩基配列を介してグ
ルカゴンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。

この発現ベクターのグルカゴンをコードするＤＮＡの５
°末端接続部位付近の配列を、第５図の右下部に示す。

（１）Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮａ８０Ａ２／ｇｌｕ
ｃａｇｏｎの構築本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ
　ｈｕｌＦＮα８０Ａ２／ｇｌｕｃａｇｑｎは、第６図
に示されるように、■ｈｕｌＦＮα８０Ａ２をコードす
る塩基配列を含む断片、■グルカゴンをコードする塩基
配列を含む断片、および■Ｔｒｐ　ｐＡＴベクターを用
いて形成される。

■のＤＮＡ断片は、第７図（ａ）に示すように、　　Ｔ
ｒｐｐＢＲｈｕｌＦＮα８０Ａ２（特開昭５１−５６１
９９号公報、該公報ではｐＴｒｐ−ＩＦＮα５８０Ａ２
と記載されている）を鋳型とし、ポリメラーゼチェーン
リアクション（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉら、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　　Ｌ！ｉ、４１１７．　１９８８）により得
られる。それにはまず１次に示す２０ヌクレオチド長の
センス（ｓｅｎｓｅ　）プライマー（■）、および２５
ヌクレオチド長のアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）
プライマー（ＩＸ）の２種類の一本鎖オリゴヌクレオチ
ドをそれぞれ化学合成する。

（以下余白） （ｓｅｎｓｅプライマー〉 ５°−ＡＧＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴ−３
’　　　　　　　（■）（ａｎｔｉｓｅｎｓｅブライマ
ー〉 ５°−ＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴ
ＧＴＡ−３°　　（■）第７図（ａ）に示すように、　
　５ｅｎｓｅブライマー（■）はＴｒｐ遺伝子のプロモ
ータの後半部に相当し、　ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅブライ
マー（ＩＸ）はｈｕｌＦＮａ　８０Ａ２の後半部に相当
する。これらのプライマーを用い、ＴＬＬポリメラーゼ
により　ＤＮＡ断片を増幅させることにより。

ｈｕ　Ｉ　ＦＮα８０Ａ２をコードする塩基配列を含む
ＤＩＪＡ断片が得られる。このＤＮＡ配列をＣＩａＩお
よびＰｓｔ　Ｉで切断し、　Ｃ１ａ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ
断片とする。このＣ１ａｌ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片は、ヒト
ＩＦＮ　ａ　ｌｌ０Ａ２の１４０番目のＡｌａ残基まで
をコードする遺伝子配列を有する。

■のＤＮＡ断片は、上記（ア）項で得られる発現プラス
ミドＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮｙ／ｇｌｕｃａｇｏｎ
　（第２図（Ｃ））を、第６図に示すようにＰｓｔｌお
よびシμＨ１で切断した小さい方の断片である。このＰ
ｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨｒ断片は、シスチン（Ｃｙｓ）　
、　ＳｅｒおよびＧｌｕをコードするＤＮＡ塩基配列、
ならびにグルカゴンをコードするＤＮＡ塩基配列を有す
る。

■のＤＮＡ断片は、上記（７）項で得られる発現プラス
ミドＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕｃａｇｏｎ
　（第２図（Ｃ））を、第６図に示すようにＣ１ａＩお
よびＢａｍＨＩで切断した大きい方の断片である。この
Ｃ１ａ　Ｉ　−ＢａｍＨｒ　断片は、　Ｔｒｐ遺伝子の
プロモーターをコードする塩基配列を含む。

上記の■山Ｉ−工■断片、■阻■−石ＨＩ断片および■
Ｃ１ａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼ
を用いて常法により連結することにより１発現ベクター
Ｔｒｉ）　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮａ８０Ａ２／ｇｌｕｃａ
ｇｏｎが得られる（第６図）。

この　Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮα８０Ａ２／ｇｌｕ
ｃａｇｏｎは、　　Ｔｒｐ遺伝子のプロモータ支配下に
ヒトＩＦＮα８０Ａ２の１４０１目のアラニン（Ａｌａ
）残基までをコードする遺伝子配列を有し、その下流に
第６図の右下部に示す配列が続いている。上記ｈｕｌＦ
Ｎα８０Ａ２の全配列を第８図に示す。

（オ）Ｔｒｐ　ｐＡＴ△ＣｙｓＩＩ　　ｈｕｌＦＮ７／
ｇｌｕｃａｇｏｒｉの構築本発明の発現ベクターＴｒｐ
　ｐＡ丁△Ｃｙｓ　ＩＩ　ｈｕＪＦＮ　７／ｇｌｕｃａ
ｇｏｎは、第７図（ｃ）に示すように、（イ）の項に示
した発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮ
γ／ｇｌｕ−ｃａｇｏｎをもとに形成される０つまり、
このプラスミド上に１か所存在するＰｓｔ　Ｉ切断部位
を構成する配列ＣＴＧＣＡＧを、ミスマツチを含むオリ
ゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法（前出）を利用してＣ
ＴＣＧＡＧに変換することにより得られる。具体的には
、グルカゴンとその前後をコードするＤＮＡ断片■と、
　Ｔｒｐ　ｐＡＴΔＣｙｓ　ｈｕｌＦＮγベクターの大
断片■（いずれも後述）とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合
して得られる。

まず、次に示す２１ヌクレオチド長のセンス　（Ｓｅｎ
ｓｅ）プライマー（Ｘ）および２１ヌクレオチド長のア
ンチセンス（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）ブライ７−（ＸＩ）
の２種類の一本鎖オリゴヌクレオチドをそれぞれ化学合
成する。

＜　５ｅｎｓｅプライマー〉 ５’　−ＣＣＧＴＴＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＡＣＡＣ
−３°　（Ｘ）＜Ａｎｔｉｓｅｎｓｅプライマー〉 ５°−ＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−
３°　ＯＣ）第７図（ｂ）に示すように、この５ｅｎｓ
ｅブライマーは。

ｂｕｌＦＮｙおよびグルカゴンの接続部分の配列に相当
し、　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅプライマーは、グルカゴンの
カルボ牛シル末端部分からはじまり、さらに下流領域を
含む部分の配列に相当する。

■グルカゴンとその前後をコードするＤＮＡ断片二上記
２種のブライマーを用い、　　Ｔｒｐ　ｐＡＴΔＣｙｓ
ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕｃａｇｏｎを鋳型としたＰＣＲ法
（前出）によって、グルカゴンおよびその前後をコード
するＤＮＡ断片が増幅される。増幅されたＤＮＡ断片は
、　５ｅｎｓｅプライマー（Ｘ）にミスマツチが存在し
ている為。

鋳型に用いたベクター上の塩基配列と一部異なる塩基配
列を有する。つまりＩＦＮγおよびグルカゴンの接続部
をコードする塩基配列中に見られるＰｓｔ　１切断部位
（ＣＴＧＣＡＧ）は、増幅されたＤＮＡ配列中において
はυｒｏｒ切断部位（ＣＴＣＧＡＧ）へ変換されている
。この結果、システィンをコードしているコドン丁ＧＣ
は。

ＴＣＧに変わり、これはセリン残基をコードすることに
なる。増幅されたＤＮＡ断片をＸｈｏ　Ｉで切断し、ク
レノー断片を作用させてその切断面を平滑末端とする。

次いで、これをＸｂａ　Ｉで切断し、　ＤＮＡ断片■を
得る。

■Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｂｕｌＦＮｙベクターの大
断片：ベクターＴｒｐ　ｐＡＴΔＣｙｓ　ｂｕｌＦＮｙ
　／ｇｌｕｃａｇｏｎを第７図（Ｃ）に示すように、Ｐ
ｓｔｌで切断し、クレノー断片を作用させる。さらに■
すで切断して得られる大きい方のＤＮＡ断片■を得る。

上記■のＸｈｏ　Ｉ　／ｋｌｅｎｏｗ−Ｘｂす断片、　
および■Ｐｓｔ　Ｉ　／ｋｌｅｎｏｖ−Ｘｂａ　Ｉ断片
を、常法どおりＴ４　ＤＮＡリカーセを用いて連結する
ことにより１発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ７Ｊ
　ｈｕｌＦＮ７／ｇｌｕｃａｇｏｎが得られる。

このＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓｎ　ｂｕｌＦＮｙ　／ｇｌ
ｕｃａｇｏｎはＴｒｐ遺伝子のプロモーター支配下にヒ
トＩＦＮγ　の４番目のＧｂ＋から１３５番目のＳｅｒ
残基までをコードする遺伝子配列を有し、その下流に第
７図（Ｃ）の右下部に示す配列が続いている。

の′　　　および発 上記発現プラスミド（７）Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮ
ｙ／ｇｌｕｃａｇｏｎ、　　　（イ）Ｔｒｐ　　ｐＡＴ
　　ΔＣｙｓ　　ｈｕｌＦＮ７／ｇｌｕｃａｇｏｎ、　
　　（つ）Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｈｕ
ｌＦＮ７／ｇｌｕｃａｇｏｎ、　（１）ＴｒｐｐＡＴ　
ｈｕｌＦＮａ　８０Ａ２／ｇｌｕｃａｇｏｎ、　　およ
び（オ）Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓｎ　ｈｕｌＦＮ７／ｇ
ｌｕｅａｇｏｎは、モレ牛コラークローニング（前出）
の方法に従って適当な宿主細胞に導入される。形質転換
体は、テトラサイクリン耐性を指標に選択される。上記
（７）、　（（）、　（つ）および（オ）の発現プラス
ミドが導入された形質転換体は。

ヒトグルカゴンとヒトＩＦＮγまたはその類似体との融
合タンパクを生産し、上記（１）の発現プラスミドが導
入された形質転換体はヒトグルカゴンとＩＦＮα８０Ａ
２との融合タンパクを生産する。宿主細胞としては、大
腸１１Ｃ１２株Ｃ６００，ＪＭ１Ｇ３．　ＡＧ−１など
が挙げられるが、特に［１２株Ｃ６０Ｇが好適であり、
この菌株を用いることによりヒトグルカゴンを含む融合
タンパクが効率よく生産される。

上記発現ベクターのうちＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮγ
／ｇｌｕｃａｇｏｎで大腸１１０２株Ｃ６００を形質転
換した形質転換体は、　Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｂｕｌＦＮｙ
　　ｆｕｓｅｄ　ｇｌｕｃａｇｏｎ／ｃａｏｏ、　　ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−２２５０とじ７１９８９年１月２０日よ
り。

茨城県つくば市東１−１−３の微生物工業技術研究所に
、ブダペスト条約に基づき寄託されている。

本発明の形質転換体を培養し９ｍ体を集めた後に５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）および抗グルカゴンポリクローナル抗体によるウェス
タン解析で分析することにより、ヒトグルカゴンが融合
タンパクとして宿主細胞内で発現していることが確認さ
れる。つまり、　５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約２１
キロダルトンまたは約１４キロダルトンに対応するヒト
ＩＦＮγまたはＩＦＮα　との融合タンパクであるバン
ドが検出され、抗グルカゴンポリクローナル抗体による
ウェスタン解析により融合タンパクそのものの抗グルカ
ゴン抗体との反応が確認される。本発明方法においては
、それぞれの形質転換体の発酵培養物ｌＬ当り、（ア）
約３．０６ｇ。

（イ〉約２．４３ｇ、　　（つ〉約３．６＜ｇ、　　（
１）約０．２４ｇおよび（オ〉約２．４５ｇの融合タン
パクが得られた。

グルカゴンを含む融合タンパク（Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕｃ
ａ−ｇｏｎ）からグルカゴンを採取するには、該融合タ
ンパクが顆粒タンパクとして宿主細胞内に蓄積されるの
で、まず該顆粒タンパクを取り出し、その可溶化を行う
。

それには１例えばまず、常法に従い培養液を遠心分離し
て菌体を集め、該菌体を破砕してペレットを得る。この
ペレットに、変性剤または界面活性剤を含有する緩衝液
を加え、可溶化する。変性剤としてはグアニジン（グア
ニジン塩酸）、尿素などが用いられる。変性剤は、ペレ
ットが可溶化するのに充分な量で緩衝液に添加して使用
される。

グアニジンおよび尿素は飽和に達するまで添加して使用
することもできるが１通常６〜８Ｍの濃度で使用するの
が好ましい。界面活性剤としてはＴｖｅｅｎ−８０（商
品名〉が好適に用いられ１通常Ｏ，ａＳ〜０．２％の濃
度で使用される。緩衝液のｐＨは９次の酵素処理工程を
考慮し、該工程に用いられる酵素の至適ｐ［ｆ付近に設
定するのが好ましい。例えば、酵素として辷ａｕｒｅｕ
ｓ由来のプロテアーゼＶ８　（Ｓｉｇｍａ社製。

Ｎｏ、　Ｐ−８４００）を用いる場合には、　ｐＨを７
．８とするのが好ましい。そのため、緩衝液としては、
ｐＨ１，Ｂ付近で緩衝能を有する緩衝液を用いるのが好
ましく２例えば、炭酸水素アンモニウム緩衝液が好適に
使用される。この緩衝液中には、酵素処理で用いられる
酵素が不純物として中性酵素などを含む場合に、その活
性を阻害するための酵素阻害剤として、　　ＥＤＴＡな
どが添加されてもよい。

得られた可溶化液は、変性剤または界面活性剤を高濃度
で含有しており１次の酵素処理工程にそのまま使用する
と酵素が充分に働かない場合がある。そこで２通常、可
溶化液を変性剤または界面活性剤を含まない上記緩衝液
などの希釈液で希釈する。希釈は、タンパクが可溶化し
た状態を維持でき、かつ後述の酵素処理に使用する酵素
が充分に作用しうる程度にまで行われる。例えば、変性
剤としてグアニジンまたは尿素を使用した場合には、そ
の濃度が４Ｍ以下、好ましくは２Ｍ程度となるように希
釈を行う。ただし、可溶化液中のタンパク濃度がｌ〜Ｆ
＋ｓｇ／ａｔ、好ましくは２〜３Ｂ／日ｌの範囲となる
ように留意する。

次いで、グルカゴンを酵素処理によりＸタンパクと分離
する。上記可溶化溶液中には、目的とするグルカゴンは
Ｇｌｕ残基を介してＸタンパクもしくはその部分変性体
と融合した状態で存在している。グルカゴン中にはＧｌ
ｕ残基は存在しないので。

Ｇｌｕ残基のＣ末端ペプチド結合を特異的に切断する酵
素で処理することによりグルカゴンを完全な形で切り出
すことができる。このような酵素としては上記のように
Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ由来のプロテアーゼｖ８（Ｓｉｇｍ
ａ社製、　Ｎｏ、Ｐ−８４００＞が好適であるが、これ
に限定されず、　　ＧＩＬＩ残基のＣ末端ペプチド結合
のみを特異的に切断する酵素であればいずれも使用され
得る。例えば、　　ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　ＡＴＣＣＮｏ
、１２６０Ｑ株由来のプロテアーゼｖ８もまた。好適に
利用され得る。

酵素の使用量は、上記希釈液中のタンパク量に対して１
１５０〜１７１，０００　（ｖ／ｖ）であり、好ましく
は約１１５００　（ｗ／ｗ）である。このような酵素を
上記希釈液に添加した酵素反応液を、室温〜４Ｇ”Ｃに
て３０分〜７時間、穏やかに攪拌しながら反応させる。

反応時間は、添加する酵素の量により異なるが２例えば
、酵素を約１１５００　（ｗ／ｖ）の量で添加した場合
には約４時間反応させるのが好ましい。酵素反応は。

塩酸、酢酸などの酸を添加して、好ましくはｐＨをｐＨ
３程度に下げることにより停止する。得られた酵素反応
液中には、最終産物であるグルカゴンおよびＸ−Ｇｌｕ
−グルカゴンよりも低分子である中間体が含有される。

この中間体は、Ｘタンパク内のＧｌｕ残基が酵素により
切断されて生成されると考えられる。この中間体は９反
応液中の変性剤または界面活性剤が除去された場合にお
いても可溶性である。このような中間体が生成する原因
としては上記酵素反応液中の酵素が変性剤または界面活
性剤により一時的に変性し、著しく活性が低下している
こと；Ｘタンパク内のＧｌｕ残基が切断されることによ
り生成する低分子の分解産物が酵素作用を阻害している
こと；融合タンパク中のＧｌｕ残基切断部位が９分子の
折りたたみなどの高次構造上の理由から酵素作用を受け
にくい状態になっていること；などが考えられる。グル
カゴンの収率を上げるためには、さらにこの中間体を、
上記酵素で処理し、切断すればよい。そのためには、酵
素反応液中の変性剤または界面活性剤、および夕ンバク
Ｘ内のＧｌｕ残基が切断されることにより生成する低分
子の分解産物を除去することが有効である。これらを除
去するには、ゲル濾過、透析などの脱塩操作が有効であ
り、特にゲル濾過が好適に用いられる。ゲル濾過を行う
には、変性剤または界面活性剤、および低分子の分解産
物を除去すると同時に、酵素と中間体とが同じ画分に溶
出されるような条件を採用するのが好ましい。ゲル濾過
により得られた中間体および酵素を含む画分を集め、　
ｐＨを酵素の至適ｐ旧こ調整することにより、酵素が再
び活性化し、可溶化している中間体に作用するようにな
る。この画分を上記酵素反応と同様の条件で反応させる
ことにより、グルカゴンが遊離する。

このようにして融合タンパクから切断されたグルカゴン
は、常法通り、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー　イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣなどの各
種クロマトグラフィー遠心分離操作などを適当に組み合
わせて精製できる。上記方法によれば、用いるＧｌｕ残
基を切断する酵素の量が少なくてすみ、経済的である。

本発明方法においては、それぞれの形質転換体の発酵培
養物ｌＬ当り（７）約１５０ｍｇ、　（イ）約１６０＋
ｎｇおよび（オ）約１７０ｍｇの精製グルカゴンが得ら
れた。（つ）、（１）の方法により発現された融合タン
パクからも同様にして精製グルカゴンが得られた。精製
グルカゴンの純度、アミノ酸組成、アミノ酸配列および
生物活性を調べると、不純物を含まず、天然のグルカゴ
ンのアミノ酸組成と完全に一致し、かつ天然のグルカゴ
ンと同じ活性を示すヒトグルカゴンが生産されたことが
確認された。このようにして得られるグルカゴンは、高
速液体クロマトグラフィーにより測定したときの純度が
９９％以上である。このようなグルカゴンは、従来用い
られていたグルカゴン製剤と全く同じように成長ホルモ
ン分泌機能検査、インタ１リノーマ（島細胞腫）の診断
、肝糖原検査、低血糖時の救急処置、消化管のＸ線およ
び内視鏡検査の前処置などに使用され得る。

本発明は、ヒトグルカゴンを融合タンパクとして製造す
る方法に限定されるものではなく、該タンパクを発現さ
せるベクター、形質転換体、およびグルカゴンをコード
する特定のＤＮＡ配列、さらに精製されたグルカゴンが
本発明に包含される。

（以下余白） （実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

以下の実験において、　　ＤＮＡ組換え方法は、全てモ
レキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　１９８２）に記載の方法に従って行った。

また、用いた全ての酵素は宝酒造から購入した。

ヒトグルカゴンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
を、原則として大腸菌に最も利用される頻度の高いコド
ンを使用して設計した。このＤＮＡ配列は、第１番目の
アミノ酸■ｉｓから、第２９番目のＴｈｒまでをコード
する。第１図に示されるＤＮＡ配列である。

核酸自動合成機を用いて第１図に示す１５種の短鎖フラ
グメントを化学合成した。これらのフラグメントをアニ
ーリングにより結合させ、第１図に示す２本鎖構造を有
するＤＮＡ配列を得た。このＤＮＡ配列は、５°末端に
ＭｅｔをコードするＡＴＧおよび酎１Ｉ切断部位を、モ
して３°末端に２つの終止コドンＴＡＡおよびＴＡＡな
らびにＨｉｎｄＩＩ［切断部位を有する。

Ｂ　　ベタ　−の ヒトグルカゴンを大腸菌において発現しうる発現ベクタ
ー　（７）Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕ［ＦＮ７　／ｇｌｕｃ
ａｇｏｎ、　　（イ）Ｔｒｐ　　ｐＡＴ　　△Ｃｙｓ　
　ｈｕｌＦＮ７　／ｇｌｕｃａｇｏｎ、　　　（つ）　
　Ｔｒｐ　　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｈｕｌＦＮ
７　／ｇｌｕｃａｇｏｎ　、　　（１）　Ｔｒｐ　ｐＡ
ＴｈｕｌＦＮαａＯＡ２／ｇｌｕｃａｇｏｎ、　　およ
び（ｔ）Ｔｒｐ　ｐＡＴ△ＣｙｓＩＩ　ｈｕｌＦＮ７　
／ｇｌｕｃａｇｏｎを、以下のようにして構築した。

（７）Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕｃａｇｏ
ｎの構築発現ベクターを、下記の■〜■項で得られる３
つのＤＮＡ断片を連結することにより構築した。この発
現ベクターの構築の概略を第２図（ａ）〜（ｃ）に示す
。

■グルカゴン前半部をコードする塩基配列を含む１９ｂ
ｐのＰｓｔ　Ｉ　−Ｋ３Ｂ　Ｉ断片：　Ｈｉｓ、　　Ｓ
　ｅｒ、　　Ｇ　Ｉｎ、　　Ｇ　Ｉｙ。

およびＴｈｒの一部からなるグルカゴン前半部をコード
するＤＮＡ配列の５°末端に、　　Ｇｌｕをコードする
ＧＡＡおよびＰｓｔｌ切断部位を付加し、３′末端には
跪Ｉ　切断部位を配した塩基配列を設計した。この塩基
配列は、上記（ＩＶ）式で示される。この塩基配列に従
って、　　１９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド２
種を化学合成し、これらをアニールさせた。このように
して、グルカゴン前半部をコードする塩基配列を含み、
上流側にはＰｓｔＩ、　　下流側は幻阻Ｉの切断点を有
する１　９ｂｐのＰｓｔ　Ｉ　−ＬＬＥＬ　Ｉ断片が得
られた。

■プラスミドベクターのＬＬＬ　Ｉ　−Ｈｉｎｄｍ　／
　Ｋｌｅｎｏｖ断片：第２図（ａ）に示すように、　　
ｐｔａｃ１２　（前出）を原型として、目的とする遺伝
子のクローニング用ベクターであるプラスミドｐＧＡ１
を構築した。まず。

ｐｔａｃ１２のと■切断部位に上記（Ｖ）式で示される
１５ｂｐの合成リンカ−を挿入し、　　と１１切断部位
の下流にＨｉｎｄｍ切断部位を設けたプラスミド（ｐｔ
ａｃ１２／５ＬＩ）を構築した。このｐｔａｃ１２／　
ＳＬＩをトＩｎおよびＨＬｎｄｍで切断し、（Ａ）項で
得られた約１００ｂｐの合成遺伝子（第１図に示される
ＤＮＡ配列）を挿入し、　　ｐＧＡｌと命名した。

次いで、第２図（Ｃ）に示すように、プラスミドｐＧＡ
　１をＨｉｎｄｍで切断し、　　Ｋｌｅｎｏｖフラグメ
ント処理により切断面を平滑化した。その後、これをＬ
ｌｌで切断し、得られた断片のうち９ｏｂｐの短い方の
断片（Ｋ３ｐ　Ｉ　−Ｈｉｎｄｍ　／　Ｋｌｅｎｏｖ断
片）を得た。コノに３Ｂ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ｍ　／　Ｋ
　１ｅｎｏｖ断片は、第１図に示すように、グルカゴン
のアミノ酸配列をコードする塩基配列の途中にある論Ｉ
切断部位から始まるグルカゴンの後半部をコードする。

■プラスミドベクターＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮγ／
Ｋａｌｌｉ−ｋｒｅｉｎのＸｂａ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断
片：第２図（ｂ）に示すようにヒトインターフェロンγ
融合ＰＳＴＩ発現プラスミド（Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌ
ＦＮｙ／ＰＳＴＩ；　Ｊ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１
０２゜６０７−６１２．１９８７（前出））をＳａｌ　
Ｉ　テ３７”Ｃニア、　１時間消化した後にＢＡＰで３
７”Ｃにて２時間処理し、大きい方の断片（Ｓａｌ　Ｉ
　−５ａｔ　Ｉ断片）を単離した。別に。

Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮγプラスミドをＳａｌ　Ｉ
およびＸｂａ　Ｉで予め消化しておき、小さい方のＳａ
ｌ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片を得た。上記影吐■−輪ユＩ
断片、紘吐Ｉ−田１断片および（■）式で示される合成
オリゴヌクレオチドアダプター（ヒト血漿カリクレイン
の認識部位（Ｐｈｅ−Ａｒｇ）をコードするＤＮＡ配列
を有する）を、　　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結
させた。

このようにして構築されたプラスミドベクターをＴｒｐ
　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮ７　／Ｉａｌｌｉｋｒｅｉｎと命
名した。このＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮ７／Ｋａｌｌ
ｉｋｒｅｉｎは、　　Ｔｒｐ遺伝子のプロモーター支配
下にヒトＩＦＮγの１３５番目のＳｅｒ残基までをコー
ドする遺伝子配列を有し、さらに。

その下流に第２図（ｂ）の下部に示す配列が続いている
。このＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮ７　／Ｋａｌｌｉｋ
ｒｅｉｎを第２図（ｃ）に示すようにＸｂａＩで切断し
た後、　　Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを作用させてその
切断面を平滑末端とした。

次いで、　　ｐｓｔｌで切断し、大きい方の３．６ｋ　
ＤＮＡ断片を単離した（Ｘｂａｌ−阻Ｉ断片）。

これら■〜■のＤＮＡ断片（いずれも、　　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　Ｌ　２５３〜２６４．１９
８０に従ってアガロースゲル電気泳動法により単離した
もの）を第２図（Ｃ）に示すように、　Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結して発現ベクターを構築し、　　Ｔ
ｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕｃａｇｏｎと命名
した。次いで、この発現プラスミドＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈ
ｕｌＦＮ７　／ｇｌｕｃａｇｏｎに挿入されたＤＮＡ断
片の塩基配列をＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

７４．５４６３−５４６７、１９７７に従って調べるこ
とにより。

該ＤＮＡ断片がヒトのグルカゴンの２９アミノ酸を正確
にフードすることを確認した。

（イ）Ｔｒｐ　ｐＡＴΔＣｙｓ　ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕ
ｃａｇｏｎの構築発現ベクターを、下記の■〜■項で得
られる３つのＤＮＡ断片を連結することにより構築した
。この発現ベクターの構築の概略を第４図（ａ）および
（ｂ）に示す。

■ヒトＩＦＮ７発現プラスミドＴｒｐ　ｐＡＴΔＣｙｓ
　ｈｕｌＦＮγのＣ１ａ　Ｉ−■す断片：第４図（ａ）
に示すように。

Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮｙ　（前出）を原型として
、　　ｈｕｌＦＮｙ発現プラスミドＴｒ９　ｐＡＴ△Ｃ
ｙｓ　ｂｕｌＦＮｙ　（前出）を構築した。まず、　　
Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｂｕｌＦＮｙをＣ１ａｌ、　　Ａｖａ
ＵおよびＩＩで切断し、　　Ｃ１ａ　Ｉ　−５Ｂｊｌ　
Ｉ断片およびＡｖａ　ｎ　−５３ｊｚ　Ｉ断片を得、さ
らに、上記合成オリゴヌクレオチドアダプター（■）を
合成した。この引ａ　、Ｉ　−３Ｂｊ４１断片、出ｎ−
５ｌ生Ｉ断片および合成アダプター（■）を７４　ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。このようにして得られた
プラスミドをＴｒｐｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｂｕｌＦＮｙと命
名した。

次いで、第４図（ｂ）右側に示すように、このプラスミ
ドＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｂｕｌＦＮｙをＣ１ａＩｔ
ａよびＡｓｕ　ＩＩで３７°Ｃにて１時間消化した後、
　　２７５ｂｐの断片（Ｃ１ａｌ−虫■断片）を単離し
た。

■Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｂｕｌＦＮｙ　７ｇｌｕｃａｇｏｎ
のＡｓｕ　ＩＩ　−５３２４Ｉ断片：上記（７〉項で得
られた発現プラスミドＴｒｐ　ｐＡＴｈｕｌＦＮ　７　
／ｇｌｕｃａｇｏｎを＋　　ＡｓｕＩ［およびＩＩで３
７℃にて１時間消化した後、小さい方の断片を単離した
。

■Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮ７／ｇｌｕｃａｇｏｎの
Ｃ１ａ　Ｉ　−５５２４Ｉ断片：上記（ア）項で得られ
た発現プラスミドＴｒｐ　ｐＡＴｈｕ　ＩＦＮ　７　／
ｇｌｕｃａｇｏｎを、　　ＣＩａＩおよびジ止Ｉで３７
°Ｃにてｌ＃間間化化た後、大きい方の断片を単離した
。

これら■〜■のＤＮＡ断片（いずれも、　　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　、　８．２５３〜２６４．１
９８０に従ってアガロースゲル電気泳動法により単離し
たもの）を第４図（ｂ）に示すように、　　Ｔ４　ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結して発現ベクターを構築した。

これをＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕ
ｃａｇｏｎと命名した。次いで、この発現プラスミドＴ
ｒｐ　ｐＡＴΔＣｙｓ　ｂｕｌＦＮｙ　／ｇｌｕｃａｇ
ｏｎに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＰｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７４．５４６
３−５４６７、　１９７７、　　に従って調べることに
より、該ＤＮＡ断片がヒトのグルカゴンの２９アミノ酸
を正確にコードすることを確認した。

（つ）Ｔｒｐ　ｐＡＴΔＣｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｈｕｌＦ
Ｎｙ／ｇｌｕｃａｇｏｎの構築発現ベクターを、以下の
ようにして構築した。

この発現ベクターの構築の概略を第５図に示す。

上記（イ）項で得られた発現プラスミドＴｒｐ　ｐＡＴ
ΔＣｙｓ　ｂｕｌＦＮｙ　／ｇｌｕｃａｇｏｎを、　　
ＡｓｕＩＩおよびＰｓｔ　Ｉで３７℃にて１時間消化し
ｅ　　ｋｌｅｎｏｖフラグメント処理により切断面を平
滑化した。大きい方の断片（虫■へ１ｅｎｏｖ　−Ｐｓ
ｔ　Ｉ　／ｋｌｅｎｏｗ断片）を７４　ＤＮＡリガーゼ
を用いて再連結して発現ベクターをｍ築した。

これをＴｒｐ　ｐＡＴΔＣｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｂｕｌＦ
Ｎｙ　／ｇｌｕｃａｇｏｎと命名した。次いで、この発
現プラスミドＴｒｐ　ｐＡＴΔＣｙｓ　５ｈｏｒｔ　ｈ
ｕｌＦＮ７／ｇｌｕｃａｇｏｎに挿入されたＤＮＡ断片
の塩基配列をＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、υ、Ｓ。

Ａ、、７４．５４６３−５４６７、　１９７７に従って
調へることにより、該ＤＮＡ断片がヒトのグルカゴンの
２９アミノ酸を正確にコードすることを確認した。

（１）Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮａ８０Ａ２／ｇｌｕ
ｃａｇｏｎの構築発現ベクターを、下記の■〜■項で得
られる３つのＤＮＡ断片を連結することにより構築した
。この発現ベクターの構築の概略を第６図に示す。

■ｈｕｌＦＮα８０Ａ２をコードする塩基配列を含むＣ
１ａ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片：ヒトＩＦＮα８０Ａ２の
発現プラスミドＴｒｐ　ｐＢＲｈｕｌＦＮａ　８０Ａ２
　（前出）のＴｒｐ遺伝子のプロモーターの後半部に相
当する２ｏヌクレオチド長の５ｅｎｓｅブライマー（上
記■式）、およびｈｕｌＦＮａｇＯＡ２の後半部をコー
ドする２５ヌクレオチド長のａｎｔｉｓｅｎｓｅプライ
マー（上記■）の２［類の一本鎖オリゴヌクレオチドを
化学合成した。これらのブライマーおよび丁ａｑポリメ
ラーゼを用い。

ＰＣＲ法（前出）によりＤＮＡ断片、を増幅させること
により、　　ｈｕｌＦＮα８０Ａ２をコードする塩基配
列を含むＤＮＡ断片を得た。この増幅ＤＮＡ断片をＣ１
ａ　ＩおよびＰｓｔ　Ｉで３７℃にて１時間消化し、　
　Ｃ１ａｌ−Ｐｓｔｌ断片を単離した。

■グルカゴンをコードする塩基配列を含むＰｓｔ　Ｉ−
ＢａｍＨＩ断片：上記（７）項で得られた発現プラスミ
ドＴｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕｃａｇｏｎを
Ｐｓｔ　ＩおよびＢａｍＨ１で３７°Ｃにて１時間消化
し、小さい方の断片を単離した（第６図）。

■プラスミドベクターＴｒｐ　ｐＡＴのＣ１ａ　Ｉ　−
Ｂａ１ｌ　Ｉ断片：上記（ア〉項で得られた発現プラス
ミドＴｒｐｐＡＴ　ｈｕｌＦＮｙ　／ｇｌｕｃａｇｏｎ
をＣ１ａ　ＩおよびＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化
し、大きい方の断片を単離した。

これら■〜■の　ＤＮＡ断片（いずれも、　　Ｎｕｃｌ
。

Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　Ｌ　２５３〜２ｆｉ４．１
９８０に従ってアガロースゲル電気泳動法により単離し
たもの）を第６図に示すように、　　Ｔ４　ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結して発現ベクターを構築し、　　Ｔｒ
ｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮａ　８０Ａ２／ｇｌｕｃａｇｏ
ｎと命名した。次いで、この発現プラスミドＴｒｐ　ｐ
ＡＴ　ｈｕ［ＦＮａ８０Ａ２／ｇｌｕｃａｇｏｎに挿入
されたＤＮＡ断片の塩基配列をＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ、、　７４．５４６３−５４６７、１９７７に従
って調べることにより、該ＤＮＡ断片がヒトのグルカゴ
ンの２９アミノ酸を正確にコードすることを確認した。

（オ）Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓｎ　　ｈｕｌＦＮ７／ｇ
ｌｕｃａｇｏｎの構築（イ）の項で得られたベクターＴ
ｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕｃａｇｏ
ｎをもとに構築した。この発現ベクターの構築の概略を
第７図（Ｃ）に示す。

まず、２１ヌクレオチド長のＳｅｎ　ｓｅブライマー（
上記（Ｘ）式）および２１ヌクレオチド長のＡｎｔｉｓ
ｅｎｓｅプライマー（上記Ｏａ）式）を化学合成した。

これらのプライマーおよびＴａｑポリメラーゼを用い。

Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮｙ　／ｇｌｕｃａ
ｇｏｎを鋳型として。

ＰＣＲ法により約１３０塩基対のＤＮＡ断片を増幅した
。この増幅ＤＮＡ断片をＸｈｏＩで３７℃にて１時間消
化し。

クレノー断片による処理を行なった。次に、ＸｂａＩで
３７°Ｃにて１時間消化して、約１１０塩基対のＤＮＡ
断片■を得た。

次に、ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮγ
／ｇｌｕｃａｇＯｎをもとに、　　ＤＮＡ断片■を以下
のようにして調製した。Ｔｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕ
ｌＦＮｙ　／ｇｌｕｃａｇｏｎをＰｓｔ　ｒで３７°Ｃ
にて１時間消化し、クレノー断片で処理した。

次に、　　ＸｂａＩで３７℃にて１時間消化し、大きい
方の断片■を得た。

上記得られた■および■のＤＮＡ断片を７４　ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結し９発現ベクター　Ｔｒｐ　ｐＡＴ
△ＣｙｓＩＩ　　ｈｕｌＦＮ７／ｇｌｕｃａｇｏｎを構
築した。次いで。

この発現ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、
Ｓ、Ａ、、　７４．５４６３〜５４６７、１９７？、　
　に記載の方法に従って調べることにより、該ＤＮＡ断
片がヒトのグルカゴンの２９アミノ酸を正確にフードす
ることを確認した。

Ｃの′　　　および 宿主細胞として大腸１１に１２株Ｃ６００（Ｆ−、ｔｈ
＋−１゜ｔｈｒ−１，１ｅｕＢ６．１ａｃＹ１．　ｔｏ
ｎＡ２１．５ｕｐＥ４４．λ−）を用い、上記のように
構築された発現プラスミド（ア）　　Ｔｒｐ　　ｐＡＴ
　　ｈｕｌＦＮｙ／ｇｌｕｃａｇｏｎ、　　　（イ）　
　Ｔｒｐ　　ｐＡＴ　　△ＣｙｓｈｕｌＦＮ７　／ｇｌ
ｕｃａｇｏｎ、　　　（つ）Ｔｒｐ　　ｐＡＴ　　ΔＣ
ｙｓ　　５ｈｏｒｔｈｕｌＦＮ　ｙ　／ｇｌｕｃａｇｏ
ｎ、　（１）Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮａ８０Ａ２／
ｇｌｕ−ｃ　ａ　ｇ　ｏｎ、　　または（オ）Ｔｒｐ　
ｐＡＴΔＣｙｓ　ＩＩ　ｈｕｌＦＮｙ　／ｇｌｕ−ｃａ
ｇｏｎで形質転換を行った。発現プラスミドが導入され
た形質転換体は、いずれもテトラサイクリンに対する抵
抗性を獲得するので、テトラサイクリン含有培地（１５
μｇ／＋ｌｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ平板培
地）上で３７℃にて一晩培養し、コロニーを形成したも
のを遺択した。次いで、形成されたコロニーを改変Ｍ９
培地中で３７℃にて２４時間培養し、培養後の菌体を遠
心分離することにより集め、　　ＳＤＳゲル試料用緩衝
液（０，１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　　１％ＳＤＳ、　
　２０％　５ｕｃｒｏｓｅ、　　１％β−メルカプトエ
タノール、　　ｐＨ６，８）に懸濁した。この懸濁液を
５ＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルをクマシーブリリアント
ブルーＲで染色すること、および抗グルカゴンポリクロ
ーナル抗体によるウェスタン解析を行うことにより。

グルカゴンを含む融合タンパクの生産の有無を調べた。

その結果、（ア）、　　（（）、　　（１）または（オ
）の発現プラスミドが導入された形質転換体においては
。

分子量約２１キロダルトンの顆粒タンパクを、また（つ
〉の発現プラスミドが導入された形質転換体においては
約１４キロダルトンの顆粒タンパクを生産しており、該
タンパクそのものが抗グルカゴンｔｄｔと反応すること
が判明した。このようにして、形質転換体は、いずれも
目的のグルカゴンを含む融合タンパクを生産しているこ
とが確認された。

Ｄ１１！”タンパクの可　　　ｖ８プロテアーゼによる
およびグルカゴンの 上記（ア）、（イ）、（つ）、（１）または（オ〉の発
現ベクターが導入された形質転換体を改変Ｍ９培地中で
３７°Ｃにて２４時間培養した後、遠心分離して菌体を
集めた。この菌体を緩衝液Ａ（８ｇ／ｌ　ＮａＣ１，０
，２ｇ／ｌ　ＫＣＩ。

２．９ｇ／　Ｉ　Ｎａ２ＨＰＯａ・１２Ｈ２０，０，２
ｇ／　Ｉ　ＫＨ２ＰＯａ、　５ｍＭＥＤＴＡ、　ｌｏｍ
Ｍβ−メルカプトエタノールおよび１０ｍＭベンザミジ
ン、　　ｐＨ６，６５）に懸濁し、よく攪拌した後に遠
心分離して菌体を洗浄した。洗浄菌体を集め、再び上記
緩衝液Ａに懸濁し、リゾチームを最終濃度が２ｍｇ／ｇ
菌体湿重量となるように加え、３５℃にて１時間反応さ
せた。その後１反応液を超音波処理し、遠心分離するこ
とにより顆粒画分を沈澱させたペレットを回収した。こ
の顆粒画分ベレ・ノドから、　　（Ｄ−１）　１段階で
酵素反応を行う方法；または（Ｄ−２）　２段階で酵素
反応を行う方法；によりグルカゴンを融合タンパクから
単離した。

（Ｄ−１）　１段階で酵素反応を行う方法上記（ア）項
の発現ベクターが導入された形質転換体から得られた顆
粒画分ペレットを、出発培養量の１／６量の緩衝液Ａ（
６Ｍグアニジン塩酸を含有する）に懸濁してよく攪拌し
た後、超音波処理し。

室温にて２時間放置して可溶化した。次いで、この操作
により可溶化されなかった画分を遠心分離により除去し
、上清液を２Ｍのグアニジン塩酸を含有する緩衝ＭＢ　
（５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐ
Ｈ７，８）に対して一晩透析した。この透析内液を等量
の緩衝液Ｂと混合してグアニジン塩酸の濃度をＩＭとし
。

これを標品ａとした。標品ａを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析した結果、培養液１　当りＩｇ（約５０μｍｏｌ）
のヒトＩＦＮγ　融合グルカゴンが産生されていた。標
品ａに、　　Ｇｌｕ残基を特異的に切断するＳ、　ａｕ
ｒｅｕｓ由来のプロテアーゼＶｌｌ　（Ｓｉｇｍａ社製
、　　Ｎｏ、Ｐ−８４００）を反応溶液中のタンパク当
り１／１０１：　（Ｗ／Ｗ）加え、３７°Ｃにて１時間
反応させた。目的とするグルカゴンはＧｌｕ残基を介し
てＩＦＮγと融合しており、グルカゴン中にはＧｌｕ残
基は存在しないので、このｖ８プロテアーゼ処理により
グルカゴンが完全な形で切り出される。このようにして
得られた標品す中には。

グルカゴンおよびヒトＩＦＮγ　が分解されてできた種
々の長さのペプチドが混在している。この混在する種々
の長さのペプチドを除去するために、標品すを遠心分離
して沈澱物を除去し、ざらに上清液をＣＩ８カラム（４
，６ａ＋ｍ内径Ｘ　２５０ｍ＋ａ）を用いた逆相ＨＰＬ
Ｃに供した。出発溶離液として３２％アセトニトリル−
０，１％　トリフルオロ酢酸系溶媒を用い、溶出開始５
分後からトリフオロ酢酸中のアセトニトリルの濃度を１
分間あたり０．５％の割合で増加させ。

４２％にまで上げることにより溶出を行った。

結果を第９図（ａ）に示す。グルカゴン標準物質を同条
件下で逆相ＨＰＬＣにより分析すると、保持時間１９．
７分の位置に検出されるので、第９図（ａ）において２
０分前後に溶出されてくる画分を集めた。

次にこの画分をイオン交換１１ＰＬＣにより精製した。

１０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，５，２０％アセ
トニトリル（緩衝液Ｃ）で緩衝化した陰イオン交換体Ｄ
ＥＡＥ−５ＰＷ（７，５ｍｍ内径ｘ　７５ｍｍ）にグル
カゴン含有画分を付した。５分間、緩衝液Ｃで洗浄した
後、緩衝液Ｃ中で０〜０．１ＭＮａＣ１の線状濃度勾配
（３０分間でＮａＣ１濃度を０から０．１Ｍに増加させ
る：流速１．０ｍｌ／＋ａｔｎ）により分離した。結果
は第９図（ｂ）に示す通りであり、主成分（保持時間１
９．３分、標品ｂ）は、標準グルカゴンの溶出位置から
グルカゴンである事が確認されたので、標品すについて
アミノ酸分析およびアミノ酸配列分析を次の方法により
実施した。

これらの結果をそれぞれ表１および表２に示す。

アミノ酸分析法 検体をＨＰＬＣ（Ｂｒｏｖｎｌｅｅ、ａｑｕａｐｏｒｅ
　ＲＰ−３００ｃｏｌｕｍｎ）で脱塩し、　　４Ｍメタ
ンスルホン酸（０，２％３−（２−アミノエチル）イン
ドールを含む）を用いて１１０　”Ｃで２４時間加水分
解した。これを日立アミノ酸分析機（Ｍｏｄｅｌ　８３
５）によりアミノ酸分析を行った。

アミノ酸配列分析法 検体をＨＰＬＣ（Ｂｒｏｖｎｌｅｅ、ａｑｕａｐｏｒｅ
　ＲＰ−３００ｃｏｌｕｍｎ）で脱塩した後、　　Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７Ａ　Ｐｒｏ
−ｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて分析した。

この精製工程において、融合タンパクＩｇ　（約５０μ
ｍｏｌ）から、精製グルカゴン約３３＋＋ｇ　（約１０
μ＋ａｏｌ）が得られた。すなわち、培養液１　当り約
３３Ｂの精製グルカゴンが得られた。ただし、この方法
によればＧｌｕを切断する酵素が大量に必要である。

（以下余白） 表１ アミノ酸組威 アミノ酸 分析値 理論値 Ｄ−２）　２段階で酵素反応を行う方法上記（７）、　
　（（）、　　（つ）、（工〉および（オ〉の発現ベク
タが導入された形質転換体の顆粒画分ペレットをい１次
の方法によりそれぞれグルカゴンの製造行った。まず顆
粒画分ベレットのＩｇを緩衝液−１８Ｍグアニジン塩酸
、　　５０ＩＩＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３，５ｍＭ　ＥＤＴＡ
。

ｍＭ　　ＤＴＴ、　　ｐＨ７，１１）　３５ｍ１に溶解
させた。次いで。

の溶解液にグアニジン塩酸を含有しない緩衝液（５０１
１１Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３，５１Ｍ　ＥＤＴＡ、　　１１
００Ｉ　ＤＴＴ、　　ｐＨ７，８）５　ｍｌを加えて、
グアニジン塩酸の濃度を２Ｍに。

してタンパク濃度を２〜３Ｂ／ｍｌ　（ＢｉｏＲａｄ社
製Ｐｒ。

１ｎａｓｓａｙ　Ｋｆｔにより測定）とした。この溶液
に。

ａｕｒｅｕｓ由来のプロテアーゼＶ８（Ｓｉｇｍａ社製
、　　Ｎｏ。

８４００）を反応溶液中のタンパクに対して１１５００
ｊｌ／Ｗ）加え、２５℃にて穏やかに攪拌して反応させ
た。

１間後に塩酸を添加してｐＨを３．０に調整することよ
り反応を停止させた。酵素反応中および反応止後の反応
液の一部は、Ｖｙｄａｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｃ４カラム、
　４６ｃ＊内径Ｘ　１５．　Ｏｃｍ）を用いた逆相■Ｐ
ＬＣに供し。

酸物を調べた。出発溶離液としては２５％アセトニトリ
ル−０，１％　トリフルオロ酢酸系溶媒を用い。

溶出開始から２５分後までにトリフオロ酢酸中のアセト
ニトリルの濃度を３５％にまで直線的に上げることによ
り、溶出を行った。その結果２反応時間の経過と共に、
融合タンパクが部分的に分解された中間体および少雪の
グルカゴンが生成していることがわかった。

そこで、酵素反応後の反応液を遠心分離して不溶物を除
去し、上清を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５カラム（５ｃ
ｍ内径Ｘ　３０ｃｍ、　　内容ｉ１５９ｈ＋ｌ）を用い
たゲル濾過クロマトグラフィーに供して脱塩を行った。

溶離液としては、　　５ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する５ｈ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，３）を用い、中間体およびプロ
テアーゼｖ８を含有する高分子画分を集めた。この両分
約１５０ｍ１を希ＮＨａＯＨでｐＦ［を７．８に調整し
、再び２５℃で穏やかに攪拌して反応を行った。その結
果９反応液中に含有されるプロテアーゼｖ８が再び活性
化し、中間体に作用し、約５時間で完全に該中間体から
グルカゴンが生成した。この反応液に尿素を最終濃度が
６Ｍになるように添加し、酢酸にてｐＨ５，０に調製し
た（最終容量約２００ｍｔ）。これを、予め緩衝液−３
（酢酸でｐＨ５，０に調整した６Ｍ尿素溶液）で平衡化
したＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２，０ｃｔｓ内径
Ｘ２Ｑ、０ＣＩＩ＋、　　内容ｊ１６３ｍｌ、　　Ｆａ
ｓｔ　Ｆｌｏｗ　ｔｙｐｅ）を用いたイオン交換クロマ
トグラフィーに供した。カラムを、　　１２（１ｍｌの
緩衝液−３および０．０５Ｍ　ＮａＣｌを含有する１２
０ｍ１　（Ｄ緩衝液−３を順次用いて洗浄し、非吸着画
分を除去した。次いで、緩衝液−３中のＮａＣｌ濃度を
０．０５〜０．１５Ｍに増加させたＮａＣ１直線濃度勾
配（カラム容量の１５倍量を用いる）により溶出すると
、グルカゴン画分約０．１Ｍ　ＮａＣ１の濃度で溶出さ
れた。グルカゴン画分（約７０ｍ１）は、直ちに５０１
Ｍ酢酸で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５カラム
（５ｃｍ内径Ｘ　３０ｃｍ、　　内容盟約５９０ｍ１）
を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供し、脱塩した
。この段階でグルカゴンの純度は約９７〜９８％であっ
たため、さらに分取用ＨＰＬＣにより精製を行った。

ゲル濾過で得られたグルカゴンを含有する画分を、　　
２５．０％アセトニトリル−０，１％トリフルオロ酢酸
溶媒系で平衡化したＶｙｄａｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＣＪ
カラム（２，２ｃｍ内径Ｘ　２５ｃｍ、　　１０〜１５
　！Ｚ　ｒｓ充填剤、ポアサイズ３００Ａ）　１．：供
し、流速４ａｌｌ＋＋ｉｎ、　　１２０分でアセトニト
リル濃度が２５〜３０％になるような直線濃度勾配によ
りグルカゴンを分離・精製した。その結果、グルカゴン
は約９０分で溶出した。このようにして得られた精製グ
ルカゴンの収量は、１ｇの顆粒画分ペレット当り　（ア
）約１６．３ｍｇ、　　（イ〉約２１．９＋Ｉ１ｇ、　
　および（オ）約２３．１ｍ１ｇテあり、融合タンハク
１ｇ当り（ア）４９．０■、　（イ）５５．８ｍｇ、　
　（オ）６９．４ｍｇであった。（つ）、（１）でも同
様にして精製グルカゴンが得られた。

この精製グルカゴン（ア）の（ｉ）純度、　　（ｉｔ）
アミノ酸組成、　　（ｆｉｔ）アミノ酸配列、および（
ｉｖ）生物活性についての分析を、以下のようにして実
施した。

（ｉ）純度 純度は、　　Ｖｙｄａｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ４カラム
（０，４６ｃｍ内径Ｘ１５．Ｏｃ■）を用いた逆相ＨＰ
ＬＣにて調べた。出発溶離液としては、２５％アセトニ
トリル−０，１％　トリフルオロ酢酸系溶媒を用い、溶
出開始力）ら２５分後までにトリフォロ酢酸中の７セト
ニトリルの濃度を３５％にまで直線的に上げることによ
り溶出を行った。得られたＨＰＬＣのチャートを第１０
図（ａ）に示す。

第１Ｏ図（ｃ）は市販の天然型グルカゴン（Ｓ　ｉｇｍ
　ａ社Ｍ　）のチャートを示す。第１Ｏ図（ａ）から、
精製グルカゴンは単一ピークとして得られ、不純物を含
まないこと（ＨＰＬＣによる純度１００％）がわかる。

しかも第１０図（ｃ）の天然型グルカゴンの保持時間（
２３，０８８分）とほとんど同じ保持時間（２３，０１
６分）で溶出されているので、天然型グルカゴンと同じ
グルカゴンであることがわかる。上記方法により得られ
た他のグルカゴンのサンプルの［１ＰＬＣのチャートを
第１Ｏ図（ｂ）に示す。この精製グルカゴンの保持時間
は２０．４０４分であり、その純度は９９．３％であっ
た。

精製グルカゴン（イ〉〜（オ）を用いた場合も実質的に
同一の結果が得られた。

（ｉｉ）アミノ酸組成 アミノ酸分析に先立って、検体を４Ｍメタンスルホン酸
（０，２％３−（２−７ミノエチル）インドールを含む
）を用いて１１０℃で２４時間加水分解した。これを日
立アミノ酸分析機（Ｍｏｄｅｌ　　８３５）にかけ。

アミノ酸分析を行った。その結果を表３に示す。

表３から、精製グルカゴン（ア）のアミノ酸組成は理論
値と良く一致することがわかる。精製グルカゴン（イ）
〜（オ）を用いた場合も実質的に同一の結果が得られた
。

（ｔｉｔ）アミノ酸配列 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７Ａ　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて精製グルカ
ゴン（ア〉のアミノ酸配列の分析を行った。その結果を
表４に示す。表４から、精製グルカゴン（ア）は天然型
グルカゴンと全く同一の配列を有することがわかった。

精製グルカゴン（イ）〜（オ）を用いた場合も実質的に
同一の結果が得られた。

表３ アミノ酸組成 （以下余白） 表４ ８５ ４１２ ５９７ １４６ ４７３ ５０ ３３ ７５ １６２ ５７ ５８ ０４ ０２３ ※負荷：　３８５６　ｐ＋ａｏｌ アくノ酸配列 （ｊｖ）生物活性 生物活性としては、ラット肝臓膜画分を用いたレセプタ
ーアッセイ、ラット肝臓遊離細胞を用いたｃＡＭＰのレ
スポンス、および潅流肝からのグルコースの放出の項目
について調べた。その結果、精製グルカゴン〈１）〜〈
オ）はそれぞれの項目について天然型グルカゴンと同じ
活性を示し、天然型グルカゴンと同一であることが確認
された。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、融合タンパクＸ−Ｇｌｕ
−グルカゴンから、簡便に効率よく、少量の酵素で経済
的に天然グルカゴンと同一のグルカゴンを得る方法が提
供される。このグルカゴンは遺伝子組換え技術を用いて
生産されるので、大量・安価に得ることができる。しか
も天然のヒトのグルカゴンとアミノ酸配列が全く同じな
のでアレルギー反応が起こる心配もなく、従来用いられ
ていたグルカゴン製剤と全く同じように使用され得る。

４、　　　　　の　　　な！　Ｂ 第１図は、ヒトグルカゴンをコードする　ＤＮＡ配列間
である。

第２図（ａ）は９本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ
ｈｕｌＦＮ　７　／ｇｌｕｃａｇｏｎの構築に用いたプ
ラスミドｐＧＡ　１の構築を示す概略図である。

第２図（ｂ）は９本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ
ｈｕｌＦＮ　７　／ｇｌｕｃａｇｏｎの構築に用いたプ
ラスミドＴｒｐｐＡＴ　ｈｕｌＦＮ７　／Ｋａｌｌｉｋ
ｒｅｉｎの構築を示す概略図である。

第２図（ｃ）は９本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ
ｈｕｌＦＮγ／ｇｌ　ｕｃａｇｏｎの構築を示す概略図
である。

第３図は、　Ｔｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕｌＦＮ７　／ｇｌｕ
ｃａｇｏｎに含まれるグルカゴンをコードするＤＮＡ　
、　　およびその前後の接続部分のＤＮＡを示す塩基配
列図である。

第４図（ａ）は１本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ
△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮ７　／ｇｌｕｃａｇｏｎの構築に
用いたＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙｓ　ｈｕ［ＦＮγの構築を
示す概略図である。

第４図（ｂ）は２本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ
△Ｃｙｓ　ｈｕｌＦＮ７　／ｇｌｕｃａｇｏｎの構築を
示す概略図である。

第５図は９本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ△Ｃｙ
ｓ　５ｈｏｒｔ　ｈｕｌＦＮγ／ｇｌｕｃａｇｏｎの構
築を示す概略図である。

第６図は１本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴｈｕ［
ＦＮ　ａ　８０Ａ２／ｇｌｕｃａｇｏｎの構築を示す概
略図である。

第７図（ａ）は、ヒトＩＦＮα８０Ａ２をコードする塩
基配列を含むＤＮＡ断片のＰＣＲ法による合成を示す概
略図である。

第７図（ｂ）は９本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ
△ＣｙｓＩ［ｈｕ［ＦＮ７／ｇｌｕｃａｇｏｎの構築時
において、グルカゴンとその前後をコードする遺伝子配
列の。

ＰＣＲ法による増幅を示す概略図である。

第７図（Ｃ）は１本発明の発現ベクターＴｒｐ　ｐＡＴ
△Ｃｙｓ　ｎ　ｈｕ　ＩＦＮ　７　／ｇｌｕｃａｇｏｎ
の構築を示す概略図である。

第８図は、ヒトＩＦＮα８０Ａ２のＤＮＡ配列およびそ
れに対応するアミノ酸を示す配列図である。

第９図（ａ）および（ｂ）は９本発明方法により遺伝子
組換え技術を用いて得られたグルカゴンの逆相ＨＰＬＣ
およびイオン交換ＨＰＬＣの結果を示すチャートである
。

第１０図（ａ）および（ｂ）は、それぞれ本発明方法に
より遺伝子組換え技術を用いて得られたグルカゴンの逆
相）ＩＰＬＣのチャートである。

第１０図（ｃ）は、市販の天然型グルカゴンの逆相ＨＰ
ＬＣのチャートである。

第１１図は、ヒトグルカゴンのアミノ酸配列およびそれ
をコードするヒト由来のＤＮＡ配列を示す配列図である
。

以上 第２図（ａ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式（ I ）： Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕｃａｇｏｎ（ I ） （式中、Ｘはアミノ酸７０〜１７０個のリーダー配列、
   Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ｇｌｕｃａｇｏｎはグルカ
   ゴンのアミノ酸配列を表す）で示される融合タンパクを
   得る工程；および 該融合タンパクをＧｌｕのＣ末端部分を特異的に切断し
   得る酵素により切断し、グルカゴンを採取する工程； を包含するグルカゴンの製造法。 ２、前記Ｘがインターフェロンγ，△Ｃｙｓインターフ
   ェロンγ，またはインターフェロンα８０Ａ２のＮ末端
   部分配列を含む配列である、請求項１に記載のグルカゴ
   ンの製造法。 ３、前記グルカゴンのアミノ酸配列が式（II）【遺伝子
   配列があります。】 で示される、請求項１に記載のグルカゴンの製造法。 ４、前記融合タンパクが、前記式（ I ）で示される融
   合タンパクを発現する発現ベクターを大腸菌に導入して
   得た形質転換体を培養して前記融合タンパクを生産させ
   る工程を含むプロセスにより得られる、請求項１に記載
   のグルカゴンの製造法。 ５、前記グルカゴンが次の工程を含むプロセスにより採
   取される、請求項１に記載のグルカゴンの製造法： 前記融合タンパクを変性剤または界面活性剤により可溶
   化する工程； 得られた可溶化液を希釈して変性剤または界面活性剤の
   濃度を下げる工程； 該希釈液に前記酵素を加え、該融合タンパクが部分的に
   分解した可溶性の中間体を含有する反応液を得る工程； 該反応液を脱塩することにより、該中間体および酵素を
   含有し、かつ変性剤または界面活性剤を含有しない画分
   を得る工程； 該画分に含まれる酵素による反応を引き続いて行い、グ
   ルカゴンを遊離させる工程；および該グルカゴンを単離
   する工程。 ６、前記酵素がスタフィロコッカスアウレウス（￥Ｓｔ
   ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ￥￥ａｕｒｅｕｓ￥）由来の
   プロテアーゼＶ８である、請求項１に記載のグルカゴン
   の製造法。７、式（III）で示されるグルカゴンをコー
   ドするＤＮＡ配列： 【遺伝子配列があります。】 ８、式（ I ）： Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕｃａｇｏｎ（ I ） （式中、Ｘはアミノ酸７０〜１７０個のリーダー配列、
   Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ｇｌｕｃａｇｏｎはグルカ
   ゴンのアミノ酸配列を表す）で示される融合タンパクを
   コードするＤＮＡ配列を有する発現ベクター。 ９、【遺伝子配列があります】である、請求項８に記載
   の発現ベクター。 １０、請求項８または９に記載の発現ベクターを大腸菌
   に導入して得られる形質転換体。１１、高速液体クロマ
   トグラフィーにより測定したときの純度が９９％以上で
   ある精製グルカゴン。