TW202024134A

TW202024134A - 雙特異性蛋白

Info

Publication number: TW202024134A
Application number: TW108146977A
Authority: TW
Inventors: 曹卓曉; 羅肖; 何寧; 胡齊悅; 張連山; 陶維康
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-07-01
Also published as: CN115947849A; CA3123979A1; CN112996811B; KR20210109552A; EP3901173A1; WO2020125744A1; CN112996811A; JP2022516439A; BR112021011595A2; AU2019410643A1; EP3901173A4; MX2021007444A; US20220153853A1

Abstract

本公開提供一種雙特異性蛋白。具體而言，本公開涉及人GCGR抗體、GLP-1肽及其突變體，以及GCGR抗體與GLP-1肽融合形成的雙特異性蛋白及其製備方法和應用。其中，所述的人GCGR抗體、GLP-1肽及GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白可用於減肥、治療糖尿病等病症。

Description

雙特異性蛋白

本申請要求2018年12月21日提交的專利申請201811573634.0和2018年12月27日提交的專利申請201811606887.3的優先權；兩者藉由引用併入本文。

本公開涉及人GCGR抗體、GLP-1肽及其突變體，以及GCGR抗體與GLP-1肽融合形成的雙特異性蛋白及其製備方法和應用。

這裡的陳述僅提供與本公開有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種表現為胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙，以高血糖為特徵的代謝性疾病，其發病主要是胰島素與胰高血糖素共同作用的結果。

GLP-1是影響胰島素分泌最主要的激素之一，與胰高血糖素(Glucagon)一起均來源於前胰島素原。前胰島素原由約158個胺基酸組成，在不同的部位被切割成不同的肽鏈。人體內具有生物活性的GLP-1主要包括GLP-1(7-36)醯胺和GLP-1(7-37)兩種形式。GLP-1藉由小腸L細胞分泌，主要以葡萄糖濃度依賴性方式促進胰島素分泌，保護胰島β細胞，抑制胰高血糖素分泌來降低機體血糖水平。同時GLP-1還有抑制胃排空，降低食欲的作用。臨床可用於II型糖尿病和肥胖症的治療。機體內天然活性GLP-1的半衰期很短(不足2分鐘)，很容易被機體內DPPIV酶降解，不具有臨床使用價值。

延長半衰期一直是GLP-1類藥物研發的主要方向，目前已有多款GLP-1激動劑上市，如度拉糖肽(Dulaglutide)和索馬魯肽(Semaglutide)等。雖然GLP-1在療效上已經獲得人們的充分肯定，但也存在諸多副作用，主要表現為胃腸道症狀，低血糖，胰腺炎及腎損傷等。

胰高血糖素與胰島素作用相反，主要起升高機體血糖的作用。胰高血糖素是由胰島α細胞分泌的具有29個胺基酸的肽，與肝細胞膜上受體GCGR結合後主要藉由激活下游cAMP/PKA途徑，加速糖原分解、脂肪分解和糖異生，使血糖升高。

研究發現，GCGR基因剔除鼠呈現出GLP-1升高，肝糖輸出減少，脂代謝增加，食欲減退等一系列表型。GCGR是糖尿病治療最熱門的靶點之一，但目前針對GCGR的拮抗類藥物研發進展緩慢。REMD Biotherapeutics公司的REMD-477，目前是最前沿的GCGR單株抗體藥物，處於臨床二期。

現有技術已在專利CN101589062A、CN101983208A、CN102482350A、CN103314011A、CN105189560A、CN107614695A、US20180273629A1、WO2013059531A1等專利中公開GCGR抗體，但仍有待於提供新的高效的GCGR抗體及糖尿病治療方法。

本公開提供一種抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段。該抗體或其抗原結合片段具有與人GCGR(或其所包含的抗原表位)結合的能力。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，包含選自如下a)或b)的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：

a)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：48、49和50所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：51、52和53所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；或

b)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：38、39和54所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：55、56和57所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，包含選自如下i)至vi)的重鏈可變區和輕鏈可變區的任一組合：

i)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

ii)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

iii)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：26、27和28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：29、30和31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

iv)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：32、33和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：35、36和37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

v)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：38、39和40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：41、42和43所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；或

vi)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：38、39和44所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：45、46和47所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，該人源化抗體包含源自人抗體的框架區或其框架區變體，該框架區變體為在人抗體的輕鏈框架區上具有至多10個回復突變，和/或，該框架區變體在人抗體的重鏈框架區基礎上具有至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個、至多1個胺基酸的回復突變。

在一些實施方式中，該框架區變體包含選自：

aa)輕鏈可變區中包含42G、44V、71Y和87F中的一個或多個胺基酸回復突變，和/或重鏈可變區中包含38K、48I、67A、69F、71A、73P、78A和93S中的一個或多個胺基酸回復突變；或者

ab)輕鏈可變區中包含38L、44V、59S、70E和71Y中的一個或多個胺基酸回復突變，和/或重鏈可變區中包含38K、48I、66K、67A、69L、73R、78M和 94S中的一個或多個胺基酸回復突變。進一步地，該回復突變位點的位置依據Kabat編號規則確定。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含序列如SEQ ID NO：2、61、62、63和64任一所示或與SEQ ID NO：2、61、62、63和64任一所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的重鏈可變區；和/或

序列如SEQ ID NO：3、58、59和60任一所示或與SEQ ID NO：3、58、59和60任一所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含序列如SEQ ID NO：63該的重鏈可變區和序列如SEQ ID NO：58所示的輕鏈可變區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含序列為SEQ ID NO：4所示或與SEQ ID NO：4所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的重鏈可變區和/或序列為SEQ ID NO：5所示或與SEQ ID NO：5所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的輕鏈可變區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含序列為SEQ ID NO：6所示或與SEQ ID NO：6所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的重鏈可變區和/或序列為SEQ ID NO：7所示或與SEQ ID NO：7所示具有至少90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的輕鏈可變區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含序列為SEQ ID NO：8、68、69、70和71任一所示或與SEQ ID NO：8、68、69、70和71任一所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的重鏈可變區和/或序列為SEQ ID NO：9、65、66和67任一所示或與SEQ ID NO：9、65、66和67任一所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含序列如SEQ ID NO：71該的重鏈可變區和序列如SEQ ID NO：67所示的輕鏈可變區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含序列為SEQ ID NO：10所示或與SEQ ID NO：10所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的重鏈可變區和/或序列為SEQ ID NO：11所示或與SEQ ID NO：11所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的輕鏈可變區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含序列為SEQ ID NO：12所示或與SEQ ID NO：12所示具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的重鏈可變區和/或序列為SEQ ID NO：13所示或與SEQ ID NO：13所示具有至少90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的輕鏈可變區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為全長抗體，進一步包括抗體恆定區，具體地，該抗體恆定區的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區及其常規變體，該抗體恆定區的輕鏈恆定區選自人抗體κ和λ鏈恆定區及其常規變體，更佳包含SEQ ID NO：72所示的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO：73所示的人輕鏈恆定區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，包括重鏈和輕鏈，其中：

該重鏈為SEQ ID NO：74、76或78所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：75所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。

該重鏈為SEQ ID NO：74、76或78所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：77所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。

該重鏈為SEQ ID NO：74、76或78所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：79所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。

該重鏈為SEQ ID NO：80所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：81所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。

在一些實施方式中，該的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，包括重鏈和輕鏈，其中：

該重鏈為SEQ ID NO：82所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：83所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。

該重鏈為SEQ ID NO：84所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：85所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。

該重鏈為SEQ ID NO：86所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：87所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。

該重鏈為SEQ ID NO：88所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：89所示或與其具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。

在一些實施方案中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含如序列如SEQ ID NO：78所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：79所示的輕鏈。

在一些實施方案中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含如序列如SEQ ID NO：84所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：85所示的輕鏈。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，包含選自如下ac)至ah)的重鏈可變區和輕鏈可變區的任一組合：

ac)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：2所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：3所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

ad)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：4所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：5所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

ae)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：6所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：7所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

af)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：8所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：9所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

ag)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：10所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：11所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；或

ah)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：12所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：13所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體、二聚化的V區(雙抗體)和二硫鍵穩定化的V區(dsFv)。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其特徵在於與如前所述的單株抗體或其抗原結合片段競爭結合人GCGR(或其表位)。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，具有以下特徵中的至少一種：

i.以小於500nM、小於450nM、小於400nM、小於350nM或小於300nM(較佳小於300nM)IC50值的水平阻斷人GCGR與人胰高血糖素結合的拮抗活性；

ii.阻斷食蟹猴或恆河猴GCGR與食蟹猴或恆河猴胰高血糖素結合的拮抗活性；

iii.抑制人血糖濃度的升高；

iv.阻斷小鼠GCGR與小鼠胰高血糖素結合的拮抗活性。

在一些實施方式中，該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段與如前所述的單株抗體或其抗原結合片段結合相同的抗原表位。

另一方面，本公開提供一種雙特異性蛋白。在一些實施方式中，所提供的一種雙特異性蛋白，該雙特異性蛋白包含GLP-1肽和GCGR抗體，該GLP-1肽與該GCGR抗體的多肽鏈之間由肽鍵或接頭共價連接。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，其中該GLP-1肽的羧基端與GCGR抗體的重鏈可變區的胺基端由肽鍵或接頭連接，或者該GLP-1肽的羧基端與GCGR抗體的輕鏈可變區的胺基端由肽鍵或接頭連接。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，其中該GLP-1肽的羧基端與GCGR抗體的重鏈可變區的胺基端由肽鍵或接頭連接。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，其中該GLP-1肽的羧基端與GCGR抗體的輕鏈可變區的胺基端由肽鍵或接頭連接。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，其中該GLP-1肽的羧基端與GCGR全長抗體的重鏈胺基端由肽鍵或接頭連接。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，其中該GLP-1肽的羧基端與全長GCGR抗體的輕鏈胺基端由肽鍵或接頭連接。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該GCGR抗體選自如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該GLP-1肽是如SEQ ID NO：91所示的GLP-1A，或該GLP-1肽在GLP-1A基礎上具有Q17E、I23V、K28R和G30R中一個或多個胺基酸替代的GLP-1A肽變體。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該GLP-1肽是如SEQ ID NO：91所示的GLP-1A，或該GLP-1肽在GLP-1A基礎上具有Q17E的GLP-1A肽變體。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該GLP-1肽是如SEQ ID NO：91所示的GLP-1A，或該GLP-1肽在GLP-1A基礎上具有Q17E替代，且同時還具有I23V、K28R和G30R中一個或多個胺基酸替代GLP-1A肽變體。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該GLP-1肽是如SEQ ID NO：91所示的GLP-1A，或該GLP-1肽在GLP-1A基礎上具有Q17E或具有Q17E和I23V的GLP-1A肽變體。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該GLP-1A肽變體包含如SEQ ID NO：92、93、94、95、96、97、98或99所示的序列或由其組成。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該GCGR抗體是選自如前任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段和如前任一項所述的GLP-1A肽或GLP-1A肽變體。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該雙特異性蛋白具有包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中：該第一多肽鏈選自如SEQ ID NO：100、101、102、103、104、105、106、107和108任一所示的多肽，和該第二多肽鏈選自如SEQ ID NO：79所示的多肽。

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該雙特異性蛋白具有包含GCGR抗體重鏈的第一多肽鏈和包含GCGR抗體輕鏈的第二多肽鏈，其中：該第一多肽鏈選自如SEQ ID NO：109所示的多肽，和該第二多肽鏈選自如SEQ ID NO：81所示的多肽；

在一些實施方式中，該特異性蛋白，該雙特異性蛋白具有包含GCGR抗體重鏈的第一多肽鏈和包含GCGR抗體輕鏈的第二多肽鏈，其中：該第一多肽鏈選自如SEQ ID NO：110所示的多肽，和該第二多肽鏈選自如SEQ ID NO：83所示的多肽；

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該雙特異性蛋白具有包含GCGR抗體重鏈的第一多肽鏈和包含GCGR抗體輕鏈的第二多肽鏈，其中：該第一多肽鏈選自如SEQ ID NO：111所示的多肽，和該第二多肽鏈選自如SEQ ID NO：85所示的多肽；

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該雙特異性蛋白具有包含GCGR抗體重鏈的第一多肽鏈和包含GCGR抗體輕鏈的第二多肽鏈，其中：該第一多肽鏈選自如SEQ ID NO：112所示的多肽，和該第二多肽鏈選自如SEQ ID NO：87所示的多肽；或者

在一些實施方式中，該雙特異性蛋白，該雙特異性蛋白具有包含GCGR抗體重鏈的第一多肽鏈和包含GCGR抗體輕鏈的第二多肽鏈，其中：該第一多肽鏈選自如SEQ ID NO：113所示的多肽，和該第二多肽鏈選自如SEQ ID NO：89所示的多肽。

另一方面，本公開還提供一種GLP-1肽變體。在一些實施方式中，該GLP-1肽變體，其是在SEQ ID NO：91所示的GLP-1A基礎上具有Q17E、I23V、K28R和G30R中一個或多個胺基酸突變的突變體。

在一些實施方式中，該GLP-1肽是如SEQ ID NO：91所示的GLP-1A，或該GLP-1肽在GLP-1A基礎上具有Q17E或具有Q17E和I23V的GLP-1A肽變體。

在一些實施方式中，該GLP-1肽變體，其中具有如SEQ ID NO：92、93、94、95、96、97、98或99所示的序列。

本公開還提供一種醫藥組成物，其含有治療有效量的如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如前所述的雙特異性蛋白，或如前所述的GLP-1肽變體，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。

本公開還提供一種分離的核酸分子，其編碼如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如前所述的雙特異性蛋白，或如前所述的GLP-1肽變體。

本公開提供一種重組載體，其包含如前所述的分離的核酸分子。

本公開提供一種用如前所述的重組載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳哺乳動物細胞或昆蟲細胞。

本公開提供用於生產如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如前所述的雙特異性蛋白，或根據如前所述的GLP-1肽變體的方法，該方法包括將如前所述宿主細胞在培養基中進行培養以形成並積累如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如前該的雙特異性蛋白，或如前所述的GLP-1肽變體，以及從培養物回收該單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性蛋白或GLP-1肽變體。

本公開提供用於體外檢測或測定人GCGR的方法，該方法包括使用如前所述的單株抗體或其抗原結合片段。

一種檢測人GCGR的試劑盒，其包含如前該的單株抗體或其抗原結合片段。

根據一些實施方式，還提供了前述抗GCGR單株抗體或其抗原結合片段在製備醫療器械(例如試劑盒、陣列、試紙、多孔板、磁珠、包被微粒)中的用途，該醫療器械包含前所述的單株抗體或其抗原結合片段。作為一個示例，試劑盒中包含包被有前述抗GCGR單株抗體或其抗原結合片段的多孔板。

本公開提供如前所述的單株抗體或其抗原結合片段在製備用於檢測或測定人GCGR的試劑中的用途。

本公開提供一種降低受試者血糖濃度的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如前述的雙特異性蛋白，或如前所述的GLP-1肽變體，或如前所述的醫藥組成物。

較佳地，該治療有效量為單位劑量的組合物中含有0.1-3000mg的如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如前所述的雙特異性蛋白，或根據如前所述的GLP-1肽變體。

本公開提供一種治療代謝障礙的方法，該方法包括向受試者施用如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如前所述的雙特異性蛋白，或如前所述的GLP-1肽變體，或如前所述的醫藥組成物；較佳地，該代謝障礙為代謝綜合症、肥胖症、葡萄糖耐量受損、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高滲綜合症、圍術期高血糖症、高胰島素血症、胰島素抵抗綜合症、空腹血糖受損、血脂異常、動脈粥樣硬化或糖尿病前期狀態。

本公開還提供根據如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如前所述的雙特異性蛋白，或如前所述的GLP-1肽變體，或如前所述的醫藥組成物在製備治療代謝障礙或降低受試者血糖濃度的藥物中的用途；

較佳地，該代謝障礙為代謝綜合症、肥胖症、葡萄糖耐量受損、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高滲綜合症、圍術期高血糖症、高胰島素血症、胰島素抵抗綜合症、空腹血糖受損、血脂異常、動脈粥樣硬化或糖尿病前期狀態。

本公開還提供用如前所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如前所述的雙特異性蛋白，或如前所述的GLP-1肽變體，或如前所述的醫藥組成物用作藥物，較佳的用作治療代謝障礙或降低受試者血糖濃度的藥物。

更佳地，該代謝障礙為代謝綜合症、肥胖症、葡萄糖耐量受損、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高滲綜合症、圍術期高血糖症、高胰島素血症、胰島素抵抗綜合症、空腹血糖受損、血脂異常、動脈粥樣硬化或糖尿病前期狀態。

第1圖為本公開的雙特異性蛋白(GLP-1/GCGR抗)結構示意圖。

第2圖為雙特異性蛋白及GCGR抗體對GCGR的拮抗活性。

第3圖為雙特異性蛋白及度拉糖肽對GLP-1R的激活活性。

第4圖為長期用藥對ob/ob小鼠隨機血糖的影響，Vehicle(空載體)為注射磷酸鹽緩衝液(PBS)的模型對照組，hu1803-9D-3mpk與hu1803-9-2.84mpk和度拉糖肽-1.16mpk是相同物質的量濃度。

第5圖為長期用藥對ob/ob小鼠饑餓血糖的影響。所有實驗組均能顯著降低小鼠空腹血糖濃度，其中hu1803-9D-3mpk與hu1803-9-2.84mpk的降血糖濃度能力最強，且hu1803-9D-3mpk的降血糖活性優於hu1803-9-2.84mpk。

術語

本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

術語“雙特異性蛋白”指能夠與兩個目標蛋白或目標抗原結合的蛋白分子。在本公開雙特異性蛋白特指能夠結合GCGR和GLP-1R(GLP-1受體)，由GLP-1肽和GCGR抗體(或其抗原結合片段)的多肽鏈融合後形成的蛋白。

“GLP-1肽”指能結合並激活GLP-1受體的肽。現有技術的肽描述於專利申請WO2008/071972、WO2008/101017、WO2009/155258、WO2010/096052、WO2010/096142、WO2011/075393、WO2008/152403、WO2010/070251、WO2010/070252、WO2010/070253、WO2010/070255、WO2011/160630、WO2011/006497、WO2011/117415、WO2011/117416、WO2006/134340、WO1997046584、WO2007124461、WO2017100107、WO2007039140、CN1935261A、CN1935846A、WO2006036834、WO2005058958、WO2002046227、WO1999043705、WO1999043708、WO1999043341、CN102949730、CN104293834、CN104327187、 WO2015067716、WO2015049651、WO2014096145、WO2014096148、WO2014096150、WO2014096149中，其內容藉由引用併入本文。包括GLP-1、GLP-1類似物和GLP-1受體肽激動劑，部分具體的GLP-1肽例如：利西拉來(Lixisenatide)/AVE0010/ZP10/Lyxumia、艾塞那肽(Exenatide)/毒蜥外泌肽-4/Byetta/Bydureon/ITCA 650/AC-2993、利拉魯肽/Victoza、索馬魯肽(Semaglutide)、他司魯肽(Taspoglutide)、Syncria/阿必魯肽(Albiglutide)、度拉糖肽(Dulaglutide)、rExendin-4、CJC-1134-PC、PB-1023、TTP-054、Langlenatide/HM-11260C、CM-3、GLP-1 Eligen、ORMD-0901、NN-9924、NN-9926、NN-9927、Nodexen、Viador-GLP-1、CVX-096、ZYOG-1、ZYD-1、GSK-2374697、DA-3091、MAR-701、MAR709、ZP-2929、ZP-3022、TT-401、BHM-034、MOD-6030、CAM-2036、DA-15864、ARI-2651、ARI-2255、艾塞那肽-XTEN和胰高血糖素-Xten，除上述GLP-1肽外，還包括本公開基於SEQ ID NO：91所示GLP-1A及其突變體(如SEQ ID NO：92-99所示)。

GPCR(G Protein-Coupled Receptor)，即G蛋白偶聯受體，是表達在細胞質膜上的一類跨膜蛋白。GPCR由超過800個成員組成，是目前已知的哺乳動物基因組中最大的膜蛋白家族。在人體內，GPCR蛋白廣泛分佈於中樞神經系統、免疫系統、心血管、視網膜等器官和組織，參與機體的發育和正常的功能行使。

GPCR蛋白主體由7段跨細胞質膜的α螺旋結構構成。N端和三個環位於胞外，參與蛋白與其受體的相互作用；C端和3個環位於胞內，其中C端和第3個環在GPCR蛋白與下游G蛋白的相互作用從而介導胞內的信號傳導過程中發揮重要的作用。

“GCGR”是胰高血糖素(Glucagon)受體，是GPCR家族的成員之一，胰高血糖素與GCGR結合後主要藉由激活下游途徑，加速糖原分解、脂肪分解和/或糖異生，使血糖升高。

術語“抗體(antibody，Ab)”包含至少一個與具體抗原(或其表位)(例如GCGR)特異性結合或相互作用(例如識別和/或結合)的互補決定區的抗原結合分子(或分子複合物)。

術語“抗體”包含：包括藉由雙硫鍵相互連接的四條多肽鏈，兩條重(H)鏈和二條輕(L)鏈的免疫球蛋白分子以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈包含重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區(CH)。這一重鏈恆定區包含三個區(結構域)，CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恆定區(CL)。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為框架區(framework region,FR，也稱骨架區、構架區)。各VH和VL是由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

在本公開的不同實施例中，抗GCGR抗體(或其抗原結合片段)的FR可與人種系序列相同，或可經自然或人工修飾。抗體可以是不同亞類(subclass)的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亞類)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。

術語“抗體”還包含完全抗體分子的抗原結合片段。

術語抗體的“抗原結合部分”、“抗原結合結構域”、“抗原結合片段”等，如文中所用，包含任何與抗原特異性結合形成複合物的天然生成、酶制得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗體的抗原結合片段可使用任何適合的標準技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及編碼抗體可變區和(視需要)恆定區的DNA操作和表達的重組基因工程技術，來源於例如全抗體分子。這一DNA是已知的和/或可容易地從例如市售來源、DNA資料庫(包含，例如噬菌體-抗體資料庫)取得或可經合成。這一DNA可用化學或藉由使用分子生物技術來定序和操作，例如將一個或多個可變和/或恆定區排列成適合的配置，或導入密碼子，產生半胱胺酸殘基、修飾、增添或刪除胺基酸等。

抗原結合片段的非限定示例包含：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段。其它工程改造分子，例如區域特異性抗體、單域抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模塊免疫醫藥(SMIP)和鯊可變IgNAR區，也涵蓋在文中所用的“抗原結合片段”的詞語內。

抗原結合片段典型地將包含至少一個可變區。可變區可以是任何大小或胺基酸組成的區域且一般將包含與一個或多個框架序列相鄰或在其框架內的CDR。

在某些實施例中，抗體的抗原結合片段在任何可變區和恆定區的配置中，可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由完整或部分的絞鏈或連接子區相連接。絞鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所組成，使得在單一多肽分子中在相鄰的可變和/或恆定區之間產生柔性和半柔性連結。

“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的來源於小鼠或大鼠的單株抗體。製備時用抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤，當所注射的試驗對象為小鼠時，所產生的抗體為小鼠來源抗體，當所注射的試驗對象為大鼠時，所產生的抗體為大鼠來源抗體。

“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將第一物種(如鼠)抗體的可變區與第二物種(如人)抗體的恆定區融合而成的抗體。建立嵌合抗體，要先建立分泌第一物種(如鼠)單抗的融合瘤，然後從融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖第二物種(如人)抗體的恆定區基因，將第一物種可變區基因與第二物種恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。

在本公開一個較佳的實施方案中，該嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(如YTE突變或回復突變，L234A和/或L235A突變，或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區變體。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，包括CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將動物來源抗體，例如鼠源抗體的CDR序列移植到人的抗體可變區框架區(或構架區，framework region)中產生的抗體。人源化抗體可以克服嵌合抗體由於攜帶大量異源蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類框架區的序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網http：//www.vbase2.org/獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。

為避免免疫原性下降引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少的反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。

由於抗原的接觸殘基，CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基而導致產生的抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以可能是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查動物單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞類共有序列或具有高相似性百分數的動物抗體序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中起著重要作用。

在本公開一個的實施方案中，該抗體或其抗原結合片段，可進一步包含人源或鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。

人抗體重鏈恆定區和人抗體輕鏈恆定區的“常規變體”是指現有技術已公開的來源於人的不改變抗體可變區結構和功能的重鏈恆定區或輕鏈恆定區的變體，示例性變體包括對重鏈恆定區進行定點改造和胺基酸替換的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區變體，具體替換如現有技術已知的YTE突變，L234A和/或L235A突變，或S228P突變，或獲得knob-into-hole結構的突變(使得抗體重鏈具有knob-Fc和hole-Fc組合)，這些突變已被證實使得抗體具有新的性能，但不改變抗體可變區的功能。

“人抗體”與“人源抗體”可以互換使用，可以是源於人的抗體或者是從一種轉基因生物體中獲得的抗體，該轉基因生物體經“改造”以響應於抗原刺激而產生特異性人抗體並且可以藉由本領域已知的任何方法產生。在某些技術中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件引入到源於胚胎幹細胞系的生物體的細胞株中，這些細胞株中的內源性重鏈和輕鏈基因座被靶向破壞。轉基因生物可以合成對人抗原特異的人抗體，並且該生物可以用於產生人抗體-分泌融合瘤。人抗體還可以是一種抗體，其中重鏈和輕鏈是由源於一個或多個人DNA來源的核苷酸序列編碼的。完全人抗體還可以藉由基因或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術來構建，或者由體外活化的B細胞構建，所有的這些都是本領域已知的。

“單株抗體”是指從基本上均質抗體的群體獲得的抗體，即除可能的變體抗體(例如含有天然存在的突變或在製造單株抗體製劑的期間產生的突變，這些變體通常以少量存在)之外，構成該群體的個別抗體識別相同和/或結合相同表位。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製備物不同，單株抗體製備物(製劑)的每個單株抗體是針對抗原上的單一決定簇的。因此，修飾語“單株”指示如從基本上均質抗體群體獲得的抗體的特性，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來製造抗體。例如，根據本公開使用的單株抗體可藉由各種技術製備，該技術包括但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，此類方法以及用於製備單株抗體的其他示例性方法在本文中進行描述。術語“單株抗體或其抗原結合片段”中單株抗體指全長抗體。

術語“全長抗體”、“完整抗體”、“完全抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體，與下文定義的抗原結合片段相區分。該術語特別指重鏈由胺基端至羧基端依次包含VH區、CH1區、鉸鏈區和Fc區，輕鏈由胺基端至羧基端依次包含VL區和CL區的抗體。

此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選的片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。

抗原結合片段還可併入至包含一對串聯Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中，該對串聯Fv片段連同互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；及美國專利US5641870)。

Fab是藉由用木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的具有約50,000Da分子量的抗體片段，其具有抗原結合活性，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。

F(ab')2是藉由用胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000Da的抗體片段，並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區。

Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000Da並具有抗原結合活性的抗體片段。Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理特異性識別並結合抗原的F(ab')2來生產。

此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個(包括1個、2個、3個或4個)重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc Natl Acad Sci USA.90：6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur J Immuno.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J Mol Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol Immunother.50：51-59描述。

“Linker”或“接頭”或“連接子”指用於連接蛋白質結構域的連接性多肽序列，通常具有一定的柔性，接頭的使用不會使蛋白質結構域原有的功能喪失。

雙抗體(diabody)是指scFv被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。

dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering.7：697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。

本公開一些實施例中抗原結合片段可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別並結合抗原的單株抗體的VH和/或VL及所需的其他結構域的編碼cDNA，構建編碼抗原結合片段的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達抗原結合片段。

"Fc區"可以是天然序列Fc區或變體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可能變化，但人IgG重鏈Fc區通常被定義成從位置Cys226上的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基端。Fc區中的殘基的編號為如Kabat中的EU索引的編號。Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白的Fc區通常具有兩個恆定區結構域CH2和CH3。

“knob-Fc”指在抗體Fc區包含T366W的點突變，以形成類似knob的空間結構。相對應地，“hole-Fc”指在抗體Fc區包含T366S，L368A，Y407V的點突變，以形成類似hole的空間結構。Knob-Fc和hole-Fc由於空間位阻的原因，更易形成異二聚體。為進一步地促進異二聚體的形成，還可在knob-Fc和hole-Fc分別引入S354C和Y349C的點突變，藉由二硫鍵進一步促進異二聚體的形成。同時，為消除或減弱抗體Fc引起的ADCC效應，還可向Fc引入的234A和235A的取代突變。在雙特異性抗體中，knob-Fc或hole-Fc既可以作為第一多肽鏈的Fc區域，也可以作為第二多肽鏈的Fc區域，在同一雙特異性抗體中，第一多肽鏈和第二多肽鏈的Fc區不同時為knob-Fc或hole-Fc。

術語“胺基酸差異”或“胺基酸突變”是指相較於原蛋白質或多肽，變體蛋白質或多肽存在胺基酸的改變或突變，包括在原蛋白質或多肽的基礎上發生1個或數個胺基酸的插入、缺失或替換。

抗體的“可變區”是指單獨的或組合的抗體輕鏈的可變區(VL)或抗體重鏈的可變區(VH)。如在本領域中已知的，重鏈和輕鏈的可變區各自由藉由3個互補決定區(CDR)(也稱為高變區)連接的4個框架區(FR)組成。每一條鏈中的CDR藉由FR緊密地保持在一起並且與來自另一條鏈的CDR一起促成抗體的抗原結合部位的形成。存在至少2個用於確定CDR的技術：(1)基於跨種序列變異性的方法(即，Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；和(2)基於抗原-抗體複合物的晶體學研究的方法(Al-Lazikani等，J.Molec.Biol.273：927-948(1997))。如本文中所用，CDR可指由任一方法或由兩種方法的組合確定的CDR。

術語“抗體框架”或“FR區”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術語“互補決定區”和“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種公知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界，包括“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1 991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則(Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc M.P.，Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.P.等，Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))等。例如，對於經典格式，遵循Kabat規則，該重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。藉由組合Kabat和Chothia兩者的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)構成。遵循IMGT規則，VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT規則，抗體的CDR區可以使用程序IMGT/DomainGap Align確定。

“HCDR1、HCDR2和HCDR3區或其任意CDR變體”中的“其任意CDR變體”是指對HCDR1、HCDR2和HCDR3區中任意一個、或兩個、或三個HCDR進行胺基酸突變獲得的變體。

“抗體恆定區結構域”指來源於抗體的輕鏈和重鏈的恆定區的結構域，包括CL和來源於不同類抗體的CH1、CH2、CH3和CH4結構域。

“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10^-8M，例如大約小於10^-9M、10^-10M、10^-11M或更小的親和力(KD)結合。

當術語“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭，其藉由以下測定法來測定：在該測定法中，待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其抗原結合片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，ALaboratory Manual(抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接標記的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常該測定法涉及使用能與帶有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白結合的純化抗原(該抗原在固態表面或細胞表面)。在待測抗原結合蛋白存在下，測量結合於固態表面或細胞的標記的量，來測量競爭性抑制。通常，待測抗原結合蛋白是過量存在的。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑒定的抗原結合蛋白包括：結合與參考抗原結合蛋白同一表位的抗原結合蛋白；和結合充分接近參考抗原結合蛋白的結合表位的鄰近表位的抗原結合蛋白，該兩個表位在空間上互相妨礙發生結合。在本公開實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下，結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。

術語“親和力”是指在單一表位處，抗體與抗原之間相互作用的強度。在各抗原位點內，抗體“臂”的可變區藉由弱非共價力與抗原在多個胺基酸位點處相互作用；相互作用愈大，親和力愈強。如本文所用，抗體或其抗原結合片段(例如Fab片段)的術語“高親和力”通常是指具有1E^-9M或更小的K_D(例如1E^-10M或更小的K_D、1E^-11M或更小的K_D、1E^-12M或更小的K_D、1E^-13M或更小的K_D、1E^-14M或更小的K_D等)的抗體或抗原結合片段。

術語"KD"或“K_D”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，抗體以小於大約1E^-8M，例如小於大約1E^-9M、1E^-10M或1E^-11M或更小的解離平衡常數(KD)結合抗原，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。KD值越小，親和力越大。

術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。

術語"載體"意指能夠遞送一個或多個目標基因或序列並且較佳地在宿主細胞中表達其的構建體。載體的示例包括，但不限於，病毒載體、裸露DNA或RNA表達載體、質粒、黏粒或噬菌體載體、與陽離子凝聚劑締合的DNA或RNA表達載體、包封在脂質體中的DNA或RNA表達載體和某些真核生物細胞諸如生產細胞。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用抗原或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。本公開所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從網站http：//www.imgt.org/得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)、HEK293細胞(非限制性實施例如HEK293E細胞)和NS0細胞。

工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種可選的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的蛋白A或蛋白G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“施用”、“給藥”、“給予”、“處理”，當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指將外源性藥物、治療劑、診斷劑、組成物或者人為操作(比如實施例中的“安樂死”)提供給與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本公開實施例的任一種化合物的組合物，該受試者具(或疑似患有、或易感於)有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床有測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)可能無法在緩解每個目標疾病症狀方面都有效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。

“胺基酸保守修飾”或“胺基酸保守取代”指蛋白質或多肽中的胺基酸被具有相似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其他胺基酸取代，從而使得在不改變蛋白質或多肽的生物活性或其他所需特性(例如抗原親和力和/或特異性)的情況下，可以經常進行改變。本領域技術人員認識到，通常，多肽的非必需區域中的單個胺基酸取代基本上不改變生物活性(參見，例如，Watson等人，(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(第4版))。此外，結構上或功能上相似的胺基酸的取代不太可能破壞生物活性。示例性胺基酸保守取代如下：

原始殘基保守取代

Ala(A) Gly；Ser

Arg(R) Lys；His

Asn(N) Gln；His；Asp

Asp(D) Glu；Asn

Cys(C) Ser；Ala；Val

Gln(Q) Asn；Glu

Glu(E) Asp；Gln

Gly(G) Ala

His(H) Asn；Gln

Ile(I) Leu；Val

Leu(L) Ile；Val

Lys(K) Arg；His

Met(M) Leu；Ile；Tyr

Phe(F) Tyr；Met；Leu

Pro(P) Ala

Ser(S) Thr

Thr(T) Ser

Trp(W) Tyr；Phe

Tyr(Y) Trp；Phe

Val(V) Ile；Leu。

“有效量”、“有效劑量”是指獲得任一種或多種有益的或所需的治療結果所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量。對於預防用途，有益的或所需的結果包括消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作，包括病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀。對於治療應用，有益的或所需的結果包括臨床結果，如減少各種本公開靶抗原相關病症的發病率或改善該病症的一個或多個症狀，減少治療病症所需的其它藥劑的劑量，增強另一種藥劑的療效，和/或延緩受試者的本公開靶抗原相關病症的進展。

“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。

“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”、“同一性”在本文中可以互換，是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。通常，當比對兩個序列時進行比較以給出最大百分比同源性。例如，可以藉由BLAST算法執行比較，其中選擇算法的參數以在各個參考序列的整個長度上給出各個序列之間的最大匹配。

以下參考文獻涉及經常用於序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS)：Altschul,S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden,T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res. 25：3389-3402；Zhang,J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656。其他如NCBI BLAST提供的常規BLAST算法也為本領域技術人員所熟知。

“分離的”指加以改為“脫離其原始存在環境狀態”，並且在這種情況下意味著，指定的分子基本上不含其他非目標生物分子。通常，術語“分離的”並不意圖指完全不存在這些材料或不存在水、緩衝液或鹽，除非它們以顯著干擾如本文所述的化合物的實驗或治療用途的量存在。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本公開所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

術語“藥學上可接受的載體”指適合用於製劑中用於遞送抗體或抗原結合片段的任何無活性物質。載體可以是抗黏附劑、黏合劑、包衣、崩解劑、充填劑或稀釋劑、防腐劑(如抗氧化劑、抗菌劑或抗真菌劑)、增甜劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑等。合適的藥學上可接受的載體的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄欖油)、鹽水、緩衝液、緩衝的鹽水和等滲劑例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化鈉。

術語“代謝障礙”的具體示例為代謝綜合症、肥胖症、葡萄糖耐量受損、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高滲綜合症、圍術期高血糖症、高胰島素血症、胰島素抵抗綜合症、空腹血糖受損、血脂異常、動脈粥樣硬化或糖尿病前期狀態。

此外，本公開另一方面涉及用於免疫檢測或測定目標抗原的方法、用於免疫檢測或測定目標抗原的試劑、用於免疫檢測或測定表達目標抗原的細胞的方法和用於診斷與目標抗原陽性細胞相關的疾病的診斷劑，其包含本公開的特異性識別並結合目標抗原的單株抗體或抗體片段作為活性成分。

在本公開中，用於檢測或測定目標抗原的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。

免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的示例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。

上述與目標抗原陽性細胞相關的疾病可以藉由用本公開的單株抗體或抗體片段檢測或測定表達目標抗原的細胞來診斷。

為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。

在本公開中，對用於檢測或測定目標抗原的活體樣本沒有特別限制，只要它具有包含表達目標抗原的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。

根據所需的診斷方法，含有本公開的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與該標記對應的受質等。

在以上說明書中提出了本發明一種或多種實施方式的細節。雖然可使用與本文所述類似或相同的任何方法和材料來實施或測試本發明，但是以下描述較佳的方法和材料。藉由說明書和申請專利範圍第書，本發明的其他特點、目的和優點將是顯而易見的。在說明書和申請專利範圍中，除非上下文中有清楚的另外指明，單數形式包括複數指代物的情況。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬領域普通技術人員所理解的一般含義。說明書中引用的所有專利和出版物都藉由引用納入本文。提出以下實施例是為了更全面地說明本發明的較佳實施方式。這些實施例不應以任何方式理解為限制本發明的範圍，本發明的範圍由申請專利範圍限定。

[實施例]

實施例1：GCGR抗原抗體的製備

1.1 抗原構建和篩選

將編碼全長477個胺基酸的胰高血糖素受體的人類GCGR cDNA亞選殖到表達載體(如pcDNA3.1)中，並轉染CHO-K1細胞。在篩選和單細胞株後，選擇單株用於抗原的表達、及基於受體的細胞表面表達的特性研究。以下GCGR抗原未特殊說明的均指人GCGR。

全長GCGR：用於構建GCGR過表達細胞株，或用於免疫用抗原及後續檢測：

(SEQ ID NO：1)

1.2 GCGR融合瘤、重組抗體的純化

(1)融合瘤上清分離純化/ProteinG親和層析：

對於小鼠融合瘤上清純化首選ProteinG進行親和層析，將培養所得融合瘤離心取上清，根據上清體積加入10-15%體積的1M Tris-HCl(pH8.0-8.5)調節上清pH。ProteinG管柱利用6M鹽酸胍洗3-5倍管柱體積，然後利用純水清洗3-5倍管柱體積；利用如1×PBS(pH7.4)緩衝體系作為平衡緩衝液對層析管柱平衡3-5倍管柱體積；細胞上清利用低流速上樣結合，控制流速使保留時間約1min或更長時間；利用1×PBS(pH7.4)洗滌層析管柱3-5倍管柱體積至紫外吸收回落至基線；利用0.1M醋酸/醋酸鈉(pH3.0)緩衝液進行樣本沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速調節pH至5-6暫存。對於沖提產物可以利用本領域技術人員熟知的方法進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻如G-25脫鹽替換成所需的緩衝體系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻管柱去除沖提產物中的聚體成分以提高樣本純度。

(2)Protein A親和層析提取帶Fc標簽的雙特異性蛋白或者抗體：首先將表達Fc雙特異性蛋白或者抗體的細胞培養上清進行高速離心收取上清。ProteinA親和管柱利用6M鹽酸胍洗3-5倍管柱體積，然後利用純水清洗3-5倍管柱體積。利用如1×PBS(pH7.4)緩衝體系作為平衡緩衝液對層析管柱平衡3-5倍管柱體積。細胞上清利用低流速上樣結合，控制流速使保留時間約1min或更長時間，結合完畢後利用1×PBS(pH7.4)洗滌層析管柱3-5倍管柱體積至紫外吸收回落至基線。利用0.1M醋酸/醋酸鈉(pH3.0-3.5)緩衝液進行樣本沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速調節pH至5-6暫存。對於沖提產物可以利用本領域技術人員熟知的方法進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻如G-25脫鹽替換成所需的緩衝體系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻管柱去除沖提產物中的聚體成分以提高樣本純度。

實施例2：抗人GCGR單株抗體的製備

2.1 免疫

(1)小鼠免疫：抗人GCGR單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6-8週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原為GCGR CHO-K1穩轉細胞。

免疫方案：用佐劑TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)預先免疫小鼠，腹膜內(IP)注射0.1ml/隻(首次免疫)。15min後，腹膜內(IP)注射GCGR CHO-K1穩轉細胞，1E7細胞/隻。接種時間為第0、14、28、42、 56、70、84、98、112天。於第35，63，91天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。在第6-9次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射1 E7細胞/隻的GCGR CHO-K1穩轉細胞。

(2)大鼠免疫：使用DNA(編碼全長hGCGR，編碼序列參見Genbank登錄號：NM_000160)免疫6-8週齡SD大鼠，用FACS方法確定大鼠血清中的抗體滴度。在第3-4次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的大鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫。

2.2 脾細胞融合

採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到融合瘤細胞。融合的融合瘤細胞以0.5-1E6/ml的密度用完全培養基(含20% FBS、1×HAT、1×OPI的IMEM培養基)重懸，100μl/孔種於96孔板中，37℃，5%CO₂孵育3-4天後，補充HAT完全培養基100μl/孔，繼續培養3-4天至形成純株。去除上清，加入200μl/孔的HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的IMDM培養基)，37℃，5%CO₂培養3天後進行ELISA檢測。

2.3 融合瘤細胞篩選

根據融合瘤細胞生長密度，用細胞結合ELISA方法進行融合瘤培養上清檢測。將測試呈為陽性的孔細胞及時進行擴增、凍存、和二到三次亞選殖直至獲得單細胞株。

每次亞選殖細胞也均需進行GCGR細胞結合ELISA實驗檢測。藉由實驗篩選得到融合瘤純株，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在測試例中使用。

2.4 融合瘤陽性純株序列測定

從陽性融合瘤中選植序列過程如下。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA，用PrimeScript^TM Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄(Takara,Cat No.2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用小鼠Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序。

從得到的DNA序列獲得所篩選到的陽性純株，用無血清細胞培養法製備抗體，按純化實例純化抗體，在測試例中使用基於細胞的GCGR結合阻斷實驗經過多輪篩選，得到來源於小鼠的融合瘤純株1803，1805，1808和1810，來源於大鼠的融合瘤純株1817和1822。

經序列比對及計算機模擬發現，上述小鼠來源抗體m1803、m1805、m1808和m1810的輕重鏈CDR序列具有較高的同源性，大鼠來源抗體rat1817和rat1822的輕重鏈CDR序列具有較高的同源性，其共有序列如下表所示：

實施例3：鼠源抗人GCGR抗體的人源化

使用MOE軟件，比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫，分別挑選與鼠源抗體同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為模板。將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。根據需要，將骨架序列中部分胺基酸回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，即得到人源化抗GCGR單株抗體。其中CDR區胺基酸殘基的確定由Kabat編號系統確定並注釋。

上述鼠源抗體的輕重鏈可變區與人源抗體的輕重鏈恆定區連接後形成嵌合抗體，1803號純株對應的嵌合抗體命名為ch1803，其他抗體類推。

3.1 融合瘤純株1803的人源化

(1)融合瘤純株1803人源化構架選擇：

鼠源抗體m1803的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV1-3*01和hjh6.1，人源化可變區序列如下：

hu1803VH-CDR嫁接：(SEQ ID NO：61)

hu1803VL-CDR嫁接：(SEQ ID NO：58)

註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。

(2)融合瘤純株1803號的人源化模板選擇和回復突變設計如下表：

(3)融合瘤純株1803的人源化具體序列如下：

>hu1803_VL.1(同Hu1803VL-CDR嫁接)：(SEQ ID NO：58)

>hu1803_VL.1A：(SEQ ID NO：59)

>hu1803_VL.1B：(SEQ ID NO：60)

>hu1803_VH.1(同Hu1803VH-CDR嫁接)：(SEQ ID NO：61)

>hu1803_VH.1A：(SEQ ID NO：62)

>hu1803_VH.1B：(SEQ ID NO：63)

>hu1803_VH.1C：(SEQ ID NO：64)

(4)融合瘤純株1803來源抗體的人源化抗體輕鏈可變區和重鏈可變區序列組合如下：

上表中抗體名稱所指代的抗體輕重鏈可變區可以分別與抗體輕重鏈恆定區連接形成全長抗體。在本公開中如無明確說明時，形成全長抗體時輕鏈可變區與SEQ ID NO：73所示的Kappa鏈恆定區連接形成抗體輕鏈，重鏈可變區與SEQ ID NO：72所示的IgG4-AA連接形成抗體重鏈。

3.2 融合瘤純株1810的人源化

(1)融合瘤純株1810人源化構架選擇：

鼠源抗體m1810的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和hJK4.1，人源化重鏈模板為IGHV1-69*02和hJH4.1，人源化可變區序列如下：

Hu1810VH-CDR嫁接：(SEQ ID NO：68)

Hu1810VL-CDR嫁接：(SEQ ID NO：65)

(2)融合瘤純株1810號的人源化模板選擇和回復突變設計如下表：

(3)融合瘤純株1810的人源化具體序列如下：

>hu1810_VL.1(同Hu1810VL-CDR嫁接)：(SEQ ID NO：65)

>hu1810_VL.1A：(SEQ ID NO：66)

>hu1810_VL.1B：(SEQ ID NO：67)

>hu1810_VH.1(同Hu1810VH-CDR嫁接)：(SEQ ID NO：68)

>hu1810_VH.1A：(SEQ ID NO：69)

>hu1810_VH.1B：(SEQ ID NO：70)

>hu1810_VH.1C：(SEQ ID NO：71)

(4)融合瘤純株1810的人源化抗體輕重鏈可變區序列組合如下：

上表中抗體名稱所指代的抗體輕重鏈可變區可以分別與抗體輕重鏈恆定區連接形成全長抗體，在本公開中如無明確說明時，形成全長抗體時輕鏈可變區與SEQ ID NO：73所示的Kappa鏈恆定區連接形成抗體輕鏈，重鏈可變區與SEQ ID NO：72所示的IgG4-AA連接形成抗體重鏈。

實施例4：構建和表達GCGR嵌合體/人源化抗體的IgG4-AA形式

設計引物，PCR搭建各嵌合體/人源化抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建抗體全長表達載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。IgG4-AA抗體形式可以藉由IgG4抗體形式簡單點突變獲得，IgG4-AA代表F234A、L235A和S228P突變。F234A和L235A的突變可降低IgG4-Fc與FcγR的結合能力，進一步降低ADCC/CDC，S228P代表野生型IgG4鉸鏈區第228位的胺基酸S突變成P，該位點突變能夠避免天然IgG4抗體在體內發生Fab-交換(exchange)導致的錯配。

ch1803、ch1805、ch1808、ch1810、ch1817和ch1822為

表1所示動物來源的輕重鏈可變區分別與人抗體kappa鏈和人抗體IgG4-AA重鏈恆定區連接後形成的嵌合抗體。

IgG4-AA的重鏈恆定區序列如下：(SEQ ID NO：72)

抗體的輕鏈(Kappa鏈)恆定區序列如下：(SEQ ID NO：73)

構建後的抗體序列示例性列舉如下：

ch1803：抗體形式IgG4AA

ch1803重鏈序列：(SEQ ID NO：74)

ch1803輕鏈序列：(SEQ ID NO：75)

hu1803-1：抗體形式IgG4AA

hu1803-1重鏈序列：：(SEQ ID NO：76)

hu1803-1輕鏈序列：(SEQ ID NO：77)

hu1803-9重鏈序列：(SEQ ID NO：78)

hu1803-9輕鏈序列：(SEQ ID NO：79)

ch1805重鏈序列：(SEQ ID NO：80)

ch1805輕鏈序列：(SEQ ID NO：81)

ch1808重鏈序列：(SEQ ID NO：82)

ch1808輕鏈序列：(SEQ ID NO：83)

hu1810-12重鏈序列：(SEQ ID NO：84)

hu1810-12輕鏈序列：(SEQ ID NO：85)

ch1817重鏈序列：(SEQ ID NO：86)

ch1817輕鏈序列：(SEQ ID NO：87)

ch1822重鏈序列：(SEQ ID NO：88)

ch1822輕鏈序列：(SEQ ID NO：89)

陽性對照：度拉糖肽，是雙鏈形式，單鏈為GLP-1/hIgG4Fc(SEQ ID NO：90)

實施例5：抗體雙特異性蛋白的選殖和表達

採用人GLP-1肽作為雙特異性蛋白中GLP-1受體激動劑部分，將GCGR抗體作為雙特異性蛋白的GCGR拮抗部分，形成GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白。

研究發現，GLP-1特定位點胺基酸突變(如Q17E、I23V、K28R或G30R)後，形成的新GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白，其體外穩定性更高，其中將GLP-1A第17位的Q突變為E和第23位的I突變為V形式(GLP-1C)，穩定性最高。本公開GLP-1及其突變形式的非限制性實施例序列如下：

表8.GLP-1A多肽及其變體序列

利用同源重組技術，將本公開GLP-1肽的C末端胺基酸藉由肽鍵或接頭(linker)連接GCGR抗體重鏈N末端胺基酸。藉由293表達系統進行常規表達，得到如表9所示的雙特異性蛋白的模式結構：

*注：Ab為本公開該GCGR抗體。GLP-1肽可以連接至GCGR抗體重鏈可變區的胺基端或連接至GCGR抗體輕鏈可變區的胺基端。經試驗驗證，GLP-1肽連接至GCGR抗體中重鏈可變區的胺基端的雙特異性蛋白較連接至GCGR抗體輕鏈可變區的胺基端穩定性更佳。本公開GLP-1肽連接至GCGR全長抗體重鏈可變區的部分實施方式中雙特異性蛋白結構示意如第1圖所示。

將不同GLP-1肽與不同抗體的重鏈胺基酸用接頭(例如(GGGGS)₃)相連接，形成以下蛋白：

此處雙特異性蛋白中接頭接頭可選用(GGGGS)₃，在其他實施方式中也可以是肽鍵或其他常規用於多肽連接的接頭，(GGGGS)₃的使用並不是對本公開雙特異性蛋白接頭的限制。編碼GLP-1的核苷酸序列、編碼GCGR抗體的核苷酸序列、接頭蛋白片段((GGGGS)₃)的核苷酸序列藉由所屬領域常規技術手段獲得。利用同源重組技術將GLP-1的C末端核苷酸藉由接頭蛋白連接GCGR抗體的N末端核苷酸，選殖到Phr-BsmbI載體上。重組的GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白在293細胞表達，藉由實施例6的方法進行純化。純化的蛋白可用於下述各實施例實驗中。

實施例6：抗體雙特異性蛋白的純化

細胞培養液高速離心後收集上清，利用親合層析進行第一步純化。層析介質為與Fc相互作用的Protein A或者衍生填料，如GE的Mabselect。平衡緩衝液為1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，pH7.4)，平衡5倍管柱體積後，將細胞上清上樣結合，流速控制為樣本在管柱上保留時間≧1min。上樣結束後，用1×PBS(pH7.4)沖洗管柱，直至A280紫外吸收降至基線。然後用0.1M甘胺酸(pH3.0)的沖提緩衝液沖洗層析管柱，根據A280紫外吸收峰收集沖提峰，收集的沖提樣本用1M Tris(pH8.5)中和。

將上述中和後的沖提樣本超濾濃縮後進行體積排阻層析，緩衝液為1×PBS，層析管柱為XK26/60 Superdex200(GE)，流速控制在4ml/min，上樣體積小於5ml，根據A280紫外吸收合併目的蛋白峰。收集的蛋白經SEC-HPLC鑒定純度大於95%，經LC-MS鑒定為正確後分裝備用。得到GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白。

[測試例]

測試例1：GCGR嵌合抗體結合人、小鼠和食蟹猴GCGR的ELISA實驗

抗GCGR抗體的結合力藉由抗體與過表達GCGR的CHO細胞的結合實驗來檢測。藉由轉染的方法分別將人、小鼠和食蟹猴GCGR全長質粒轉進CHO細胞中加壓篩選兩週後，檢測GCGR的表達量。將過表達細胞固定於96孔板底後，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和GCGR過表達CHO細胞的結合活性，三種種屬GCGR抗體結合實驗方法相同，以檢測GCGR抗體結合人GCGR方法為例，具體實驗方法如下：

將細胞以0.9-1.0×10⁶/ml密度，100μl/孔接種於96孔板中過夜培養。棄上清，用PBS洗三遍後，加入100μl/孔的細胞免疫固定液(Beyotime，Cat Wo.P0098)室溫固定1小時，PBS洗四遍。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(BD skim milk,Cat Wo.232100)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育3小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4 PBS含0.05% tweee W-20)洗板3次後，加入50μl/孔用樣本稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體、嵌合抗體或人源化抗體)，放於37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加入50μl/孔用樣本稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackso W Immu Wo Research，Cat Wo.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackso W Immu Wo Research，Cat Wo.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat Wo.52-00-03)，於室溫孵育10min，加入50μl/孔1M H₂SO4終止反應，用酶標儀(Thermo scientific Multiskan MK3)在波長450nm處讀取吸收值，用GraphPad Prism 5分析數據，計算GCGR嵌合抗體對GCGR過表達CHO細胞的結合EC50值，結果見下表。

結果顯示各嵌合抗體ch1803、ch1805、ch1808、ch1810、ch1817和ch1822均與人GCGR具有良好的細胞表面結合活性，並且與小鼠GCGR和食蟹猴GCGR也有較好的交叉親和活性。

測試例2：GCGR嵌合抗體阻斷GCGR配體與GCGR結合試驗

1、測試目的：

藉由GCGR嵌合抗體阻斷GCGR配體胰高血糖素與GCGR結合試驗來評估GCGR嵌合抗體的拮抗活性。

2、測試原理：

cAMP與CRE結合可啟動CRE下游螢光素酶基因(luciferase)的表達，螢光素酶與其受質結合後發出螢光，藉由螢光信號變化反映抑制效率。將CRE選殖至螢光素酶基因的上游，藉由與含GCGR基因的質粒共轉染CHO-K1細胞，挑選出同時高表達CRE及GCGR的單株細胞。GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白和胰高血糖素可競爭性的與GCGR結合，阻斷GCGR的下游信號傳遞，影響下游cAMP的表達，藉由測定螢光信號變化可評估GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白對GCGR的拮抗活性。

3、測試樣本：

嵌合抗體ch1803，ch1805，ch1808，ch1810，ch1817，ch1822。

4、實驗步驟：

a.用新鮮細胞培養基製取細胞懸液，以20000個細胞/孔加入80μl培養體系的96孔細胞培養板中，5%二氧化碳，37℃培養16小時。

b.每孔分別加入10μl配製好的待測蛋白，再加入10μl配好的胰高血糖素，5%二氧化碳，37℃培養5小時。

c.每孔加入加100μl檢測液ONE Glo(Promega)，室溫避光放置7分鐘。

d.酶標儀Victor3上檢測螢光，計算GCGR嵌合抗體融合對人、小鼠和食蟹猴GCGR配體胰高血糖素的結合阻斷的IC50值及阻斷效率Imax。

測試例3：GCGR人源化抗體對GCGR配體與GCGR結合的阻斷試驗

藉由抗GCGR抗體阻斷GCGR配體胰高血糖素與GCGR的結合試驗來評估GCGR抗體的拮抗活性。實驗原理和步驟同測試例2，結果見下表：

體外活性生物學評價

測試例4：GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白在PBS中的穩定性

取200μg待測抗體雙特異性蛋白溶於1ml 1×PBS(pH7.4)中，37℃恆溫箱存放；分別於0和14天取樣，Agilent 6530 Q-TOF進行LC-MS檢測完整重鏈保留情況，結果如下表14所示。含各突變改造的GLP-1肽的雙特異性蛋白均較含GLP-1A(SEQ ID NO：91)的雙特異性蛋白穩定性大大提高，並且hu1803-9B、hu1803-9D和hu1803-9G顯示出更良好的穩定性。

測試例5：基於細胞的GCGR結合阻斷實驗

實驗原理和步驟同測試例2。

測試樣本：

①GCGR抗體(hu1803-9，hu1810-12)

②雙特異性蛋白hu1803-9B，hu1803-9D。

第2圖和表15顯示hu1803-9B和hu1803-9D均能完全抑制GCGR的拮抗活性，且與GCGR單抗具有相當的功效和IC50(抑制最大活性的50%所需的濃度)，表明hu1803-9B和hu1803-9D均保留了GCGR抗體部分完全的生物活性。除驗證hu1803-9及含有hu1803-9的雙特異性蛋白具有抑制人GCGR的拮抗活性外，進一步地還證明(見表16)hu1803-9和hu1810-12具有抑制小鼠GCGR和食蟹猴GCGR的拮抗活性。

測試例6：基於細胞的GLP-1R結合激活實驗

1、測試目的：

評估GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白的GLP-1部分對GLP-1R的激活活性。

2、測試原理：

cAMP與CRE結合可啟動CRE下游螢光素酶基因的表達，螢光素酶與其受質結合後發出螢光，藉由螢光信號變化反映抑制效率。將CRE選殖至螢光素酶基因的上游，藉由與含GLP-1R基因的質粒共轉染CHO-K1細胞，挑選出同時高表達CRE及GLP-1R的單株細胞。GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白和陽性對照度拉糖肽可與GLP-1R結合，激活GLP-1R的下游信號傳遞，刺激下游cAMP的表達，藉由測定螢光信號變化可評估GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白對GLP-1R的激活活性。

3、測試樣本：

①陽性對照：度拉糖肽

②hu1803-9B，hu1803-9D。

4、實驗步驟：

a.用新鮮細胞培養基制取細胞懸液，以25000個細胞/孔加入90μl培養體系的96孔細胞培養板中，5%二氧化碳，37℃培養16小時。

b.每孔分別加入10μl配製好的待測蛋白，5%二氧化碳，37℃培養5小時。

c.每孔加入加100μl檢測液ONE Glo(Promega)，室溫避光放置7分鐘。

d.酶標儀Victor3上檢測螢光，計算GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白對GLP-1R的結合激活的EC50值。

第3圖和表17顯示hu1803-9B和hu1803-9D均能完全激活GLP-1R，且與陽性對照度拉糖肽具有相當的功效和EC50(激活最大活性的50%所需的濃度)，表明hu1803-9B和hu1803-9D均保留了GLP-1部分完全的生物活性。

表18顯示ch1805-D、ch1808-D、ch1817-D嵌合抗體與GLP1肽連接均能完全激活GLP-1R，且與陽性對照度拉糖肽具有相當的功效和EC50(激活最大活性的50%所需的濃度)，表明不同GCGR抗體與GLP1肽以本公開的方式連接所形成的雙特異性蛋白不影響GLP1肽的生物活性。

藥物代謝動力學評價

測試例7：C57小鼠體內藥物代謝動力學檢測

實驗用C57小鼠4隻，雌性，12/12小時光/暗調節，溫度24±3℃恆溫，濕度50-60%，自由進食飲水。購自傑思捷實驗動物有限公司。實驗當天對C57小鼠分別尾靜脈注射等莫耳hu1803-9D和陽性對照藥物度拉糖肽，給藥劑量分別為6mg/kg和2.35mg/kg，注射體積為10ml/kg。

因本公開的GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白和陽性對照度拉糖肽均與小鼠有交叉活性，因此在小鼠體內藥物代謝時間較短，選擇的取血時間點為：第1天給藥後0h、1h、24h(第2天)，第3天，於小鼠眼底靜脈取血，每次150μl(採血前，提前向採血管中加入1.5μl的DPP-4抑制劑)；收集的血樣在4℃下置放半小時至凝集，然後4℃下14000×g離心5分鐘。收集上清(約80μl)，立即放置-80℃貯存。

檢測流程描述如下：

a.1μg/mL抗-GLP1(Novus,NBP1-05180)抗體鋪板，4℃過夜。

b.250μl 1×PBST洗滌4次，加入200μl含5%脫脂牛奶的PBS,37℃封閉3小時。

c.250μl 1×PBST洗滌4次，加入100μl小鼠空白血清梯度稀釋的待測藥物，37℃孵育2小時。

d.250μl 1×PBST洗滌3次。

e.每孔加入100μl辣根過氧化物酶標記的二抗抗人IgG Fc，37℃孵育1小時。

f.250μl 1×PBST洗滌3次。

g.每孔加入100μl TMB，室溫孵育10分鐘後加入100μl 1M H₂SO₄終止反應。

h.酶標儀上檢測450nm測吸收值，Graphpad Prism5分析數據。

PK分析結果表明，本公開雙特異性蛋白分子hu1803-9D在小鼠體內的半衰期約為23.4h，為陽性對照藥物半衰期的2倍。

體內活性生物學評價

測試例8：ob/ob小鼠體內藥效實驗

1、本實驗應用的小鼠品系為糖尿病ob/ob小鼠和同齡野生型小鼠(南京大學南京模式動物研究所)，目的為觀察GLP-1/GCGR抗體雙特異性蛋白連續多次給藥後對ob/ob小鼠血糖、糖化血紅蛋白、體重、攝食量等糖尿病相關指標的治療作用。

實驗進行前對模型組動物按照實驗當天的隨機和空腹體重、隨機和空腹血糖將其分成6組，分別為：

模型對照組、2.84mg/kg、1.42mg/kg GCGR單抗組(hu1803-9)、1.16mg/kg陽性對照組(度拉糖肽)和3mg/kg、1.5mg/kghu1803-9D，模型對照組小鼠皮下注射(S.C.)給予磷酸鹽緩衝液，各組小鼠每週1次皮下注射(9：00AM)，一共4次(表20)。

2、實驗步驟：

a.每週測定一次空腹和隨機體重，每天測定一次攝食量和飲水量。

b.首次給藥前及給藥後第1、2、3、7天測隨機血糖，後每週測一次隨機血糖。首次給藥前及給藥後第3、7天測6h空腹血糖，後每週測一次空腹血糖。

c.給藥第26天，動物禁食6h(8：00-14：00)後，單次腹腔給予葡萄糖水溶液2g/kg，並將給糖時間記為0點，在給糖前0min，給糖後15、30，60、90、120min分別對動物進行血糖檢測，根據時間對血糖數據繪製糖耐量曲線，計算曲線下面積(AUC)。

d.實驗結束後，小鼠禁食6小時(8：00-14：00)後給予安樂死，心臟取血後全血分為兩部分，一部分約30μl注入已加好抗凝劑離心管並存放於濕冰中用於糖化血紅蛋白測定，另一部分靜置後離心取血清用於TG、FFA、CHOL、HDL、LDL水平測定。

e.數據採用graphpad Prism 6軟體分析，採用Student-t test對數據進行統計學分析。

3、實驗結果：

1)長期用藥對ob/ob小鼠隨機血糖的影響：

如第4圖所示，整個試驗期間，模型對照組ob/ob小鼠隨機血糖維持在較高的水平，一週一次皮下注射不同劑量各組藥物後，各組小鼠的隨機血糖均有不同程度的下降，呈現良好的劑量效應且顯著低於模型對照組。2.84mg/kg的hu1803-9給藥和3mg/kg hu1803-9D給藥的降糖效果顯著優於其他各試驗組，而3mg/kg hu1803-9D給藥第3、6、14和30天的隨機血糖效果更佳。

2)長期用藥對ob/ob小鼠饑餓血糖的影響：如第5圖所示，整個試驗期間，模型對照組ob/ob小鼠隨機血糖維持在較高的水平，一週一次皮下注射不同劑量各組藥物後，各組小鼠的饑餓血糖均有不同程度的下降，呈現良好的劑量效應且顯著低於模型對照組。與隨機血糖濃度試驗相似，2.84mg/kg的hu1803-9給藥和3mg/kg hu1803-9D給藥的降糖效果顯著優於其他各試驗組，而3mg/kg hu1803-9D給藥第3、6、13和30天的饑餓血糖效果更佳。

3)長期用藥對ob/ob小鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)的影響：

結果如表21所示，ob/ob小鼠一週一次皮下注射不同劑量各組藥物30天後，糖化血紅蛋白水平均有不同程度的下降，且顯著低於模型對照組(P<0.05)，3mg/kg和1.5mg/kg的hu1803-9D組糖化血紅蛋白水平分別為5.5±0.2%和4.7±0.1%，呈明顯的劑量效應關係；其中3mg/kg的hu1803-9D組低於等莫耳的1.16mg/kg陽性對照度拉糖肽及2.84mg/kg的GCGR單抗hu1803-9(P<0.05)。

測試例9：GCGR抗體的競爭性ELISA實驗

藉由生物素標記的抗體與不同濃度的標準抗體競爭結合過表達GCGR的CHO細胞的ELISA實驗來檢測，對GCGR抗體與GCGR結合的表位分類。細胞板準備方法與測試例1相同，後續具體實驗方法如下：

按生物素標記試劑盒說明書標記抗體(Dojindo Molecular Technologies,Inc.LK03)。在96孔細胞板中，按50μl/孔用樣本稀釋液稀釋的不同濃度未生物素標記待測抗體，放於37℃孵育2小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加入50μl/孔用樣本稀釋液稀釋至0.1μg/ml的生物素標記抗體，37℃孵育2小時後用PBST洗板3次，加入HRP標記的羊抗人二抗(Jackso W Immu Wo Research，Cat Wo.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat Wo.52-00-03)，於室溫孵育10min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用酶標儀(Thermo scientific Multiskan MK3)在波長450nm處讀取吸收值，用GraphPad Prism 5分析數據。

當生物素標記抗體競爭結合至細胞板上的濃度越低時，OD值越低，反之信號越高。按公式IC%=(待測抗體最高OD_450nm-待測抗體最低OD_450nm)/(待測最高OD_450nm-標記抗體最低OD_450nm)計算競爭效率，結果見下表22。

結果顯示，ch1817與ch1822具有非常相近的表位，ch1808、hu1803-9和hu1810-12具有非常相近的表位；而ch1808、hu1803-9和hu1810-12的表位推測在ch1805的表位範圍內。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司上海恆瑞醫藥有限公司

<120> 雙特異性蛋白

<160> 113

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> 肽

<223> 全長GCGR

<400> 1

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> m1803重鏈可變區

<400> 2

<210> 3

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> m1803輕鏈可變區

<400> 3

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> m1805重鏈可變區

<400> 4

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> m1805輕鏈可變區

<400> 5

<210> 6

<211> 122

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> m1808重鏈可變區

<400> 6

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> m1808輕鏈可變區

<400> 7

<210> 8

<211> 123

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> m1810重鏈可變區

<400> 8

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> m1810輕鏈可變區

<400> 9

<210> 10

<211> 125

<212> PRT

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1817重鏈可變區

<400> 10

<210> 11

<211> 111

<212> PRT

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1817輕鏈可變區

<400> 11

<210> 12

<211> 125

<212> PRT

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1822重鏈可變區

<400> 12

<210> 13

<211> 111

<212> PRT

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1822輕鏈可變區

<400> 13

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1803 HCDR1

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1803 HCDR2

<400> 15

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1803 HCDR3

<400> 16

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1803 LCDR1

<400> 17

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1803 LCDR2

<400> 18

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1803 LCDR3

<400> 19

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1805 HCDR1

<400> 20

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1805 HCDR2

<400> 21

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1805 HCDR3

<400> 22

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1805 LCDR1

<400> 23

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1805 LCDR2

<400> 24

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1805 LCDR3

<400> 25

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1808 HCDR1

<400> 26

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1808 HCDR2

<400> 27

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1808 HCDR3

<400> 28

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1808 LCDR1

<400> 29

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1808 LCDR2

<400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1808 LCDR3

<400> 31

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1810 HCDR1

<400> 32

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1810 HCDR2

<400> 33

<210> 34

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1810 HCDR3

<400> 34

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1810 LCDR1

<400> 35

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1810 LCDR2

<400> 36

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> m1810 LCDR3

<400> 37

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1817 HCDR1

<400> 38

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1817 HCDR2

<400> 39

<210> 40

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1817 HCDR3

<400> 40

<210> 41

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1817 LCDR1

<400> 41

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1817 LCDR2

<400> 42

<210> 43

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1817 LCDR3

<400> 43

<210> 44

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1822 HCDR3

<400> 44

<210> 45

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1822 LCDR1

<400> 45

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1822 LCDR2

<400> 46

<210> 47

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> rat1822 LCDR3

<400> 47

<210> 48

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 小鼠抗體HCDR1通式

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(3)

<223> Xaa-Xaa-Xaa選自Asp-Tyr-Trp、Thr-Asn-Gly或Asn-Tyr-Ala.

<220>

<221> 結構域

<222> (5)..(5)

<223> Xaa選自Glu或Ser.

<400> 48

<210> 49

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 小鼠抗體HCDR2通式

<220>

<221> 結構域

<222> (3)..(3)

<223> Xaa選自Leu或Tyr.

<220>

<221> 結構域

<222> (5)..(5)

<223> Xaa選自Gly、Arg或Thr.

<220>

<221> 結構域

<222> (7)..(7)

<223> Xaa選自Gly或Thr.

<220>

<221> 結構域

<222> (8)..(8)

<223> Xaa選自Tyr或Asn.

<220>

<221> 結構域

<222> (10)..(10)

<223> Xaa選自Asn或Tyr.

<400> 49

<210> 50

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 小鼠抗體HCDR3通式

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(1)

<223> Xaa選自Gly或Ser.

<220>

<221> 結構域

<222> (2)..(2)

<223> Xaa選自Ile、Leu或Val-Ile.

<220>

<221> 結構域

<222> (3)..(3)

<223> Xaa選自Ser或Thr

<220>

<221> 結構域

<222> (4)..(4)

<223> Xaa選自Ser或Thr

<220>

<221> 結構域

<222> (5)..(5)

<223> Xaa選自Leu或Val.

<220>

<221> 結構域

<222> (6)..(6)

<223> Xaa選自Met、Val或Ile.

<220>

<221> 結構域

<222> (7)..(7)

<223> Xaa選自Ser、Gly或Ala.

<220>

<221> 結構域

<222> (8)..(8)

<223> Xaa選自Thr、Ala或Val.

<400> 50

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 小鼠抗體LCDR1通式

<220>

<221> 結構域

<222> (4)..(4)

<223> Xaa選自Leu或Gln.

<400> 51

<210> 52

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 小鼠抗體LCDR2通式

<220>

<221> 結構域

<222> (2)..(2)

<223> Xaa選自Ser或Thr.

<400> 52

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 小鼠抗體LCDR3通式

<220>

<221> 結構域

<222> (3)..(3)

<223> Xaa選自Thr或Gly.

<220>

<221> 結構域

<222> (5)..(5)

<223> Xaa選自Met、Thr或Ile.

<220>

<221> 結構域

<222> (6)..(6)

<223> Xaa選自Phe或Val.

<220>

<221> 結構域

<222> (8)..(8)

<223> Xaa選自Trp或Tyr.

<400> 53

<210> 54

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 大鼠抗體HCDR3通式

<220>

<221> 結構域

<222> (4)..(4)

<223> Xaa選自Pro或Ala.

<220>

<221> 結構域

<222> (7)..(7)

<223> Xaa選自Phe或His.

<220>

<221> 結構域

<222> (14)..(14)

<223> Xaa選自Leu或Met.

<400> 54

<210> 55

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 大鼠抗體LCDR1通式

<220>

<221> 結構域

<222> (9)..(9)

<223> Xaa選自Glu或Asp.

<400> 55

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 大鼠抗體LCDR2通式

<220>

<221> 結構域

<222> (3)..(3)

<223> Xaa選自Asp或Val.

<400> 56

<210> 57

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 大鼠抗體LCDR3通式

<220>

<221> 結構域

<222> (5)..(5)

<223> Xaa選自Ser或Thr.

<220>

<221> 結構域

<222> (6)..(6)

<223> Xaa選自Ser或Asn.

<220>

<221> 結構域

<222> (10)..(10)

<223> Xaa選自Phe或Ile.

<400> 57

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VL.1

<400> 58

<210> 59

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VL.1A

<400> 59

<210> 60

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VL.1B

<400> 60

<210> 61

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VH.1

<400> 61

<210> 62

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VH.1A

<400> 62

<210> 63

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VH.1B

<400> 63

<210> 64

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> hu1803_VH.1C

<400> 64

<210> 65

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu1810_VL.1

<400> 65

<210> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu1810_VL.1A

<400> 66

<210> 67

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu1810_VL.1B

<400> 67

<210> 68

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu1810_VH.1

<400> 68

<210> 69

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu1810_VH.1A

<400> 69

<210> 70

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu1810_VH.1B

<400> 70

<210> 71

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu1810_VH.1C

<400> 71

<210> 72

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> IgG4-AA的重鏈恆定區

<400> 72

<210> 73

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 抗體的輕鏈(Kappa鏈)恆定區

<400> 73

<210> 74

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1803重鏈

<400> 74

<210> 75

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1803輕鏈

<400> 75

<210> 76

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu1803-1重鏈

<400> 76

<210> 77

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu1803-1輕鏈

<400> 77

<210> 78

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9重鏈

<400> 78

<210> 79

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9輕鏈

<400> 79

<210> 80

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1805重鏈

<400> 80

<210> 81

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1805輕鏈

<400> 81

<210> 82

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1808重鏈

<400> 82

<210> 83

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1808輕鏈

<400> 83

<210> 84

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1810-12重鏈

<400> 84

<210> 85

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1810-12輕鏈

<400> 85

<210> 86

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1817重鏈

<400> 86

<210> 87

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1817輕鏈

<400> 87

<210> 88

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1822重鏈

<400> 88

<210> 89

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1822輕鏈

<400> 89

<210> 90

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 度拉糖肽(Dulaglutide)

<400> 90

<210> 91

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> GLP-1A

<400> 91

<210> 92

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> GLP-1B

<400> 92

<210> 93

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> GLP-1C

<400> 93

<210> 94

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> GLP-1D

<400> 94

<210> 95

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> GLP-1E

<400> 95

<210> 96

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> GLP-1F

<400> 96

<210> 97

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> GLP-1G

<400> 97

<210> 98

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> GLP-1H

<400> 98

<210> 99

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> GLP-1J

<400> 99

<210> 100

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9A含重鏈部分

<400> 100

<210> 101

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9B含重鏈部分

<400> 101

<210> 102

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9C含重鏈部分

<400> 102

<210> 103

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9D含重鏈部分

<400> 103

<210> 104

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9E含重鏈部分

<400> 104

<210> 105

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9F含重鏈部分

<400> 105

<210> 106

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9G含重鏈部分

<400> 106

<210> 107

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9H含重鏈部分

<400> 107

<210> 108

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1803-9J含重鏈部分

<400> 108

<210> 109

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1805-D含重鏈部分

<400> 109

<210> 110

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1808-D含重鏈部分

<400> 110

<210> 111

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> hu1810-12D含重鏈部分

<400> 111

<210> 112

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1817-D含重鏈部分

<400> 112

<210> 113

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> ch1822-D含重鏈部分

<400> 113

Claims

一種抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含選自如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：

a)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：48、49和50所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：51、52和53所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；或

b)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：38、39和54所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：55、56和57所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
如申請專利範圍第1項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含選自如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：

i)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

ii)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

iii)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：26、27和28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：29、30和31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

iv)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：32、33和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：35、36和37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

v)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：38、39和40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：41、42和43所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；和

vi)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：38、39和44所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：45、46和47所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
如申請專利範圍第1或2項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其是鼠源抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、或人源化抗體或其抗原結合片段。
如申請專利範圍第3項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，該人源化抗體包含源自人抗體的框架區或其框架區變體，其中：

該框架區變體在人抗體的輕鏈框架區和/或重鏈框架區上分別具有至多10個胺基酸的回復突變。
如申請專利範圍第4項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該胺基酸回復突變選自：

aa)輕鏈可變區中包含42G、44V、71Y和87F中的一個或更多個回復突變，和/或

重鏈可變區中包含38K、48I、67A、69F、71A、73P、78A和93S中的一個或更多個回復突變；或者

ab)輕鏈可變區中包含38L、44V、59S、70E和71Y中的一個或更多個回復突變，和/或

重鏈可變區中包含38K、48I、66K、67A、69L、73R、78M和94S中的一個或更多個回復突變。
如申請專利範圍第3或4項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其包含選自如下所示的輕鏈可變區和重鏈可變區組合：

c)重鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：2、61、62、63和64任一所示或與SEQ ID NO：2、61、62、63和64任一所示具有至少90%序列同一性；和

輕鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：3、58、59和60任一所示或與SEQ ID NO：3、58、59和60任一所示具有至少90%序列同一性；

d)重鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：4所示或與SEQ ID NO：4所示具有至少90%序列同一性；和

輕鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：5所示或與SEQ ID NO：5所示具有至少90%序列同一性；

e)重鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：6所示或與SEQ ID NO：6所示具有至少90%序列同一性；和

輕鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：7所示或與SEQ ID NO：7所示具有至少90%序列同一性；

f)重鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：8、68、69、70和71任一所示或與SEQ ID NO：8、68、69、70和71任一所示具有至少90%序列同一性；和

輕鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：9、65、66和67任一所示或與SEQ ID NO：9、65、66和67任一所示具有至少90%序列同一性；

g)重鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：10所示或與SEQ ID NO：10所示具有至少90%序列同一性；和

輕鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：11所示或與SEQ ID NO：11所示具有至少90%序列同一性；和

h)重鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：12所示或與SEQ ID NO：12所示具有至少90%序列同一性；和

輕鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：13所示或與SEQ ID NO：13所示具有至少90%序列同一性。
如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體為全長抗體，進一步包括抗體恆定區。
如申請專利範圍第7項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區及其常規變體，該輕鏈恆定區選自人抗體κ和λ鏈恆定區及其常規變體。
如申請專利範圍第7項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其中，包含SEQ ID NO：72所示的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO：73所示的人抗體輕鏈恆定區。
如申請專利範圍第7至9項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，包括選自如下任一項所示的重鏈和輕鏈的組合：

j)該重鏈為SEQ ID NO：74、76或78所示或與其具有至少85%序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：75、77或79所示或與其具有至少85%序列同一性；

k)該重鏈為SEQ ID NO：80所示或與其具有至少85%序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：81所示或與其具有至少85%序列同一性；

l)該重鏈為SEQ ID NO：82所示或與其具有至少85%序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：83所示或與其具有至少85%序列同一性；

m)該重鏈為SEQ ID NO：84所示或與其具有至少85%序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：85所示或與其具有至少85%序列同一性；

n)該重鏈為SEQ ID NO：86所示或與其具有至少85%序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：87所示或與其具有至少85%序列同一性；和

o)該重鏈為SEQ ID NO：88所示或與其具有至少85%序列同一性，且該輕鏈為SEQ ID NO：89所示或與其具有至少85%序列同一性。
一種抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其中包含選自如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區組合：

ac)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：2所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：3所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

ad)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：4所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：5所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

ae)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：6所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：7所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

af)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：8所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：9所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；

ag)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：10所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：11所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區；和

ah)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：12所示重鏈可變區具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3區，和

輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：13所示輕鏈可變區具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體、二聚化的V區(雙抗體)和二硫鍵穩定化的V區(dsFv)。
一種雙特異性蛋白，其包含GLP-1肽和抗GCGR抗體或其抗原結合片段，該GLP-1肽藉由肽鍵或接頭共價連接至該抗GCGR抗體或其抗原結合片段。
如申請專利範圍第13項所述的雙特異性蛋白，其中：

該GLP-1肽的羧基端藉由肽鍵或接頭連接至該抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基端；或者

該GLP-1肽的羧基端藉由肽鍵或接頭連接至該抗GCGR抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的胺基端。
如申請專利範圍第14項所述的雙特異性蛋白，其中，該抗GCGR抗體或其抗原結合片段是申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段。
如申請專利範圍第13至15項中任一項所述的雙特異性蛋白，其中：

該GLP-1肽是SEQ ID NO：91所示的GLP-1肽或其變體，

該GLP-1肽變體為SEQ ID NO：91所示GLP-1肽中包含Q17E、I23V、K28R和G30R中一個或更多個胺基酸突變。
如申請專利範圍第16項所述的雙特異性蛋白，其中，該GLP-1肽變體包含Q17E突變、或包含Q17E和I23V突變。
如申請專利範圍第16或17項所述的雙特異性蛋白，其中，該GLP-1肽變體的序列如SEQ ID NO：92、93、94、95、96、97、98或99所示。
如申請專利範圍第18項所述的雙特異性蛋白，其中，該雙特異性蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈包含申請專利範圍第1至12項中任一項所述抗GCGR的單抗體的重鏈；該第二多肽鏈包含申請專利範圍第1至12項中任一項所述抗GCGR的單株抗體的輕鏈；其中：

(ai)該第一多肽鏈包含：選自SEQ ID NO：100、101、102、103、104、105、106、107和108任一所示的多肽，和

該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：79所示的多肽；

(aj)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：109所示的多肽，和

該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：81所示的多肽；

(ak)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：110所示的多肽，和該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：83所示的多肽；

(al)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：111所示的多肽，和該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：85所示的多肽；

(am)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：112所示的多肽，和該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：87所示的多肽；或者

(an)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：113所示的多肽，和該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：89所示的多肽。
一種GLP-1肽變體，該GLP-1肽變體是在SEQ ID NO：91所示的GLP-1肽基礎上包含Q17E、I23V、K28R和G30R中一個或更多個胺基酸突變。
如申請專利範圍第20項所述的GLP-1肽變體，其中，該GLP-1肽變體包含Q17E突變、或包含Q17E和I23V突變。
如申請專利範圍第20或21項所述的GLP-1肽變體，其中，該GLP-1肽變體的序列如SEQ ID NO：92、93、94、95、96、97、98或99所示。
一種醫藥組成物，其含有：

治療有效量的如申請專利範圍第1至12項中任一項所述抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如申請專利範圍第13至19項中任一項所述的雙特異性蛋白，或如申請專利範圍第20至22項中任一項所述的GLP-1肽變體，以及

一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
一種分離的核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或如申請專利範圍第13至19項中任一項所述的雙特異性蛋白，或如申請專利範圍第20至22項中任一項所述的GLP-1肽變體。
一種重組載體，其包含申請專利範圍第24項所述的分離的核酸分子。
一種宿主細胞，其轉化有申請專利範圍第25項所述的重組載體，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
如申請專利範圍第26項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為真核細胞。
如申請專利範圍第27項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
一種製備申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或申請專利範圍第13至19項中任一項所述的雙特異性蛋白，或申請專利範圍第20至22項中任一項所述的GLP-1肽變體的方法，該方法包括：

培養申請專利範圍第26至28項中任一項所述的宿主細胞形成申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或申請專利範圍第13至19項中任一項所述的雙特異性蛋白，或申請專利範圍第20至22項中任一項所述的GLP-1肽變體，以及

從培養物回收該單株抗體或其抗原結合片段、或雙特異性蛋白、或GLP-1肽變體。
一種檢測樣本中人GCGR的試劑，其包含申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段。
一種降低受試者血糖濃度的方法，該方法包括：

向受試者施用治療有效量的申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或申請專利範圍第13至19項中任一項所述的雙特異性蛋白，或申請專利範圍第20至22項中任一項所述的GLP-1肽變體，或申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物。
如申請專利範圍第31項所述的方法，其中，該治療有效量為單位劑量中含有0.1至3000mg的申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或申請專利範圍第13至19項中任一項所述的雙特異性蛋白，或申請專利範圍第20至22項中任一項所述的GLP-1肽變體。
一種治療代謝障礙的方法，該方法包括：

向受試者施用治療有效量的申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GCGR的單株抗體或其抗原結合片段，或申請專利範圍第13至19項中任一項所述的雙特異性蛋白，或申請專利範圍第20至22項中任一項所述的GLP-1肽變體，或申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物。
如申請專利範圍第33項所述的方法，其中，該代謝障礙選自：代謝綜合症、肥胖症、葡萄糖耐量受損、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高滲綜合症、圍術期高血糖症、高胰島素血症、胰島素抵抗綜合症、空腹血糖受損、血脂異常、動脈粥樣硬化和糖尿病前期狀態。