JP2013523619A - 新規のグルカゴンアナログ - Google Patents
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Abstract
Description
X2がAibまたはD-Serを表し;
X4がD-Pheを表し;
X9がGluを表し;
X10がCys、Lys、Ornまたは(p)Tyrを表し;
X12がCys、Lys、Orn、Ile、His、Gln、Tyr、LeuまたはArgを表し;
X16がCys、Glu、LysまたはOrnを表し;
X17がCys、Gln、Lys、HisまたはOrnを表し;
X18がCys、Gln、Ala、Lys、HisまたはOrnを表し;
X20がCys、Arg、Lys、Glu、HisまたはOrnを表し;
X21がCys、Orn、Glu、Arg、HisまたはLysを表し;
X24がCys、Lys、Arg、His、Glu、Asp、Gly、SerまたはOrnを表し;
X25がCys、Arg、Lys、His、Glu、Asp、Gly、Phe、Ser、Tyr、(p)TyrまたはOrnを表し;
X27がMet(O)、Val、Ile、Leu、Arg、His、Cys、Lys、Glu、GlnまたはOrnを表し;
X28がCys、Lys、His、Arg、Ser、Thr、Glu、Asp、Ala、GlnまたはOrnを表し;
X29がCys、Glu、Asp、Lys、His、Arg、ProまたはOrnを表し;
X30が存在しないか、またはCys、Lys、Arg、Glu、Gly、ProまたはOrnを表す、先行する実施形態のうちのいずれか1つによるグルカゴンペプチド。
Z1-Z2-Z3-Z4 [II]
[式中、
Z1は、式IIa、IIbまたはIIcの1つによる構造を表し;
式IIc中のmは5〜11であり、
式IIc中のCOOH基は、フェニル環上の2、3または4位に結合していてよく、式IIa、IIbおよびIIc中の記号*は、Z2中の窒素への結合点を表し;Z2が存在しない場合、Z1は記号*でZ3上の窒素に結合し;Z2およびZ3が存在しない場合、Z1は記号*でZ4上の窒素に結合している)
Z2は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;
Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ3の窒素に結合しており;Z3が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ4の窒素に結合しており、かつZ3およびZ4が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に結合している)
Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoまたはIIpの1つによる構造を表し;
Z4は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;ここで、各アミノ酸部分は独立に、LまたはDのいずれかであり、Z4は、記号*で示されている炭素を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に結合している]。
Z1-Z2-Z3-Z4- [II]
[式中、
Z1は、式IIa、IIbまたはIIcの1つによる構造を表し;
Z2は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjまたはIIkの1つによる構造を表し;
Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoまたはIIpの1つによる構造を表し;
(ここで、アミノ酸部分はそれぞれ独立に、立体化学LまたはDを有する)]。
110. 前記置換基のZ2およびZ4が独立に、γGlu、Gluおよび/またはAspなどの負に荷電している部分によって表される、先行する実施形態のいずれかによるグルカゴンペプチド。
Nε24-([(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]-5-オキソペンタノイル])[Lys24,Leu27]グルカゴン
N-ε26-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリル)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
NεB29-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu-(desB30)ヒトインスリン
i)デスアミノHis7、Aib8、Aib22、Arg26、Aib35および/またはLys37のうちの少なくとも1個を含んでよく;
ii)少なくとも1個、好ましくは少なくとも2個、より好ましくは2個の遊離カルボン酸基を含むアルブミン結合部分を含むGLP-1誘導体;または薬学的に許容されるその塩であってよく;
iii)ジカルボン酸のアシル基を含むアルブミン結合部分を含み、好ましくはC12、C14、C16、C18、C20、C22またはC24、最も好ましくはC16、C18またはC20などの全部で12から24個の炭素原子を含むGLP-1誘導体であってよく;ここで好ましくは、a)アシル基は、GLP-1ペプチドのリシン残基のイプシロンアミノ基にリンカーを介して結合しており;b)リンカーは、少なくとも1個のOEG基および/または少なくとも1個のTrx基ならびに場合によって、追加的に少なくとも1個のGluを含み;かつ/または
iv)下記の化合物:
N-イプシロン26-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリル)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
および薬学的に許容されるその塩、アミド、アルキルまたはエステルからなる群から選択することができる化合物である。
NεB29-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu-(desB30)ヒトインスリン
受容体を活性化させる受容体アゴニスト;受容体を活性化させるも、完全アゴニストよりも低い効力を有する部分アゴニスト。部分アゴニストは、完全アゴニストの作用を部分的に阻害する受容体部分アンタゴニストとして機能する。
アゴニストの作用を遮断するが、受容体構成活性に影響を及ぼさない受容体中和アンタゴニスト。
アゴニストの作用を遮断すると同時に、受容体-構成活性を弱める受容体インバースアゴニスト。完全インバースアゴニストは、受容体-構成活性を完全に弱め;部分インバースアゴニストは、受容体-構成活性をより低い規模に弱める。
Z1-Z2-Z3-Z4 [II]を有し得る置換基に関する
[式中、
Z1は、カルボン酸または5-イルテトラゾールなどの負に荷電している基を末端に有する親油性炭化水素鎖であってよく、
Z2およびZ4は、1個または複数のガンマ-グルタミン酸またはグルタミン酸の部分を含んでよく、
Z3は、1個または複数のAdoの単位を含んでよい]。部分Z4が存在しない本発明の置換基の例は、下式であってよい
Z1-Z2-Z3-Z4 [II]
[式中、
Z1は、式IIa、IIbまたはIIcの1つによる構造を表し;
式IIc中のmは5〜11であり、
式IIc中のCOOH基は、フェニル環上の2、3または4位にあってよく、式IIa、IIbおよびIIc中の記号*は、Z2中の窒素への結合点を表し;Z2が存在しない場合、Z1は記号*でZ3上の窒素に結合し;Z2およびZ3が存在しない場合、Z1は記号*でZ4上の窒素に結合している)
Z2は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表す;
Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ3の窒素に結合しており;Z3が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ4の窒素に結合しており、かつZ3およびZ4が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素原子を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に結合している);
Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoまたはIIpの1つによる構造を表し;
Z4は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;ここで、各アミノ酸部分は独立に、LまたはDのいずれかであり、Z4は、記号*で示されている炭素を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に結合している]。
Z2は存在しないか、式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIj、もしくはIIkの1つによる構造を表し;
Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoまたはIIpの1つによる構造を表し;
N-ε26-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリル)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)。
N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
NεB29-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu-(desB30)ヒトインスリン
269. ThT原線維形成アッセイにおいて70%を超える回収率を有する、先行する実施形態のうちのいずれかによるグルカゴンペプチド。
His-X2-Gln-Gly-Thr-X6-X7-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-X18-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-X25-Leu-X27-X28-X29-X30 [I]
[式中、
X2がSer、AibまたはD-Serを表し;
X6がPheまたはGlnを表し;
X7がThr、LysまたはOrnを表し;
X10がTyr、Lys、Ornまたは(p)Tyrを表し;
X12がLys、OrnまたはArgを表し;
X16がSer、Glu、Thr、LysまたはOrnを表し;
X17がArg、Gln、LysまたはOrnを表し;
X18がArg、Gln、Ala、LysまたはOrnを表し;
X20がArg、Gln、LysまたはOrnを表し;
X21がAsp、GluまたはLysを表し;
X24がGln、Lys、Arg、His、Glu、Asp、Gly、Pro、SerまたはOrnを表し;
X25がTrp、Arg、Lys、His、Glu、Asp、Gly、Pro、Phe、Ser、Tyr、(p)TyrまたはOrnを表し;
X27がMet、Met(O)、Val、Pro、Leu、Arg、LysまたはOrnを表し;
X28がAsn、Lys、Arg、Ser、Thr、Glu、Asp、Ala、Gln、ProまたはOrnを表し;
X29がThr、Glu、Asp、Lys、Arg、ProまたはOrnを表し;
X30が存在しないか、またはLys、Gly、ProまたはOrnを表す、
および2個以上の負に荷電している基を含むアルブミン結合残基(ここで、前記負に荷電している基のうちの1個は前記アルブミン結合残基の末端であり、アルブミン結合残基は、式Iの化合物の次のアミノ酸位置:X7、X10、X12、X16、X17、X18、X20、X21、X24、X25、X27、X28、X29および/またはX30のうちの1つまたは複数にあるLysのイプシロン位またはOrnのデルタ位に結合している)]。
Z1-Z2-Z3-Z4 [II]
[式中、
Z1は、式IIa、IIbまたはIIcの1つによる構造を表し
式IIc中のmは5〜9であり、
式IIc中のCOOH基は、フェニル環上の2、3または4位にあってよく、
式IIa、IIbおよびIIc中の記号*は、Z2、Z3またはZ4中の窒素への結合点を表す);
Z2は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;
Z2は、記号*で示されている炭素原子を介して、Z3、Z4の窒素またはグルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素もしくはオルニチンのデルタ窒素に結合している);
Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoまたはIIpの1つによる構造を表し;
Z4は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;ここで、各アミノ酸部分は独立に、LまたはDのいずれかであり、Z4は、記号*で示されている炭素を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に結合している]。
本発明による化合物を含有する医薬組成物は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、1985年またはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年に記載されているとおりの慣用の技術によって調製することができる。
られている。便宜的にはRemington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照されたい。
よびその塩(例えばオレイン酸およびカプリル酸)、アシルカルニチンおよび誘導体、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンのNα-アシル化誘導体またはリシンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンおよび中性アミノ酸もしくは酸性アミノ酸の任意の組み合わせを含むジペプチドのNα-アシル化誘導体、中性アミノ酸および2種の荷電アミノ酸の任意の組み合わせを含むトリペプチドのNα-アシル化誘導体、DSS(ドクセートナトリウム、CAS登録番号[577-11-7])、ドクセートカルシウム、CAS登録番号[128-49-4])、ドクセートカリウム、CAS登録番号[7491-09-0])、SDS(ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸またはその誘導体、胆汁酸およびその塩ならびにグリシンまたはタウリン結合体、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート、陰イオン性(アルキル-アリール-スルホネート)一価界面活性剤、両性イオン性界面活性剤(例えば、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホネート、3-コラミド-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホンネート、陽イオン性界面活性剤(第四級アンモニウム塩基)(例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム)、非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシルβD-グルコピラノシド)、プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドをエチレンジアミンに順次付加することに由来する四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン(例えば、Tetrronic)から選択されるか、または界面活性剤は、イミダゾール誘導体またはそれらの混合物からなる群から選択され得る。これらの特定の界面活性剤のそれぞれ1つが、本発明の代替実施形態を構成する。
使用されている略語のリスト:
DCM: ジクロロメタン
Dde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIC: ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU: (O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ-ホスフェート)
HBTU: (2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HFIP: 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt: 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
ivDde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
LCMS: 液体クロマトグラフィー質量分析
MeOH: メタノール
Mmt: 4-メトキシトリチル
Mtt: 4-メチルトリチル
NMP: N-メチル-ピロリドン
OEG: 8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OtBu: tert-ブチルエステル
PBS: リン酸緩衝食塩水
RP: 逆相
RP-HPLC: 逆相高速液体クロマトグラフィー
RT: 室温
Rt: 保持時間
SPPS: 固相ペプチド合成
TFA: トリフルオロ酢酸
TIPS: トリイソプロピルシラン
Trt: トリフェニルメチルまたはトリチル
UPLC: 超高速液体クロマトグラフィー
この項は、樹脂結合ペプチドを合成する方法(アミノ酸を脱保護する方法、樹脂からペプチドを切断し、それを精製する方法を包含するSPPS法)、さらに、生じたペプチドを検出および特性決定する方法(LCMSおよびUPLC法)に関する。
SPPS法A
SPPS法Aは、Protein Technologies(Tucson、AZ 85714 米国)製のPrelude Solid Phase Peptide SynthesizerでのFmoc化学によるペプチド合成に関する。
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-ブトキシ-4-[(18-tert-ブトキシ-18-オキソ-オクタデカノイル)アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]酢酸などの予め形成されたアルブミン結合部分のカルボン酸(4当量)、HOAt(4当量)およびDIC(4当量)のNMP-DCM(4:1)中の溶液を30分間撹拌し、その後、これを樹脂に加えた。樹脂を混合物中で30分間撹拌し、その後、コリジン(4当量)を加えた。樹脂を16時間撹拌し、その後、NMP(5×)およびDCM(5×)で洗浄した。
上記(SPPC方法A)のとおりのPreludeペプチドシンセサイザーによるステップ手順で、適切に保護された構成単位を使用して、アルブミン結合部分を導入することができるが、但し、アミノ酸と、Fmoc-Ado-OH、Fmoc-Glu-OtBuおよびオクタデカン二酸モノtert-ブチルエステル(または類似のC8、C10、C12-、C14-、C16-、C20-二酸モノtert-ブチルエステル)を包含する脂肪酸誘導体とを各ステップにおいて6時間カップリングさせるように変更した。各カップリングステップの後に、未反応のペプチド中間体を、酢酸無水物およびコリジンを過剰(>10当量)に使用してキャップした。
合成の後に、樹脂をDCMで洗浄し、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)で2〜3時間処理することによってペプチドを樹脂から切断し、続いて、ジエチルエーテルで沈殿させた。沈澱物をジエチルエーテルで洗浄した。
粗製ペプチドを、水/MeCN(4:1)などの水およびMeCNの適切な混合物に溶かし、逆相分取HPLC(Waters Deltaprep 4000またはGilson)によって、C18-シリカゲルを含有するカラムで精製する。溶離を0.1%のTFAを含有する水中で上がっていくMeCNの勾配で行う。該当フラクションを分析用HPLCまたはUPLCによってチェックする。純粋な標的ペプチドを含有するフラクションを混合し、減圧下で濃縮する。生じた溶液を分析し(UPLC、HPLCおよびLCMS)、化学発光窒素特異的HPLC検出器(Antek 8060 HPLC-CLND)を使用して、または280nmでのUV吸収を測定することによって、生成物を定量化する。生成物をガラスバイアル中に分散させる。バイアルに、Milliporeガラス線維プレフィルターで封をする。凍結乾燥によって、ペプチドトリフルオロアセテートが白色の固体として得られる。
LCMS方法
LCMS
方法:LCMS_2
Perkin Elmer Sciex API 3000質量分析計を使用して、Perkin Elmer Series 200 HPLCシステムから溶離した後の試料の質量を同定した。
溶離剤:A:水中0.05%のトリフルオロ酢酸;B:アセトニトリル中0.05%のトリフルオロ酢酸。カラム:Waters Xterra MS C-18×3mm、内径5μm。勾配:1.5ml/分で7.5分かけて5%〜90%のB。
LCMS_4を、Waters Acquity UPLCシステムおよびMicromass製のLCT Premier XE質量分析計からなる構成で行った。
溶離剤:
A:水中0.1%のギ酸
B:アセトニトリル中0.1%のギ酸。適切な体積の試料(好ましくは2〜10μl)をカラムに注入し、これを、AおよびBの勾配で溶離することによって、分析を室温で行った。UPLC条件、検出器設定および質量分析計設定は:カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mmであった。勾配:0.4ml/分で4.0分(別法では8.0分)の間に線形で5%〜95%のアセトニトリル。検出:214nm(TUV(可変UV検出器)から類似の出力) MSイオン化モード:API-ES
走査:100〜2000amu(別法では500〜2000amu)、0.1amuステップ。
Waters2525バイナリー勾配モジュール、Waters2767サンプルマネージャー、Waters2996 Photodiode Array DetectorおよびWaters 2420 ELS Detectorから構成されるHPLCシステムから溶離した後に、Micromass QuatroマイクロAPI質量分析計を使用して、試料の質量を同定した。溶離剤:A:水中0.1%のトリフルオロ酢酸;B:アセトニトリル中0.1%のトリフルオロ酢酸。カラム:Phenomenex Synergi MAXRP、4μm、75×4.6mm。勾配:1.0ml/分で7分かけて5%〜95%B。
方法 04_A3_1
UPLC(方法04_A3_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:90%のH2O、10%のCH3CN、0.25Mの重炭酸アンモニウム
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で16分かけて75%のA、25%のBから45%のA、55%のBへ。
UPLC(方法04_A4_1):デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:90%のH2O、10%のCH3CN、0.25Mの重炭酸アンモニウム
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で16分かけて65%のA、35%のBから25%のA、65%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:90%のH2O、10%のCH3CN、0.25Mの重炭酸アンモニウム
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて90%のA、10%のBから60%のA、40%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150 mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。UPLCシステムを:A:10mMのトリス、15mMの硫酸アンモニウム、80%のH2O、20%、pH7.3;B:80%のCH3CN、20%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから10%のA、90%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:10mMのトリス、15mMの硫酸アンモニウム、80%のH2O、20%、pH7.3
B:80%のCH3CN、20%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから40%のA、60%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH Shield RP18、C18、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、60℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 200mMのNa2SO4+20mMのNa2HPO4+20mMのNaH2PO4を90%のH2O/10%のCH3CNに、pH7.2
B:70%のCH3CN、30%のH2O
を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次のステップで勾配を使用した:0.40ml/分の流速で3分かけて90%のA、10%のBから80%のA、20%のBへ、17分かけて90%のA、10%のBから50%のA、50%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.35ml/分の流速で8分かけて60%のA、40%のBから30%のA、70%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で8分かけて80%のA、20%のBから40%のA、60%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で8分かけて50%のA、50%のBから20%のA、80%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で8分かけて70%のA、30%のBから20%のA、80%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のCH3CN(pH3.5)
B:70%のCH3CN、30%のH2Oを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で8分かけて40%のA、60%のBから20%のA、80%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから40%のA、60%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから40%のA、60%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で12分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A:70%のMeCN、30%の水
B: 0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%のMeCN、pH2.25を含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。
次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で1分で40%のA、7分で40%から70%のAへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.40ml/分の流速で12分かけて70%のA、30%のBから40%のA、60%のBへ。
デュアルバンド検出器を備えたWaters UPLCシステムを使用して、RP-分析を行った。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、30℃を使用して、214nmおよび254nmでのUV検出を集めた。
UPLCシステムを、
A: 99.95%のH2O、0.05%のTFA
B: 99.95%のCH3CN、0.05%のTFAを含有する2つの溶離剤レザバーに接続した。次の線形勾配を使用した:0.30ml/分の流速で16分かけて95%のA、5%のBから5%のA、95%のBへ。
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[D-Ser2,Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:8.3分
UPLC 04_A4_1:6.3分
UPLC 05_B5_1:5.8分
LCMS:m/z 1494.8(M+3H)3+、1046.6(M+4H)4+、837.5(M+5)5+
収率:25.85g(86%)。
RF(SiO2、クロロホルム/メタノール 85:15):0.25。
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH):7.38(bs, 1H);7.08(bs, 1H);6.61(d, J=7.5Hz, 1H);4.43(m, 1H);4.15(s, 2H);4.01(s, 2H);3.78-3.39(m, 16H);2.31(t, J=6.9Hz, 2H);2.27-2.09(m, 5H);2.01-1.84(m, 1H);1.69-1.50(m, 4H);1.46(s, 9H);1.43(s, 9H);1.24(bs, 24H)。
LC-MS純度:100%。
LC-MS Rt(Sunfire 4.6mm×100mm、アセトニトリル/水 60:40から0:100 + 0.1%FA):7.89分。LC-MS m/z:846.6(M+H)+。
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[D-Ser2,Glu16,Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:8.4分
UPLC 08_B2_1:12.6分
UPLC 05_B5_1:6.2分
UPLC 04_A3_1:9.3分
LCMS:m/z 1408.08(M+3H)3+、1056.08(M+4H)4+、845.10(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys17,Lys18,Glu21,Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:8.2分
UPLC 08_B2_1:12.5分
UPLC 05_B5_1:6.1分
UPLC 04_A3_1:11.0分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1380.09(M+3H)3+、1035.10(M+4H)4+、828.31(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys17,Glu21,Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:8.5分
UPLC 08_B2_1:12.9分
UPLC 05_B5_1:5.8分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1389.32(M+3H)3+、1042.24(M+4H)4+、833.99(M+5)5+
Nε16-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys16,Lys17,Glu21,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:8.6分
UPLC 08_B2_1:13.0分
UPLC 05_B5_1:6.0分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1402.99(M+3H)3+、1052.5(M+4H)4+、842.21(M+5)5+
Nε16-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys16,Lys17,Lys18,Glu21,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:8.5分
UPLC 08_B2_1:12.9分
UPLC 05_B5_1:6.0分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1393.67(M+3H)3+、1045.50(M+4H)4+、836.61(M+5)5+
Nε25-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys25,Leu27]グルカゴン
UPLC 10_B5_2: 7.0分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1374.65(M+3H)3+、1031.24(M+4H)4+、825.02(M+5)5+
Nε28-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Leu27,Lys28]グルカゴン
UPLC 10_B5_2: 7.8分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1399.34(M+3H)3+、1049.76(M+4H)4+、840.01(M+5)5+
Nε27-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys27]グルカゴン
UPLC 10_B5_2: 6.8分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1399.4(M+3H)3+
Nε29-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Leu27,Lys29]グルカゴン
UPLC 10_B4_2: 8.5分
UPLC 10_B5_2: 8.1分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1403.32(M+3H)3+、1052.50(M+4H)4+、842.19(M+5)5+
Nα([Leu27]グルカゴニル)Nε[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(20-ヒドロキシ-20-オキソ-イコサノイル)アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]リシン
UPLC 10_B4_2:8.5分
UPLC 10_B5_2:7.9分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1437.02(M+3H)3+、1078.01(M+4H)4+、862.41(M+5)5+
Nε12-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys12,Leu27]グルカゴン
UPLC 10_B4_2: 8.7分
UPLC 10_B5_2: 8.4分
UPLC 05_B5_1: 分
UPLC 04 A3_1: 分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1394.35(M+3H)3+、1045.99(M+4H)4+
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]グルカゴン
UPLC 05_B5_1:5.1分
UPLC 04_A3_1:12.6分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1389.79(M+3H)3+、1042.58(M+4H)4+、834.28(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys24,Leu27,Ser28]グルカゴン
UPLC 04_A4_1:6.7分
UPLC 05_B5_1:4.9分
UPLC 04_A3_1:12.0分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1385.41(M+3H)3+、1039.06(M+4H)4+、831.45(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys24,Leu27,Thr28]グルカゴン
UPLC 04_A4_1:6.4分
UPLC 05_B5_1:4.8分
UPLC 04_A3_1:11.7分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1389.77(M+3H)3+、1042.58(M+4H)4+、834.27(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 04_A4_1:6.3分
UPLC 05_B5_1:4.6分
UPLC 04_A3_1:11.6分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1394.46(M+3H)3+、1045.84(M+4H)4+、836.88(M+5)5+
Nε16-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys16,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:8.5分
UPLC 08_B2_1:12.9分
UPLC 05_B5_1:4.8分
UPLC 04_A3_1:11.9分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1407.65(M+3H)3+、1055.97(M+4H)4+、845.2(M+5)5+
Nε18-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys18,Leu27]グルカゴン
LCT Premier UPLC-MS:Rt 2.11分。m/z:1384.58((M/3)+3);1038.69((M/4)+4)。
UPLC 08_B4_1:8.9分
UPLC 08_B2_1:13.5分
UPLC 05_B5_1:5.1分
UPLC 04_A3_1:11.5分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1384.58(M+3H)3+、1038.69(M+4H)4+
Nε17-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys17,Leu27]グルカゴン
LCT Premier UPLC-MS: Rt 2.06分。m/z: 1384.81((M/3)+3); 1038.62((M/4)+4)。
UPLC 08_B4_1:8.7分
UPLC 08_B2_1:13.2分
UPLC 05_B5_1:4.9分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1384.81(M+3H)3+、1038.62(M+4H)4+
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Arg12,Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:8.74分
UPLC 05_B5_1:5.25分
LCMS法:LCMS_4: 4208.0
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Glu21,Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:8.50分
LCMS法:LCMS_4: 4193
Nα-グルカゴニル-Nε[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(20-ヒドロキシ-20-オキソ-イコサノイル)アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]リシニルアミド
UPLC 08_B4_1:8.7分
LCMS法:LCMS 4:m/z 4450
Να-(Νε24[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソ-オクタデカノイル)アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル][D-Ser2,Lys20]グルカゴニル)リシニルアミド
UPLC 08_B4_1:7.87分
LCMS法:LCMS_4:m/z 4181
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル][Glu16,Lys24]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 05_B5_1:Rt = 6.2分
UPLC 04_A3_1:Rt = 11.7分
LCMS法:LCMS_4:m/z 1413.8(M+3H)3+、1060.7(M+4H)4+、848.8(M+5)5+
Nα([Glu16]グルカゴニル)Nε-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])リシニルアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.3
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.2
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.0
UPLC 04_A3_1:Rt = 10.9
LCMS法:LCMS_4:m/z 1457(M+3H)3+、1093(M+4H)4+、874(M+5)5+
Nα([Glu16,Gln17,Arg20]グルカゴニル)Nε-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])リシニルアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.2
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.1
UPLC 05_B5_1:Rt = 4.8
UPLC 04_A3_1:Rt = 11.1
LCMS法:LCMS_4:m/z 1457(M+3H)3+、1092(M+4H)4+、874(M+5)5+
Nα([Glu16,Gln17,Ala18,Arg20]グルカゴニル)Nε-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])リシニルアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.9
UPLC 08 B4 1:Rt = 8.6
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.7
UPLC 04_A3_1:Rt = 11.3
LCMS法:LCMS_4:m/z 1428(M+3H)3+、1071(M+4H)4+、857(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Glu16,Lys24,Met(0)27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 05_B5_1:Rt = 4.7
UPLC 04_A4_1:Rt = 4.1
LCMS法:LCMS_4:m/z 1419.2(M+3H)3+、1064.7(M+4H)4+、852.0(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Aib2,Glu16,Lys24,Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.4
UPLC 04_A4_1:Rt = 7.2
LCMS法:LCMS_4:m/z 1407.8(M+3H)3+、1056.4(M+4H)4+、845.6(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[D-Ser2,Glu16,Gln17,Ala18,Arg20,Lys24,Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 05_B5_1:Rt = 7.1
UPLC 04_A4_1:Rt = 7.7
LCMS法:LCMS_4:m/z 1380.4(M+3H)3+、1035.6(M+4H)4+、828.7(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Glu21,Lys24,Arg25,Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.8
UPLC 08_B4_1:Rt = 7.6
LCMS法:LCMS_4:m/z 1388.7(M+3H)3+、1041.8(M+4H)4+、833.7(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Glu16,Lys24,Leu27,Ala28]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 05_B9_1:Rt = 8.2
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.5
LCMS法:LCMS_4:m/z 1393.7(M+3H)3+
(Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Gln17,Lys24,Val27,Lys28]グルカゴニル)-Gly-Proアミド
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.0
LCMS法:LCMS_4:m/z 1436.3(M+3H)3+
Nε16-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Lys16,Lys17,Glu21, Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.9
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.5
UPLC 05_B5_1:Rt = 6.4
LCMS法:LCMS_4:m/z 1402.7(M+3H)3+、1052.3(M+4H)4+、842.2(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys17,Glu21,Lys24,Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.8
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.5
UPLC 05_B5_1:Rt = 6.2
LCMS法:LCMS_4:m/z 1389.3(M+3H)3+、1042.0(M+4H)4+、833.1(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Glu16,Lys17,Ala18,Glu21,Lys24,Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 13.7
UPLC 08_B4_1:Rt = 9.0
UPLC 05_B5_1:Rt = 7.1
LCMS法:LCMS_4:m/z 1374.7(M+3H)3+、1031.2(M+4H)4+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys17,Ala18,Glu21,Lys24,Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 13.6
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.9
UPLC 05_B5_1:Rt = 7.1
LCMS法:LCMS_4:m/z 1361.0(M+3H)3+、1020.75(M+4H)4+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Glu16,Lys17,Glu21,Lys24,Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.9
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.5
UPLC 05_B5_1:Rt = 6.1
LCMS法:LCMS_4:m/z 1403.3(M+3H)3+、1052.5(M+4H)4+、842.2(M+5)5+
Nε16-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Aib2,Lys16,Lys17,Glu21,Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.0
UPLC 04_A3_1:Rt = 14.5
UPLC 04_A4_1:Rt = 9.2
LCMS法:LCMS_4:m/z 1402.5(M+3H)3+、1051.85(M+4H)4+、841.7(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys17,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 09_B2_1:Rt = 12.8
UPLC 09_B4_1:Rt = 8.5
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.6
LCMS法:LCMS_4:m/z 1380.2(M+3H)3+、1035.1(M+4H)4+、828.3(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys17,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.8
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.5
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.4
LCMS法:LCMS_4:m/z 1394.1(M+3H)3+、1045.6(M+4H)4+、836.7(M+5)5+
Nα-([Lys17,Glu21,Leu27]グルカゴニル)Nε-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])リシニルアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.4
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.2
UPLC 05_B5_1:Rt = 4.6
LCMS法:LCMS_4:m/z 1431.9(M+3H)3+、1074.2(M+4H)4+、859.4(M+5)5+
Nε28([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys17,Glu21,Leu27,Lys28]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.7
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.5
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.2
LCMS法:LCMS_4:m/z 1393.9(M+3H)3+、1045.7(M+4H)4+、836.6(M+5)5+
Nε25([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys17,Glu21,Lys25,Leu27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 05_B5_1:Rt = 4.5
LCMS法:LCMS_4:m/z 1369.5(M+3H)3+、1027.4(M+4H)4+、822.1(M+5)5+
Nε27([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys17,Glu21,Lys27]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 05_B5_1:Rt = 4.2
LCMS法:LCMS_4:m/z 1394.2(M+3H)3+、1045.6(M+4H)4+、836.7(M+5)5+
Nε29([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys17,Glu21,Leu27,Lys29]グルカゴンペプチドアミド
UPLC 05_B5_1:Rt = 4.930分、純度93%
LCMS法:LCMS_4:m/z 1398.2(M+3H)3+、1048.6(M+4H)4+、839.1(M+5)5+
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Arg12,Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.7
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.2
LCMS法:LCMS_4:m/z 4208
Nε24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]])[Glu21,Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.5
LCMS法:LCMS_4:m/z 4193
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Gln18,Glu21,Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.7
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.6
LCMS法:LCMS_4:m/z 4166
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys24,His25,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:Rt = 7.8
UPLC 05_B5_1:Rt = 4.3
LCMS法:LCMS 4:m/z 4131
Nε24-([(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]-5-オキソペンタノイル])[Lys24,Leu27]グルカゴン
UPLC 09_B2_1:Rt = 12.7
UPLC 09_B4_1:Rt = 8.4
LCMS法:LCMS_4 m/z: 4439.00(M)+; 1480.15((M/3)+3); 1110.11((M/4)+4); 888.29((M/5)+5)
Nε28-([(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]-5-オキソペンタノイル])[Leu27,Lys28]グルカゴン
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.7
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.4
LCMS法:LCMS_4:m/z 4452.50(M)+; 1484.79((M/3)+3); 1113.59((M/4)+4); 891.08((M/5)+5)
Nε29-([(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]-5-オキソペンタニル])[Leu27,Lys29]グルカゴン
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.6
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.4
LCMS法:LCMS_4 m/z: 4465.50(M)+; 1489.12((M/3)+3); 1117.09((M/4)+4); 893.67(M/5)+5)
Nα-([Leu27]グルカゴニル)Nε-([(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]-5-オキソペンタノイル])リシン
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.6
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.4
LCMS法:LCMS_4 m/z: 4465.50(M)+; 1489.12((M/3)+3); 1117.09((M/4)+4); 893.67(M/5)+5)
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys17,Lys18,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]グルカゴン
UPLC 08_B2_1:Rt = 12.9
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.5
LCMS法:LCMS_4 m/z: 4110.50(M)+; 1370.92((M/3)+3); 1028.19((M/4)+4);822.75((M/5)+5)
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Lys24,(p)Tyr25,Leu27]グルカゴン
UPLC 09_B2_1:Rt = 12.7
UPLC 09_B4_1:Rt = 8.4
LCMS法:LCMS_4 m/z:4237.00(M)+;1413.04((M/3)+3);1059.78((M/4)+4);848.26((M/5)+5)。
Nε10-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル])[Lys10,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.3
UPLC 05_B5_1:Rt = 5.0
LCMS法:LCMS_4 m/z: 1382.18((M/3)+3); 1036.89((M/4)+4); 829.72((M/5)+5)
Nε24-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル])[Glu21,Lys24,Arg25,Leu27]グルカゴン
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.55
LCMS法:LCMS_4: 4164.8
Nα-([Lys17,Lys18,Glu21,Leu27]グルカゴニル)Nε-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル])リシン
UPLC 08_B4_1:Rt = 8.45
LCMS法:LCMS_4: 4266.5
タンパク質製剤の物理的安定性を評価するためのThT原線維形成アッセイ
ペプチドの低い物理的安定性は、アミロイド原線維形成をもたらすことがあり、これは、整列した糸様高分子構造として試料中で観察され、場合によってはゲル形成をもたらす。これは慣例では、試料を視覚的に検査することによって測定されている。しかしながら、その種の測定は非常に主観的で、観察者に依存している。したがって、小分子インジケータープローブを適用することが、より有利である。チオフラビンT(ThT)はそのようなプローブであり、原線維に結合すると、明瞭な蛍光サインを有する[Naikiら(1989) Anal. Biochem. 177、244〜249頁;LeVine(1999) Methods. Enzymol. 309、274〜284頁]。
ペプチド溶解性
ペプチドおよびタンパク質の溶解性は、溶液のpHに左右される。多くの場合に、タンパク質またはペプチドは、その実効電荷が0であるその等電点(pl)で、またはその付近で沈殿する。低いpH(即ち、pl未満)では、タンパク質およびペプチドは典型的には、正に荷電しており、plを超えるpHでは、負に荷電している。
pH7.5でのペプチド溶解性
生理学的pH付近でのグルカゴンアナログの溶解性が天然グルカゴンと比べて改善されたかどうかを確立するために、天然グルカゴンおよびグルカゴンアナログのpH7.5での溶解性試験を行った。
ペプチド溶解性/安定性
その溶液の安定性が天然グルカゴンの溶液と比べて改善されたかどうかを確立するために、グルカゴンアナログの安定性試験を行った。
グルカゴンアナログ(実施例3)とGLP-1アナログG1、GLP-1アナログG3およびインスリンアナログG5との同時製剤
グルカゴンアナログ(実施例3)の同時製剤を、肥満および糖尿病を治療する可能性を有する数種のペプチドを用いて調査した。次の製剤を調製した:
1. 250μMのグルカゴンアナログ(実施例3)、10mMのHepes pH7.5
2. 250μMのグルカゴンアナログ(実施例3)、0.6mMのインスリンアナログG5、0.5mMのZn(Ac)2、16mMのm-クレゾール、16mMのフェノール、213mMのグリセロール、pH7.6
3. 250μMのグルカゴンアナログ(実施例3)、1.6mMのGLP-1アナログG1、58mMのフェノール、10mMのリン酸塩 pH8.15
4. 250μMのグルカゴンアナログ(実施例3)、1.2mMのGLP-1アナログG3、58mMのフェノール、10mMのリン酸塩 pH7.4
5. 0.6mMのインスリンアナログG5、0.5mMのZn(Ac)2、16mMのm-クレゾール、16mMのフェノール、213mMのグリセロール、pH7.6
6. 1.6mMのGLP-1アナログG1、58mMのフェノール、10mMのリン酸塩 pH8.15
GLP-1誘導体の調製
次のGLP-1化合物を調製した(全てGLP-1(7-37)のアナログの誘導体である):
化合物G1:
Arg34Lys26(Nε-(γ-グルタミル(Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)-OHと称されることもあるN-イプシロン26-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリル)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)
LCMS法:LCMS_4:m/z = 1046(M/4)
計算値(M) = 4184.8
Nε28-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Leu27,Lys28]-グルカゴン
UPLC法:04_A6_1:Rt = 5.2分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.3分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.0分、m/3 = 1485;m/4 = 1114;m/5 = 891
Nε28-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu27,Lys28]-グルカゴン
UPLC法:04_A6_1:Rt = 5.2分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.3分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1485;m/4 = 1114;m/5 = 891
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
UPLC法:04_A6_1:Rt = 5.8分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.6分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1471;m/4 = 1103;m/5 = 883
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
UPLC法:04_A6_1:Rt = 5.8分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.6分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.0分、m/3 = 1470;m/4 = 1103;m/5 = 883
Nε16-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys16,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A6_1:Rt = 6.41分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 1.9分、m/3 = 1494;m/4 = 1121;m/5 = 897
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
UPLC法:04_A6_1:Rt = 6.1分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.5分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1374;m/4 = 1030;m/5 = 824
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A6_1:Rt = 5.9分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.4分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1490;m/4 = 1118;m/5 = 894
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 12.4分
UPLC法:08_B2_1:Rt = 12.7分
UPLC法:04_B4_1:Rt = 8.4分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 4.7分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1480;m/4 = 1110;m/5 = 888
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 11.7分
UPLC法:08_B2_1:Rt = 12.6分
UPLC法:08_B4_1:Rt = 8.3分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 4.6分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1780;m/4 = 1110;m/5 = 888
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 11.3分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.4分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1383;m/4 = 1038;m/5 = 830
Nε25-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys25,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 10.1分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.0分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/4 = 1096;m/5 = 877
Nε16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys16,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 11.6分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.5分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.3分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 4.3分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.0分、m/3 = 1494;m/4 = 1120;m/5 = 896
Nε16-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Lys16,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 10.9分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.5分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.3分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 4.3分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.0分、m/3 = 1494;m/7 = 1120;m/5 = 896
Nε28-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu27,Lys28]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 10.8分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.7分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.4分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 4.6分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1387;m/4 = 1040;m/5 = 832
Nε12-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu27,Pro29]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 12.9分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.6分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.2分、m/3 = 1479;m/4 = 1110;m/5 = 888
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27,Pro29]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 12.6分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.4分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1479;m/4 = 1109;m/5 = 888
Nε28-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu27,Lys28]-グルカゴニル-Pro
UPLC法:04_A9_1:Rt = 12.4分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.6分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.4分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 4.9分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.0分、m/3 = 1517;m/4 = 1138;m/5 = 910
Nε12-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 12.7分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 13.0分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.6分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 5.1分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1480;m/4 = 1110
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴニル-Pro
UPLC法:04_A9_1:Rt = 12.7分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.6分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.3分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 5.1分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.0分、m/3 = 1512;m/4 = 1134;m/5 = 907
Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys27,Pro29]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 11.1分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.2分
LCMS法:LCMS_2:Rt = 4.4分、m/3 = 1485;m/4 = 1114;m/5 = 891
Nε28-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu27,Lys28,Pro29]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 12.0分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.6分
LCMS法:LCMS_2:Rt = 4.4分、m/3 = 1484;m/4 = 1113;m/5 = 891
Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Arg12,Lys27,Pro29]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 9.9分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.2分
LCMS法:LCMS_2:Rt = 4.2分、m/3 = 1494;m/4 = 1121;m/5 = 897
Nε24-[(2S)-4-カルボキシ-2-[[(2S)-4-カルボキシ-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:AP_B4_1.:Rt = 9.0分
LCMS法:LCMS_AP:Rt = 9.0分、m/3 = 1480;m/4 = 1110
Nε24-[(2S)-4-カルボキシ-2-[[(2S)-4-カルボキシ-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-カルボキシ-2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:AP_B4_1:Rt = 9.1分 9204-0000-0163
LCMS法:LCMS_AP:Rt = 9.0分、m/3 = 1480;m/4 = 1111
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:AP_B4_1:Rt = 9.1分
LCMS法:LCMS_AP:Rt = 8.9分、m/3 = 1437;m/4 = 1078
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 13.6分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.6分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.2分、m/3 = 1428;m/4 = 1071;m/5 = 857
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu9,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 13.2分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.6分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 3.7分、m/3 = 1428;m/4 = 1071;m/5 = 857
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[ Glu20,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 12.5分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.6分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 3.7分、m/3 = 1428;m/4 = 1071;m/5 = 857
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 12.3分
UPLC法:08_B2_1:Rt = 11.8分
UPLC法:08_B4_1:Rt = 7.8分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 4.2分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.0分、m/3 = 1471;m/4 = 1103;m/5 = 882
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 10.6分
UPLC法:08_B2_1:Rt = 10.6分
UPLC法:08_B4_1:Rt = 7.0分
UPLC法:05_B7_1:Rt = 6.7分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 1.8分、m/3 = 1452;m/4 = 1089;m/5 = 871
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 11.2分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 11.2分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 7.4分
UPLC法:05_B7_1:Rt = 7.2分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 1.9分、m/3 = 1461;m/4 = 1096;m/5 = 877
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 13.6分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.7分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.4分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 5.1分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.1分、m/3 = 1576;m/4 = 1182;m/5 = 946
Nε20-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys20,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 13.9分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 13.1分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.7分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 5.3分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.2分、m/3 = 1480;m/4 = 1110;m/5 = 888
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[D-Phe4,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 13.4分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.7分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.3分、m/3 = 1501;m/4 = 1126;m/5 = 901
Nε16-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys16,Glu21,Arg25,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 11.7分
UPLC法:08_B2_1:Rt = 11.5分
UPLC法:08_B4_1:Rt = 7.6分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 4.2分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.2分、m/3 = 1488;m/4 = 1116;m/5 = 893
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Glu20,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 11.5分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.6分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 3.8分、m/3 = 1472;m/4 = 1104;m/5 = 884
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 11.1分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 11.1分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 1.9分、m/3 = 1478;m/4 = 1109;m/5 = 888
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Gln27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 11.4分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.1分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.0分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 3.5分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 1.9分、m/3 = 1485;m/4 = 1114;m/5 = 891
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Glu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 8.9分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.3分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.2分
UPLC法:05_B5_1:Rt = 3.8分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.0分、m/3 = 1486;m/4 = 1114;m/5 = 892
Nα([His24,Leu27]-グルカゴニル)-Nε[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys
UPLC:法:04_A6_1 :Rt = 6.0分
UPLC:法:09_B4_1_214nm:Rt = 8.1分
LC-MS法:LCMS_4:Rt = 2.7分、m/3 = 1526、m/4 = 1145、m/5 = 763
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Glu27]-グルカゴン
UPLC法:04_A9_1:Rt = 7.7分
UPLC法:09_B2_1:Rt = 12.3分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 8.2分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 3.9分、m/3 = 1443;m/4 = 1082;m/5
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:09_B2_1:Rt = 13.7分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 9.1分
UPLC法:09_A9_1:Rt = 13.1分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 2.3分、m/3 = 1489.7;m/4 = 1117.3;m/5 = 894.2
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Lys24,Leu27]-グルカゴン
UPLC法:09_B2_1:Rt = 9.7分
UPLC法:09_B4_1:Rt = 6.5分
UPLC法:04_A9_1:Rt = 8.4分
LCMS法:LCMS_4:Rt = 1.8分、m/3 = 1434;m/4 = 1075.5;m/5 = 860.8
アッセイ(I)
グルカゴン活性
グルカゴン受容体を膜結合cAMPバイオセンサー(ACTOne(商標))を有するHEK-293細胞にクローニングした。細胞(1ウェル当たり14000)を(37℃、5%CO2)で一晩、384ウェルプレート中でインキュベートした。翌日、細胞に細胞質にのみ分布するカルシウム応答性色素を負荷した。有機アニオントランスポーターの阻害薬であるプロベネシドを加えて、色素が細胞を離脱するのを防いだ。PDE阻害薬を加えて、初期化cAMPが分解するのを防いだ。プレートをFLIPRTETRAに入れ、グルカゴンアナログを加えた。終点データを6分後に集めた。細胞内cAMPの上昇は、細胞質中のカルシウム濃度の上昇と比例した。カルシウムが無水で結合すると、蛍光シグナルが生じた。EC50値をPrism5で算出した。
GLP-1活性
GLP-1受容体を膜結合cAMPバイオセンサー(ACTOne(商標))を有するHEK-293細胞にクローニングした。細胞(1ウェル当たり14000)を(37℃、5%CO2)で一晩、384ウェルプレート中でインキュベートした。翌日、細胞に細胞質にのみ分布するカルシウム応答性色素を負荷した。有機アニオントランスポーターの阻害薬であるプロベネシドを加えて、色素が細胞を離脱するのを防いだ。PDE阻害薬を加えて、初期化cAMPが分解するのを防いだ。プレートをFLIPRTETRAに入れ、グルカゴンアナログを加えた。終点データを6分後に集めた。細胞内cAMPの上昇は、細胞質中のカルシウム濃度の上昇と比例した。カルシウムが無水で結合すると、蛍光シグナルが生じた。EC50値をPrism5で算出した。
LOCIアッセイ
ルミネセンス酸素チャネリングイムノアッセイ(LOCI)を使用して、試料をペプチドについて分析した。ドナービーズをストレプトアビジンでコーティングし、アクセプタービーズを、グルカゴンに特異的なモノクローナル抗体(1F120)と共役させた。他のグルカゴン結合性モノクローナル抗体(2F7)はビオチン化した。3種の反応物を分析物と合わせ、ツーサイト(two-sited)免疫複合体を形成した。複合体を照明して、一重項酸素原子をドナービーズから放出させた。それらは、アクセプタービーズへとチャンネルされ、化学発光をトリガーし、それを、EnVisionプレートリーダーで測定した。放射される光の量は、ペプチドの濃度に比例した。1μL試料/較正物質/対照を384-ウェルLOCIプレートのウェルに、続いて抗体コーティングされたアクセプタービーズ(0.5μg/ウェル)およびビオチン化抗体の15μl混合物を施与した。プレートを21〜22℃で1時間インキュベートした。次いで、ストレプトアビジンコーティングされたドナービーズ30μL(2μg/ウェル)を各ウェルに加え、21〜22℃で30分間インキュベートした。680nmレーザによって励起した後に、520〜645nmの帯域幅を有するフィルターを備えたEnvisionプレートリーダーで21〜22℃で、プレートを読み取った。1ウェル当たりの全測定時間は、70msの励起時間を含めて210msであった。
食物誘発性肥満ラットでの体重減少
Taconic Europeからの64匹の高脂肪(Research Diet D12492)給餌Sprague Dawleyラットおよび8匹の低脂肪(Research Diet D12450B)給餌Sprague Dawleyラットをこの研究のために使用した。ラットは、投薬前はそれぞれ約970gおよび730gの体重であった。ラットに任意に水を飲ませ、食物摂取を毎日監視することができるように個別に飼育した。午前10時から午後10時まで消灯した。
自由給餌ラットモデルを使用し、グルカゴン誘導体を用いる食欲に対する効力試験のための実験プロトコル
Taconic Europe、DenmarkからのSprague Dawley(SD)ラットを実験のために使用する。ラットは実験の開始時に200〜250gの体重を有した。ラットを実験開始の14日前に到着させて、実験設定に順応させた。この期間の間に、動物に2回触れた。到着の後に、ラットを個別に1週間、逆転明暗相(日中の消灯および夜間の点灯を意味する)で2週間飼育した。ラットは通常、暗い間に活発で、その一日分の食物摂取量のうちの大部分を食べるので、消灯直前の朝に、ラットに投与する。この設定が、最小のデータ変化および最高の試験感度をもたらす。実験をラットのホームケージで行い、順応期間および実験期間を通してラットに、食物および水に自由にアクセスさせた。誘導体の各用量を5匹のラットからなる群で試験した。6〜7匹のラットからなるビヒクル群が、各試験セットに包含された。ラットに、体重に応じて皮下(sc.)投与される溶液0.01〜3mg/kgを1回投与した。投与の後に、ラットを、食物および水にアクセスできるそのホームケージに戻した。食物消費量を個別に連続してオンライン登録によって、または手動で1時間毎に7時間、次いで24時間後に、再び48時間後に記録した。実験期間の終了時に、動物を安楽死させた。個別のデータはMicrosoft excelのシートに記録した。異常値に関するGrubbs統計評価試験を適用した後に、異常値を除いた。データを、時間を関数とする累積食物摂取量として報告した。スチューデントt検定または一元ANOVAを使用して、ビヒクル群および試験群を比較した。
DPP-IV安定性アッセイ
ペプチド10μMをDPP-IV(2μg/ml)と共に二重に、37℃、0.005%のTween20が加えられているHEPES緩衝液中でインキュベートした。実験では、ヒトGLP-1を陽性対照として使用した。試料のアリコットを3、15、30、60、120および240分目に採取し、3倍体積のエタノールを加えて、反応を停止させた。試料をLC-MSによって、親ペプチドについて分析した。データを第1動態に従ってプロットし、安定性を半減期として報告した。
PKプロファイル
15匹の雄のラット(Sprague Dawley、400g、Taconic Europe)を5匹のラットからなる3つの群に分けた。ラットにt=0で、それぞれ静脈内で15nmol/kg IV、皮下で30nmol/kgまたは100nmol/kgを投与した。静脈内投与は尾静脈を介して行い、その間、ラットを短時間、イソフルラン麻酔下に置いた。舌下静脈を介して時間t=-15分、5分(静脈内投与ラットのみ)、15分、30分、1時間、1と1/2時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間および72時間に、血液試料を得た。LCMSによって分析するまで、血漿試料を凍結貯蔵した。
pH依存性溶解性
ペプチドおよびタンパク質の溶解性は、溶液のpHに依存する。多くの場合に、タンパク質またはペプチドは、その実効電荷が0であるその等電点(pl)で、またはその付近で沈殿する。低いpH(即ち、pl未満)では、タンパク質およびペプチドは典型的には、正に荷電しており、plを超えるpHでは、負に荷電している。
Claims (18)
- グルカゴンペプチドであって、配列番号 1と、前記グルカゴンペプチドにおける7個までのアミノ酸置換と、3個以上の負に荷電している部分を含む置換基(前記負に荷電している部分のうちの1個は、親油性部分から遠位にあり、前記置換基は、前記グルカゴンペプチドの次のアミノ酸位置:X10、X12、X16、X17、X18、X20、X21、X24、X25、X27、X28、X29および/またはX30のうちの1個または複数中のLysのイプシロン位か、Ornのデルタ位か、またはCysの硫黄に結合している)とを含むグルカゴンペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、アミド、酸もしくはプロドラッグ。
- 前記置換が前記グルカゴンペプチドの次の位置: X2、X4、X9、X10、X12、X16、X17、X18、X20、X21、X24、X25、X27、X28、X29および/またはX30に存在する、請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
- 前記置換基が式IIを有する、請求項1から2のいずれかに記載のグルカゴンペプチド:
Z1-Z2-Z3-Z4 [II]
[式中、
Z1は、式IIa、IIbまたはIIcの1つによる構造を表し;
式IIc中のmは5〜11であり、
式IIc中のCOOH基は、フェニル環上の2、3または4位に結合していてよく、式IIa、IIbおよびIIc中の記号*は、Z2中の窒素への結合点を表し;Z2が存在しない場合、Z1は記号*でZ3上の窒素に結合し;Z2およびZ3が存在しない場合、Z1は記号*でZ4上の窒素に結合している)
Z2は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;
Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ3の窒素に結合しており;Z3が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素原子を介して、*で示されているZ4の窒素に結合しており、かつZ3およびZ4が存在しない場合、Z2は、*で示されている炭素を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に結合している)
Z3は存在しないか、または式IIm、IIn、IIoまたはIIpの1つによる構造を表し;
Z4は存在しないか、または式IId、IIe、IIf、IIg、IIh、IIi、IIjもしくはIIkの1つによる構造を表し;ここで、各アミノ酸部分は独立に、LまたはDのいずれかであり、Z4は、記号*で示されている炭素を介して、グルカゴンペプチドのリシンのイプシロン窒素またはオルニチンのデルタ窒素に結合している]。 - 前記置換基が式IIIa、IIIb、IIIc、IIId、IIIe、IIIf、IIIg、IIIh、IIIi、IIIj、IIIk、IIIl、IIIm、IIInまたはIIIoの1つによる構造を表す、請求項1から3のいずれかに記載のグルカゴンペプチド:
- 前記置換基が前記グルカゴンペプチドの次のアミノ酸位置:X12、X16、X20、X24、X25、X28、X29および/またはX30のうちの1つまたは複数に存在する、請求項1から4のいずれかに記載のグルカゴンペプチド。
- 前記置換基が前記グルカゴンペプチドの次のアミノ酸位置:X16、X24および/またはX28のうちの1つまたは複数に存在する、請求項1から5のいずれかに記載のグルカゴンペプチド。
- 前記置換基が前記グルカゴンペプチドのアミノ酸位置X24に存在する、請求項1から6のいずれかに記載のグルカゴンペプチド。
- 下記からなる群から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
Nε24-([(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-ヒドロキシ-4-[(18-ヒドロキシ-18-オキソオクタデカノイル)アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソペンタノイル]アミノ]-5-オキソペンタノイル])[Lys24,Leu27]グルカゴン
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドを含む医薬組成物。
- 1種または複数の追加の治療活性化合物または物質をさらに含む、請求項9に記載の医薬組成物。
- GLP-1化合物をさらに含む、請求項9から10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- インスリン化合物をさらに含む、請求項9から11のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 非経口投与に適している、請求項9から12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 療法で使用するための、請求項1から8のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチド。
- 医薬品を調製するための、請求項1から8のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドの使用。
- 高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病および肥満を治療または予防するための医薬品を調製するための、請求項1から8のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドの使用。
- 2型糖尿病における疾患進行を遅延または予防するための、肥満を治療するための、または過体重を予防するための、食物摂取量を低下させるための、エネルギー消費を増大させるための、体重を減少させるための、耐糖能障害(IGT)から2型糖尿病への進行を遅延させるための;2型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させるための;食欲を制御するための;満腹を誘発するための;体重減少の成功後に体重再増加を予防するための;過体重または肥満に関連する疾患または状態を治療するための;大食症を治療するための;暴食を治療するための;アテローム硬化症、高血圧、2型糖尿病、IGT、脂質異常症、冠状動脈性心疾患、肝脂肪症を治療するための、ベータ遮断薬中毒を治療するための、X線、CT-およびNMR走査などの技術を使用する胃腸管の検査に関連して有用な胃腸管の運動性の阻害のために使用するための医薬品を調製するための、請求項1から8のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドの使用。
- 低血糖、インスリン誘発性低血糖、反応性低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹時低血糖、薬物誘発性低血糖、胃バイパス誘発性低血糖、妊娠時低血糖、アルコール誘発性低血糖、インスリノーマおよびフォン・ギールケ病を治療または予防するための医薬品を調製するための、請求項1から8のいずれか一項に記載のグルカゴンペプチドの使用。
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