CN102282166B - 胰高血糖素类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于促进体重减轻或防止体重增加以及用于糖尿病、代谢综合征和相关疾病治疗中的材料和方法。特别地，本发明提供了在这些方法中有效的新型胰高血糖素肽类似物。所述肽可通过具有与人胰高血糖素相比提高的针对GLP-1受体之选择性来介导其作用。

Description

胰高血糖素类似物
发明领域
本发明涉及胰高血糖素类似物及它们的医疗用途(例如在治疗食物摄取过量、肥胖症和超重中的医疗用途)。
发明背景
前胰高血糖素原(preproglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在组织中被差异性加工而形成多种结构上相关的胰高血糖素原(proglucagon)衍生肽，包括胰高血糖素(Glu)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(oxyntomodulin，OXM)。这些分子参与多种生理功能，包括葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空和肠生长以及食物摄取调节。
胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的53至81位氨基酸，并具有如下序列：His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO：1)。胃泌酸调节素(OXM)是37个氨基酸的肽，其包含胰高血糖素完整的29个氨基酸序列以及八肽羧基端延伸(前胰高血糖素原的82至89位氨基酸，其序列为Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(SEQ ID NO：2)，并称为“间插肽1(intervening peptide 1)”或IP-1；因此，人胃泌酸调节素的完整序列为His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(SEQ ID NO：3))。GLP-1的主要生物活性片段作为30个氨基酸的、对应于前胰高血糖素原之98至127位氨基酸的C端酰胺化肽而产生。
胰高血糖素通过结合肝细胞上的胰高血糖素受体来帮助维持血液中的葡萄糖水平，其通过糖原分解使肝释放以糖原形式储存的葡萄糖来实现。随着这些储存的耗尽，胰高血糖素刺激肝通过糖异生合成额外的葡萄糖。这些葡萄糖释放进血流中，从而防止低血糖症的发生。
OXM响应于食物摄入而释放到血液中，并与食物卡路里含量成比例。已显示OXM在人中抑制食欲并抑制食物摄取(Cohen等，Journal ofEndocrinology and Metabolism，88，4696-4701，2003；WO 2003/022304)。除了与GLP-1类似的那些食欲抑制作用以外，OXM一定还通过另一种机制影响体重，这是因为用胃泌酸调节素处理的大鼠与对饲(pair-fed)大鼠相比显示更轻的体重(Bloom，Endocrinology 2004，145，2687)。用OXM处理肥胖啮齿类动物还提高了它们的葡萄糖耐受(Parlevliet等，Am J PhysiolEndocrinol Metab，294，E142-7，2008)并抑制体重增加(WO 2003/022304)。
OXM活化胰高血糖素受体和GLP-1受体，其对胰高血糖素受体的效力比对GLP-1受体的效力高2倍，但比天然胰高血糖素和GLP-1对它们各自受体的效力低。胰高血糖素也能活化两种受体，但相对于GLP-1受体来说对胰高血糖素受体有强偏好性。另一方面，GLP-1不能活化胰高血糖素受体。胃泌酸调节素的作用机制尚不完全清楚。尤其是，不了解激素作用是仅通过胰高血糖素受体和GLP-1受体介导，还是通过一种或多种尚未鉴定出的受体介导。
已显示另一些肽结合并活化胰高血糖素受体和GLP-1受体(Hjort等，Journal of Biological Chemistry，269，30121-30124)以及抑制体重增加和减少食物摄取(WO 2006/134340；WO 2007/100535；WO 2008/101017)。
肥胖症被认为是日益增多的全球性健康问题，并且其与多种疾病(特别是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、某些类型的癌症和骨关节炎)相关。因此，已发现肥胖症减少预期寿命。根据世界卫生组织所作的2005预测，全球有4亿成年人(年龄＞15岁)被划归为肥胖。在美国，目前认为肥胖症是仅次于吸烟的可预防性死亡之第二大原因。
肥胖症的增多导致糖尿病的增多，约90％的患2型糖尿病的人群可划归为肥胖。全球有2亿4千6百万人患有糖尿病，预计到2025年将会有3亿8千万人患糖尿病。许多人还有另外的心血管风险因素，包括高/异常LDL和甘油三酯以及低HDL。
与未患糖尿病的人相比，患有糖尿病的人发生心血管疾病的可能性为前者的2至4倍，使其成为最常见的糖尿病并发症。在患有糖尿病的人中，心血管疾病导致约50％的死亡。与未患糖尿病的年轻成年人相比，患有糖尿病的年轻成年人患冠心病(CHD)的几率高12～40倍并极易发生和流行肥胖症和2型糖尿病，这些代谢疾病相关的发病率和死亡率突显了对有效治疗选择的医疗需要。
因此，非常需要通过医疗手段治疗肥胖症和提高葡萄糖耐受。
发明概述
本发明提供了具有式R1-X-Z-R2的化合物或其可药用盐，其中：
R1为H、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2为OH或NH2；
X为具有式I的肽：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Leu-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Glu-Ser-Ala(SEQ ID NO：4)
或在至多4个的以下位置处与式I不同；如果与式I不同，则：
第2位残基选自：Aib、D-Ser；
第16位残基选自：Arg、His、Lys、Glu、Gly、Asp；
第17位残基选自：Lys、Leu；
第18位残基选自：Lys、His、Ala、Ser、Tyr；
第20位残基选自：Gln、His、Arg、Glu、Asp；
第21位的残基为Glu；
第23位残基选自：Val、Leu；
第24位残基选自：Gln、Leu、Ala、Lys、Arg、Asp；
第27位残基选自：Met、Cys、Lys、Arg、Leu；
第28位残基选自：Asn、Arg、Lys、Glu、Ala、Leu、Asp；以及
第29位残基选自：Thr、Glu、Lys；
并且Z不存在或者为具有1～20个选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn之氨基酸单元的肽序列。
在一些实施方案中，X在至多4个的以下位置处与式I不同；如果与式I不同，则：
第2位残基选自：Aib、D-Ser；
第16位残基选自：Arg、His、Lys、Glu、Gly；
第17位残基选自：Lys、Leu；
第18位残基选自：Lys、His、Ala、Ser、Tyr；
第23位残基选自：Val、Leu；
第27位残基选自：Met、Cys、Lys、Arg、Leu；
第28位残基选自：Asn、Arg、Lys、Glu、Ala、Leu；以及
第29位残基选自：Thr、Glu、Lys。
在一些实施方案中，X在至多4个的以下位置处与式I不同；如果与式I不同，则：
第2位残基选自：Aib、D-Ser；
第16位残基选自：Arg、His、Lys、Glu、Gly；
第17位残基选自：Lys、Leu；
第18位残基选自：Lys、His、Ala、Ser、Tyr；以及
第23位残基选自：Val、Leu。
在一些实施方案中，X在至多4个的以下位置处与式I不同；如果与式I不同，则：
第2位残基选自：Aib、D-Ser；
第23位残基选自：Val、Leu；
第27位残基选自：Met、Cys、Lys、Arg、Leu；
第28位残基选自：Asn、Arg、Lys、Glu、Ala、Leu；以及
第29位残基选自：Thr、Glu、Lys。
在与上述定义保持一致的同时，可期望X包含以下的一个或多个残基组：
20-Lys，24-Glu；
20-Lys，24-Glu，29-Ala；
20-Lys，23-Ile，24-Glu；
27-Glu，28-Ser，2g-Ala；
29-Ala；
20-Gln；
23-Val；
24-Gln；
29-Thr；
27-Met，28-Asn，29-Thr；
20-Gln，23-Val，24-Gln；
20-Glu，24-Lys；或
28-Arg.
例如，X可具有以下序列：
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFIEWLESA(SEQ ID NO：5)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFVEWLESA(SEQ ID NO：6)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIQWLESA(SEQ ID NO：7)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLEST(SEQ ID NO：8)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLMNT(SEQ ID NO：9)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFVQWLESA(SEQ ID NO：10)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAEDFIKWLESA(SEQ ID NO：11)；或
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLERA(SEQ ID NO：12).
本发明还提供了编码本发明化合物的核酸(其可为DNA或RNA)、包含该核酸的表达载体以及包含该核酸或表达载体的宿主细胞。
在另一方面中，本发明提供了一种组合物，其包含与载体混合的本文定义之胰高血糖素肽类似物或者其盐或衍生物、编码该胰高血糖素肽类似物的核酸、包含该核酸的表达载体或包含该核酸或表达载体的宿主细胞。在一些优选的实施方案中，所述组合物为可药用组合物并且所述载体为可药用载体。胰高血糖素肽类似物可以是胰高血糖素类似物的可药用酸加成盐。
所述化合物用于防止体重增加或促进体重减轻。“防止”是指与不进行治疗相比抑制或减少体重增加，而不必然指体重增加的完全停止。所述肽可引起食物摄取的减少和/或能量消耗的增加，从而导致对体重的可见作用。不依赖于其对体重的作用，本发明化合物可对葡萄糖耐受和循环胆固醇水平具有有益作用(能降低循环LDL水平并提高HDL/LDL比值)。因此，本发明化合物可用于直接或间接治疗由体重超重引起或以其为特征的任何病症，例如治疗和/或预防肥胖症、病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病、肥胖引起的睡眠呼吸暂停。本发明化合物还可用于治疗代谢综合征、胰岛素抗性、葡萄糖不耐受、2型糖尿病、高血压、致动脉粥样化血脂异常(atherogenicdyslipidimia)、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病或中风。它们在这些病症中的作用可由它们对体重的作用引起或与其有关，或者可不依赖于其对体重的作用。
因此，本发明提供了本发明化合物治疗有此需要之个体中上述病症的用途。
本发明还提供了用于医学治疗方法中的本发明化合物，特别是用于治疗上述病症的方法中的本发明化合物。
本发明还提供了本发明化合物在制备用于治疗上述病症之药物中的用途。
如所述地，本发明还包括含有上述核酸序列(任选地与指导其表达的序列相组合)的表达载体以及包含所述表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞能表达并分泌本发明化合物。在又一方面中，本发明提供了产生所述化合物的方法，该方法包括在适于所述化合物表达的条件下培养所述宿主细胞并纯化由此产生的化合物。
本发明还提供了用于医学治疗方法中的本发明之核酸、本发明之表达载体或能表达和分泌本发明化合物的宿主细胞。应理解，所述核酸、表达载体和宿主细胞可用于治疗上述可使用所述化合物本身治疗的任何疾病。因此，除非上下文中另外指出，涉及包含本发明化合物的治疗组合物、本发明化合物的施用或其任何治疗用途的内容应解释为涵盖本发明核酸、表达载体或宿主细胞的等同用途。
附图说明
图1.ZP2653(SEQ ID NO：4)对db/db小鼠口服葡萄糖耐受的作用。
db/db小鼠被禁食过夜并在即将要施用(腹膜内)运载体(vehicle)或ZP2653(SEQ ID NO：4)(45nmol/l)之前采集初始血样(禁食血液葡萄糖水平)。15分钟后给与口服剂量的葡萄糖(5ml/kg中的1g/kg)，并在t＝30分钟、t＝60分钟、t＝120分钟和t＝240分钟时测量血液葡萄糖(bloodglucose，BG)水平。针对每个时间点计算与基线(t＝0)的差异，并测定AUC0-240分钟值。ZP2653(SEQ ID NO：4)显著提高糖尿病db/db小鼠的葡萄糖耐受。
图2.用ZP2653(SEQ ID NO：4)处理28天对饮食诱导肥胖(diet inducedobese，DIO)小鼠的体重的作用。
用高脂饮食(high fat diet，HFD)饲喂C57Bl/6雄性小鼠并用ZP2653(SEQID NO：4)(500nmol/kg)(ZP2653(SEQ ID NO：4))或运载体处理(每日两次；皮下)。按照与DIO组相同的治疗方案用运载体(鼠食)处理饲喂常规鼠食的非肥胖对照组。每天记录体重，并利用其在整个研究中施用经体重修正之剂量的肽。与运载体-PBS相比，ZP2653(SEQ ID NO：4)将所增加体重显著降低至与用鼠食饲喂组中所观察到的相似水平。
图3.用GluGLP-1双效激动剂处理DIO小鼠4周(每日两次)对LDL胆固醇浓度的作用。用于OXM、exendin-4和ZP2653(SEQ ID NO：4)的运载体为PBS(pH 7.4)。与运载体相比，OXM(P＝0.002)和ZP2653(SEQID NO：4)(P＝0.019)的作用显著。
图4.用GluGLP-1双效激动剂处理DIO小鼠4周(每日两次)对HDL/LDL比值的作用。用于OXM、exendin-4和ZP2653(SEQ ID NO：4)的运载体为PBS(pH 7.4)。与运载体相比，OXM(P＝0.004)和ZP2653(SEQID NO：4)(P＝0.026)的作用显著。
发明详述
在本说明书通篇中，采用常规的单字母和三字母编码天然氨基酸，并采用通常接受的三字母编码其它氨基酸(如Aib(α-氨基异丁酸)、Orn(鸟氨酸)、Dbu(2，4-二氨基丁酸)和Dpr(2，3-二氨基丙酸))。
术语“本源(native)胰高血糖素”是指具有如下序列的人本源胰高血糖素H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO：1)。
术语“胃泌酸调节素”和“OXM”是指具有如下序列的人本源胃泌酸调节素：H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH(SEQ ID NO：3)。
本发明提供了上述化合物。为了避免疑义，在本文提供的定义中，X的序列通常仅在所示允许变化的位置处与式I有差异。可认为序列X中的氨基酸以常规的N端到C端方向从1至29位连续编号。因此，应对X中的“位置”作相应的解释，如同应对人本源胰高血糖素和其它分子中的位置作相应解释一样。
本发明化合物可在肽序列X中具有一个或多个分子内桥。每个这样的桥在X的两个氨基酸残基的侧链之间形成，所述两个氨基酸残基通常被X线性序列中三个氨基酸所间隔(即，在氨基酸A和氨基酸A+4之间形成)。
更特别地，所述桥可在残基对16和20、17和21、20和24或者24和28的侧链之间形成。两个侧链可通过离子相互作用或通过共价键彼此连接。因此，这些残基对可包含带相反电荷的侧链从而通过离子相互作用形成盐桥。例如，一个残基可以是Glu或Asp，另一残基可以是Lys或Arg。Lys与Glu配对以及Lys与Asp配对还能够反应形成内酰胺环。同样地，Tyr与Glu或者Tyr与Asp能形成内酯环。
特别地，第20和24位残基可以允许形成分子内桥。在这些位置合适的残基对的实例包括：
20-Asp，24-Lys；
20-Glu，24-Lys；
20-Asp，24-Arg；
20-Glu，24-Arg；
20-Lys，24-Asp；
20-Arg，24-Asp；
20-Lys，24-Glu；和
20-Arg，24-Glu.
不希望受到任何特定理论的约束，认为这种分子内桥稳定了分子的α螺旋结构并因而提高了针对GLP-1受体以及可能的胰高血糖素受体的效力和/或选择性。
第12位Leu的存在提高了针对GLP-1受体的效力和/或选择性。
在第23位替换(例如，替换为Ile)可提高针对GLP-1受体的效力和/或选择性。
在第24位替换(例如，替换为Glu)也可提高针对GLP-1受体的效力和/或选择性。
不希望受任何特定理论的约束，本源胰高血糖素的第17和18位精氨酸残基似乎提供了针对胰高血糖素受体的显著选择性。在这些位置中的一个或多个位置进行多种替换可提高针对GLP-1受体的效力和/或选择性。第17位的Lys或Leu可提高针对胰高血糖素受体的效力。Lys可为特别有效的，尤其是当第21位具有负电荷残基(如Asp)时，这是由于形成分子内桥的潜力所致。第18位疏水性残基(例如Ala)可提高针对GLP-1受体和胰高血糖素受体两者的效力，尽管该位置的另一些变化(例如，Lys、His、Ser或Tyr)可具有类似的作用。
不希望受任何特定理论的约束，本源胰高血糖素的第27、28和29位残基似乎提供了针对胰高血糖素受体的显著选择性。在本源胰高血糖素这些位置中的1个、2个或所有这3个位置进行替换可提高针对GLP-1受体的效力和/或选择性，并可能不显著降低针对胰高血糖素受体的效力。特别的实例包括第27位的Glu、第28位的Ser和第29位的Ala。
对第27位天然存在的Met进行替换(例如用Leu、Lys或Glu进行替换)还降低氧化的潜力，从而提高化合物的化学稳定性。
对第28位天然存在的Asn进行替换(例如用Arg、Lys、Glu、Ala、Ser或Leu进行替换)还降低在酸溶液中脱酰胺基的潜力，从而提高化合物的化学稳定性。
还可通过引入可能形成两亲性螺旋结构并且可能不会显著降低针对胰高血糖素受体之效力的残基来提高针对GLP-1受体的效力和/或选择性。这可通过在第16、20、24和28位中的一个或多个位置引入带电荷残基来实现。因此，第20和24位残基可全部带电荷，第20、24和28位残基可全部带电荷，或者第16、20、24和28位残基可全部带电荷。例如，第20位残基可以是Lys、His、Arg或Glu。第24位残基可以是Glu、Lys或Arg。第28位残基可以是Arg、Lys或Glu。例如，化合物可在第20和24两个位置独立地为Lys或Glu，并且还可在第28位为Ser或Arg。
在第20和24位中的1个或2个位置用天然存在的残基Gln替换还降低在酸溶液中脱酰胺基的潜力，从而提高化合物的化学稳定性。
所述化合物可包含1～20个氨基酸的C端肽序列Z，例如用以稳定胰高血糖素肽类似物的构型和/或二级结构，和/或用以使胰高血糖素肽类似物对酶水解更具抗性，例如，WO99/46283中所述。
当存在时，Z代表1～20个氨基酸残基(例如，1～15个氨基酸残基，更优选地1～10个氨基酸残基，特别地1～7个氨基酸残基(例如1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基))的肽序列。肽序列Z中的每个氨基酸残基可独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu(2，4二氨基丁酸)、Dpr(2，3-二氨基丙酸)和Orn(鸟氨酸)。优选地，所述氨基酸残基选自Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn，更优选地可仅选自Glu、Lys和Cys。上述氨基酸可具有D或L构型，但优选具有L构型。特别优选的序列Z为4、5、6或7个连续的赖氨酸残基(即Lys3、Lys4、Lys5、Lys6或Lys7)，特别是5或6个连续的赖氨酸残基。Z序列的另一些实例示于WO 01/04156中。或者，序列Z的C端残基可以是Cys残基。这可有助于化合物的修饰(例如PEG化)。在这些实施方案中，序列Z的长度可例如仅为1个氨基酸(即Z＝Cys)或者可为2、3、4、5、6或更多个氨基酸。因此，其它氨基酸作为肽X和末端Cys残基之间的间隔物。
肽序列Z与人OXM IP-1部分的对应序列(其具有序列Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala)具有不高于25％的序列同一性。
相对于另一多肽序列(例如，IP-1)，给定肽或多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”计算为：当将两者彼此比对时(适当时可引入空位以进行最佳比对)，给定肽序列中与另一多肽对应序列中相应氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。同一性百分比的值可通过WU-BLAST-2确定(Altschul等，Methods in Enzymology，266：460-480(1996))。WU-BLAST-2采用若干检索参数，其中大部分设置为缺省值。可调整参数设置为如下值：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字阈值(word threshold)(T)＝11。氨基酸序列同一性百分比的值通过将由WU-BLAST-2确定的匹配的一致残基数除以参照序列的残基总数(忽略由WU-BLAST-2引入参照序列以使比对值最大化的空位)再乘以100而确定。
因此，当将Z与IP-1的8个氨基酸进行最佳比对时，其具有不超过2个与IP-1之对应氨基酸一致的氨基酸。
本发明化合物中的一个或多个氨基酸侧链可与亲脂取代基缀合。所述亲脂取代基可共价键合至氨基酸侧链的原子，或者可通过间隔物缀合至氨基酸侧链。
不希望受理论的约束，认为亲脂取代基结合血流中的白蛋白，从而保护本发明化合物免受酶降解，这可增强化合物的半衰期。所述间隔物(当存在时)用于在所述化合物和所述亲脂取代基之间提供间隔。
亲脂取代基可通过酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺与氨基酸侧链或间隔物连接。因此，应理解，优选的亲脂取代基包括酰基，磺酰基，形成酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺之一部分的N原子、O原子或S原子。优选地，亲脂取代基中的酰基与氨基酸侧链或间隔物形成酰胺或酯的一部分。
亲脂取代基可包含具有4至30个碳原子的烃链。优选地，它具有至少8或12个C原子，优选地它具有24个或更少的C原子，或者20个或更少的C原子。烃链可以是线性的或分支的，并且可以是饱和的或不饱和的。应理解，烃链优选地被这样的部分所取代，所述部分形成与氨基酸侧链或间隔物的连接，例如酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子。最优选地，所述烃链被酰基取代，因而烃链可以是烷酰基(例如棕榈酰基、己酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或硬酯酰基)的一部分。
因此，所述亲脂取代基可具有下式：
A可以是例如酰基、磺酰基、NH、N-烷基、O原子或S原子，优选地为酰基。n为3至29的整数，优选地至少为7或至少为11，优选地为23或更少，更优选地为19或更少。
所述烃链可进一步被取代。例如，其可被至多3个选自NH2、OH和COOH的取代基进一步取代。如果烃链被进一步取代，优选地其仅被一个取代基进一步取代。作为替代地或另外地，烃链可包含环烷烃或杂环烷烃，例如以下所示：
优选地，所述环烷烃或杂环烷烃为六元环。最优选地，其为哌啶。
或者，亲脂取代基可基于环戊烷化菲骨架，其可为部分或完全不饱和的或者饱和的。骨架中的每个碳原子可被Me或OH取代。例如，所述亲脂取代基可以是胆酰基(cholyl)、脱氧胆酰基或石胆酰基(lithocholyl)。
如上所述，亲脂取代基可通过间隔物缀合至氨基酸侧链。当存在时，间隔物连接至亲脂取代基和氨基酸侧链。间隔物可独立地通过酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺与亲脂取代基和氨基酸侧链连接。因此，其可包含独立地选自酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子的两个部分。所述间隔物可具有式：
其中B和D各自独立地选自酰基、磺酰基、NH、N-烷基、O原子或S原子，优选地选自酰基和NH。优选地，n为1至10的整数，优选地为1至5的整数。所述间隔物还可被一个或多个选自以下的取代基进一步取代：C1-6烷基、C0-6烷基胺、C0-6烷基羟基和C0-6烷基羧基。
或者，间隔物可具有两个或更多个上式的重复单元。对于每个重复单元，B、D和n各自独立地选择。相邻的重复单元可通过其各自的B和D部分彼此共价连接。例如，相邻重复单元的B和D部分可一起形成酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺。间隔物各端的游离B和D单元如上所述地连接至氨基酸侧链和亲脂取代基。
优选地，所述间隔物具有5个或更少的、4个或更少的或者3个或更少的重复单元。最优选地，所述间隔物具有2个重复单元，或者为单个单元。
所述间隔物(或者间隔物的一个或多个重复单元，如果其具有重复单元的话)可以是例如天然或非天然氨基酸。应理解，对于具有官能化侧链的氨基酸，B和/或D可以是氨基酸侧链中的一部分。所述间隔物可以是天然或非天然的氨基酸。例如，间隔物(或者间隔物的一个或多个重复单元，如果其具有重复单元的话)可以是Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、α-Glu、γ-Glu、Asp、Ser、Thr、Gaba、Aib、β-Ala、5-氨基戊酰基、6-氨基己酰基、7-氨基庚酰基、8-氨基辛酰基、9-氨基壬酰基或10-氨基癸酰基。
例如，所述间隔物可以是选自γ-Glu、Gaba、b-Ala和α-Gly的单个氨基酸。
所述亲脂取代基可缀合至本发明化合物的任何氨基酸侧链。优选地，所述氨基酸侧链包括羧基、羟基、硫醇基、酰胺或胺基，用以与所述间隔物或亲脂取代基形成酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺。例如，所述亲脂取代基可缀合至Asn、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Ser、Thr、Tyr、Trp、Cys或Dbu、Dpr或Orn。优选地，所述亲脂取代基缀合至Lys。然而，在本文提供的式中显示为Lys的任何氨基酸可在加入亲脂取代基处被Dbu、Dpr或Orn替换。
亲脂取代基和间隔物的实例在下式中显示：
本文中，来自本发明化合物的Lys通过酰胺部分与γ-Glu(间隔物)共价连接。棕榈酰基通过酰胺部分与γ-Glu间隔物共价连接。
作为替代地或另外地，本发明化合物的一个或多个氨基酸侧链可缀合至聚合部分，例如，用以提高溶解性和/或体内(例如，血清中)半衰期和/或生物利用度。还已知这样的修饰降低治疗性蛋白质和肽的清除率(例如，肾清除率)。
所述聚合部分优选为水溶性(两亲或亲水的)、无毒以及药用惰性的。合适的聚合部分包括聚乙二醇(PEG)、PEG的同聚物或共聚物、PEG的单甲基取代聚合物(mPEG)或聚氧乙烯甘油(POG)。例如参见Int.J.Hematology 68：1(1998)；Bioconjugate Chem.6：150(1995)以及Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Sys.9：249(1992)。
其它合适的聚合物部分包括聚氨基酸，如聚赖氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸(参见例如Gombotz等，(1995)，Bioconjugate Chem.，卷6：332-351；Hudecz等，(1992)，Bioconjugate Chem.，卷3，49-57；Tsukada等.(1984)，J.Natl.Cancer Inst.，卷73：721-729；以及Pratesi等(1985)，Br.J.Cancer，卷52：841-848)。
聚合物部分可以是直链的或分支的。其可具有500～40,000Da的分子量，例如500～10,000Da、1000～5000Da、10,000～20,000Da或20,000～40,000Da。
化合物可包含两个或更多个这样的部分，在这种情况下所有这些部分的总分子量通常落在以上提供的范围内。
聚合部分可偶联(或共价连接)至氨基酸侧链的氨基、羧基或硫醇基。优选的实例为Cys残基的硫醇基和Lys残基的ε-氨基，并且还可使用Asp和Glu残基的羧基。
本领域技术人员会了解可用于实施偶联反应的合适技术。例如，可采用从Nektar Therapeutics AL购得的试剂通过马来酰亚胺基连接将具有甲氧基的PEG部分偶联至Cys的硫醇基。还参见WO 2008/101017以及上述针对合适化学性质的细节所引用的参考文献。
肽合成
本发明化合物可通过标准合成方法、重组表达系统或任何其它本领域的方法制备。因此，胰高血糖素类似物可以多种方式合成，包括例如以下方法：
(a)采用固相法或液相法逐步或通过片段组装来合成肽，并分离和纯化最终肽产物；
(b)在宿主细胞中表达编码肽的核酸构建体，并从宿主细胞培养物中回收表达产物；或
(c)无细胞体外表达编码肽的核酸构建体，并回收表达产物；
或将方法(a)、(b)和(c)组合以获得肽片段，随后连接所述片段以获得肽，并回收所述肽。
优选地，通过固相或液相肽合成来合成本发明的类似物。在这种情况下，参照WO 98/11125；Fields，GB等，2002，“Principles and practice ofsolid-phase peptide synthesis”.In：Synthetic Peptides(第二版)以及本文的实施例等。
对于重组表达而言，通常将本发明的核酸片段插入适合的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆或表达载体；这些新的载体也是本发明的一部分。根据应用目的和类型，所述载体可采用质粒、噬菌体、粘粒、微小染色体或病毒形式，同时只在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也是重要的载体。本发明优选的克隆和表达载体(质粒载体)能自主复制，从而能产生高拷贝数以实现高水平表达或高水平复制用于随后的克隆。
一般地，表达载体包含5’→3’方向并有效连接的以下特征：驱动本发明核酸片段表达的启动子、任选地编码能进行分泌(至细胞外相，或适当时至周质)之前导肽的核酸序列、编码本发明肽的核酸片段以及任选地编码终止子的核酸序列。它们可包含另外的特征，如选择标记和复制起点。当操作生产菌株或细胞系中的表达载体时，优选地所述载体能整合入宿主细胞基因组。本领域技术人员非常熟悉合适的载体并能根据他们的具体需求来设计载体。
使用本发明的载体转化宿主细胞来产生本发明化合物。这些转化细胞(其也是本发明的一部分)可以是用于扩增本发明核酸片段和载体或者用于重组产生本发明肽的培养细胞或细胞系。
本发明优选的转化细胞是微生物如细菌(例如埃希氏菌属(Escherichia)物种(如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacillus)物种(如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、沙门氏菌属(Salmonella)物种或分枝杆菌属(Mycobacterium)物种(优选非致病性的，如牛分枝杆菌(M.bovis)BCG))、酵母(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和原生动物。或者，所述转化细胞可来自多细胞生物，即可以是真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。为了克隆和/或优化表达，优选地所述转化细胞能复制本发明核酸片段。表达所述核酸片段的细胞可用于本发明的实施方案中；它们可用于小规模或大规模制备本发明的肽。
当利用转化细胞生产本发明的肽时，尽管并非必要地，但将表达产物分泌至培养基是有利的。
效力
相关化合物与GLP-1受体或胰高血糖素(Glu)受体的结合可用作激动剂活性的指示，但一般情况下优选使用生物测定，所述生物测定测量由化合物结合至相关受体所产生的细胞内信号传导。例如，胰高血糖素激动剂活化胰高血糖素受体会刺激细胞环磷酸腺苷(cAMP)形成。类似地，GLP-1激动剂活化GLP-1受体会刺激细胞cAMP形成。因此，cAMP在表达这两种受体之一的适当细胞中产生可用于监测相关受体活性。因而，使用一对合适的细胞类型(每种细胞类型表达一种受体而不表达另一种受体)可用于确定激动剂对两种类型受体的活性。
本领域技术人员知晓合适的测定形式，并且以下提供了实例。GLP-1受体和/或胰高血糖素受体可具有实施例中所述的受体序列。例如，测定可使用具有初始登记号GI：4503947的人胰高血糖素受体(胰高血糖素-R)和/或具有初始登记号GI：166795283的人胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)(当涉及前体蛋白质的序列时，显然应当理解为测定可使用不含信号序列的成熟蛋白质)。
可使用EC50值作为激动剂对给定受体效力的数值量度。EC50值是在特定测定中实现化合物最大活性一半时所需的该化合物浓度的测量值。因此，例如，在特定测定中，EC50[GLP-1R]比本源胰高血糖素之EC50[GLP-1R]更低的化合物可被认为与胰高血糖素相比具有更高的针对GLP-1R之效力。
本说明书中所述的化合物通常为Glu-GLP-1双效激动剂(dual agonist)，即它们针对胰高血糖素受体和GLP-1受体两者均能刺激cAMP形成。可在独立的测定中测量每种受体的激活，而后彼此进行比较。
通过将给定化合物针对胰高血糖素受体的EC50值(EC50[胰高血糖素-R])与针对GLP-1受体的EC50值(EC50[GLP-1R])相比较，可得出该化合物的相对胰高血糖素选择性(％)：
相对胰高血糖素-R选择性[化合物]＝(1/EC50[胰高血糖素-R]×100/(1/EC50[胰高血糖素-R]+1/EC50[GLP-1R]))
同样地，可得出相对GLP-1R选择性：
相对GLP-1R选择性[化合物]＝(1/EC50[GLP-1R]×100/(1/EC50[胰高血糖素-R]+1/EC50[GLP-1R]))
利用化合物的相对选择性能将其对GLP-1或胰高血糖素受体的作用与其对另一受体的作用直接比较。例如，化合物的相对GLP-1R选择性越高，化合物对GLP-1受体比对胰高血糖素受体则更有效。
使用下述测定，我们发现人胰高血糖素的相对GLP-1选择性约为5％。
与人胰高血糖素相比，本发明化合物具有更高的相对GLP-1R选择性。因此，对于特定水平的胰高血糖素-R激动剂活性来说，所述化合物表现出与胰高血糖素相比更高水平的GLP-1R激动剂活性(即对GLP-1受体效力更高)。应理解，只要实现合适的相对GLP-1R选择性，则特定化合物对胰高血糖素受体和GLP-1受体的绝对效力与人本源胰高血糖素相比可以更高、更低或大致相等。
然而，本发明化合物与人胰高血糖素相比可具有更低的EC50[GLP-1R]。所述化合物与胰高血糖素相比可具有更低的EC50[GLP-1R]同时保持其EC50[胰高血糖素-R]与人胰高血糖素的相比高出小于10倍、高出小于5倍或高出小于2倍。
本发明化合物的EC50[胰高血糖素-R]可以小于人胰高血糖素之EC50[胰高血糖素-R]的两倍。所述化合物的EC50[胰高血糖素-R]可以小于人胰高血糖素之EC50[胰高血糖素-R]的两倍，并且其EC50[GLP-1R]小于人胰高血糖素EC50[GLP-1R]的一半，小于人胰高血糖素EC50[GLP-1R]的五分之一，或小于人胰高血糖素EC50[GLP-1R]的十分之一。
化合物的相对GLP-1选择性可以为5％～95％。例如，所述化合物的相对选择性可以为5～20％、10～30％、20～50％、30～70％或50～80％；或者为30～50％、40～60％、50～70％或75～95％。
治疗用途
本发明化合物可为肥胖症和代谢疾病(包括2型糖尿病)提供具有吸引力的治疗选择。
糖尿病是一种代谢异常综合征，其通常由遗传和环境因素联合导致，引起异常高的血糖水平(高血糖)。
血液葡萄糖水平由胰腺β细胞产生的激素胰岛素控制。糖尿病由于产生胰岛素的胰腺β细胞破坏(1型糖尿病)或对胰岛素的作用产生抗性(妊娠期糖尿病)而后β细胞损失(2型糖尿病)而发生。两种类型的糖尿病均导致高血糖，其主要引起糖尿病的急性症状：尿过量产生、作为结果的代偿性口渴和流体摄取增多、视力模糊、原因不明的体重减轻、嗜睡和能量代谢的改变。
代谢综合征表征为一个人中的一组代谢风险因素。它们包括腹部肥胖(腹部内部器官周围堆积过多脂肪组织)、致动脉粥样化血脂异常(血脂异常包括高甘油三酯、低HDL胆固醇和/或高LDL胆固醇，其促使斑块在动脉壁中产生)、血压升高(高血压)、胰岛素抗性和葡萄糖不耐受、血栓前状态(例如血液中存在高纤维蛋白原或纤溶酶原活化剂抑制因子-1)和促炎症状态(例如血液中C反应蛋白升高)。
患有代谢综合征的个体患2型糖尿病以及冠心病以及与动脉壁上斑块产生相关的其它疾病(例如，中风和外周血管疾病)的风险增加。该综合征的主要潜在风险因素表现为腹部肥胖和胰岛素抗性和葡萄糖不耐受、血栓前状态(例如血液中存在高纤维蛋白原或纤溶酶原活化剂抑制因子-1)和促炎症状态(例如血液中C反应蛋白升高)。
不希望受任何特定理论的约束，认为本发明化合物作为GluGLP-1双效激动剂起作用。双效激动剂结合了胰高血糖素对脂肪代谢的作用以及GLP-1对血液葡萄糖水平和食物摄取的作用。因此，它们可以协同方式加速消除过量的脂肪堆积、诱导可持续的体重减轻以及直接将病态葡萄糖水平降至正常水平，而没有低血糖的风险(这与GLP-1激动剂和磺酰脲的伴随使用有关)。
GluGLP-1双效激动剂的协同作用还导致心血管风险因素(如高胆固醇和LDL)的降低以及葡萄糖耐受的提高，这可能完全不依赖于它们对体重的作用。
因此，本发明化合物可用作用于防止体重增加、促进体重减轻、减少多余体重或治疗肥胖症(例如通过控制食欲、进食、食物摄取、卡路里摄取和/或能量消耗)的药剂，包括病态肥胖以及相关疾病和健康病症，包括但不限于肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病和肥胖诱导的睡眠呼吸暂停。本发明化合物还可用于治疗代谢综合征、胰岛素抗性、葡萄糖不耐受、2型糖尿病、高血压、致动脉粥样化血脂异常、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病和中风。这些都是可与肥胖症相关联的病症。然而，本发明化合物对这些病症的作用可完全或部分地由对体重的作用所介导，或者可不依赖于对体重的作用。
药物组合物
本发明的化合物或其盐可配制成用于保存或施用的药物组合物，所述药物组合物通常在可药用载体中包含治疗有效量的本发明化合物或其盐。
本发明化合物的治疗有效量取决于施用途径、接受治疗的哺乳动物类型以及所考虑的具体哺乳动物的身体特征。确定该量的这些因素及其关系是医药领域技术人员所熟知的。可调整该量和施用方法以实现最佳效力，并且可取决于医药领域技术人员熟知的因素例如体重、饮食、同时用药情况(concurrent medication)及其它因素。人用最适剂量大小和给药方案可参考本发明所获得的结果，并可利用适当设计的临床试验中加以验证。
可通过常规方法确定有效剂量和治疗方案，一开始在实验室动物中使用低剂量，而后提高剂量同时监测效果，并且也系统地改变给药方案。当确定针对给定对象的最佳剂量时医师可考虑多种因素。这些因素是本领域技术人员已知的。
术语“可药用载体”包括任何标准药用载体。用于治疗用途的可药用载体是药学领域公知的，并描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编，1985)中。例如，可使用弱酸性或生理pH下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐溶液。pH缓冲剂可以是磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(其是优选的缓冲剂)、精氨酸、赖氨酸或醋酸盐，或者其混合物。该术语还涵盖在美国药典中所列的用于动物(包括人)的任何试剂。
术语“可药用盐”是指所述化合物的盐。盐包括可药用盐例如酸加成盐和碱式盐。酸加成盐的实例包括盐酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐。碱式盐的实例包括阳离子选自以下的盐：碱金属(如钠和钾)、碱土金属(如钙)和铵离子+N(R3)3(R4)(其中R3和R4独立地表示任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基，任选取代的芳基或任选取代的杂芳基)。其它可药用盐的实例描述于“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，17版，Alfonso R.Gennaro(编)，Mark Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985中以及更新的版本以及Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology中。
“治疗”是用于获得有益或期望之临床结果的方法。为本发明目的，有益或期望之临床结果(无论是可检出或不可检出的)包括但不限于：缓解症状、减轻疾病程度、稳定疾病状态(即不进一步恶化)、延后或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及(部分或全部地)消除疾病(remission)。“治疗”还可指与未接受治疗时的预期存活相比延长存活期。“治疗”是以防止疾病发生或改变疾病进展为目的而进行的介入。因此，“治疗”指治疗性处理以及预防性手段。需要治疗的对象包括已患病和待预防疾病的对象。
药物组合物可采用单位剂型。在该形式中，组合物被分成包含合适量活性组分的单位剂量。所述单位剂型可以为经包装的制剂，所述包装包含独立量的制剂，例如，盒装片剂、胶囊剂以及小瓶或安瓿瓶中的粉末剂。单位剂型还可本身为胶囊剂、扁囊剂或片剂，或者可以为合适数目的任何这些经包装形式。其可以单剂量注射剂型提供，例如采用注射笔(pen)的形式。可将组合物配置成适于任何合适的施用途径和手段。可药用载体或稀释剂包括适用于口服、经直肠、经鼻、局部(包括含服和舌下)、经阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内和透皮)施用的制剂中使用的那些。可方便地将制剂以单位剂型提供，并可通过药学领域公知的任何方法来制备。
皮下或透皮施用模式可对本文所述化合物尤其适用。
联合治疗
本发明化合物可作为联合治疗的一部分与治疗糖尿病、肥胖症或高血压的药剂一起施用。
在这种情况下，可同时或分别给与两种活性药剂，所述两种活性药剂作为同一药物制剂的部分或者作为分别的制剂。
因此，本发明化合物(或其盐)可与抗糖尿病药剂(包括但不限于二甲双胍、磺酰脲、格列奈类(glinide)、DPP-IV抑制剂、格列酮(glitazone)或胰岛素)联合使用。在一个优选的实施方案中，所述化合物或其盐与胰岛素、DPP-IV抑制剂、磺酰脲或二甲双胍(特别是磺酰脲或二甲双胍)联用以实现充分的血糖控制。在一个更加优选的实施方案中，所述化合物或其盐与胰岛素或胰岛素类似物联用以实现充分的血糖控制。胰岛素类似物的实例包括但不限于Lantus、Novorapid、Humalog、Novomix和Actraphane HM。
所述化合物或其盐还可与抗肥胖剂联用，所述抗肥胖剂包括但不限于胰高血糖素样肽受体1激动剂、肽YY或其类似物、大麻素受体1拮抗剂、脂肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素集中激素(melaninconcentrating hormone)受体1拮抗剂。
所述化合物类似物或其盐可与抗高血压剂联用，所述抗高血压剂包括但不限于血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、利尿剂、β-阻断剂或钙通道阻断剂。
方法
胰高血糖素类似物的一般合成
应用微波辅助合成仪、采用标准的Fmoc策略、利用聚苯乙烯树脂(TentaGel S Ram)、在NMP中进行固相肽合成(solid phase peptidesynthesis，SPPS)。用HATU作为偶联剂，DIPEA作为基质。用哌啶(20％，在NMP中)进行去保护。适当时，使用假脯氨酸：Fmoc-Phe-Thr(.Psi.Me，Me pro)-OH和Fmoc-Asp-Ser(.Psi.，Me，Me pro)-OH(购自NovaBiochem)。
切割
通过在室温下用95/2.5/2.5％(体积/体积)TFA/TIS/水处理2小时，将粗制肽从树脂上切下来。对于在序列中有甲硫氨酸的肽来说，使用95/5％(体积/体积)TFA/EDT混合物。在减压条件下除去大部分TFA，沉淀粗制肽并用二乙醚清洗，然后在室温下干燥至重量恒定。
HPLC纯化粗制肽
利用PerSeptive Biosystems VISION工作站、通过标准反相HPLC纯化粗制肽。使用3.0版软件来操控仪器并获取数据。使用MS分析肽并纯化至大于90％(通过HPLC测定)。
酰化胰高血糖素类似物的一般合成
按照上述针对胰高血糖素类似物的一般合成的描述来合成肽骨架，只是肽骨架在赖氨酸残基的侧链上被酰化而肽仍与树脂相连并且侧链基团(除了待酰化赖氨酸上的ε-氨基以外)得到完全保护。使用Fmoc-Lys(ivDde)-OH掺入待酰化的赖氨酸。用NMP中的Boc2O以Boc基团保护肽的N末端。当肽仍与树脂相连时，用NMP中的2％水合肼选择性剪切ivDde保护基团。未经保护的赖氨酸侧链而后首先与间隔氨基酸(如Fmoc-Glu-OtBu)偶联，其用哌啶去保护并采用上述标准肽偶联方法用脂肪酸酰化。或者，可一开始以Boc-His(Boc)-OH掺入N端的组氨酸。如上所述从树脂切割以及纯化。
肽稳定性分析
将胰高血糖素以固体化合物在40℃孵育，并溶于0.1M HCl水溶液(2mg/ml)中。将溶液在40℃孵育。通过在220nM整合UV信号，用RP-HPLC测量剩余的完整胰高血糖素类似物。剩余百分数是相对稳定性的度量值。
分析前将胰高血糖素化合物固体和溶液稀释于HPLC溶剂中至浓度为0.2mg/mL，并在合适的时间点进行分析。
表1：分析性HPLC设置
表达人胰高血糖素受体和GLP-1受体的细胞系的产生
分别从cDNA克隆BC104854(MGC：132514/IMAGE：8143857)和BC112126(MGC：138331/IMAGE：8327594)克隆编码人胰高血糖素受体(胰高血糖素-R)(初始登记号P47871)或人胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)(初始登记号P43220)的cDNA。使用编码用于亚克隆之末端限制性位点的引物，通过PCR扩增编码胰高血糖素-R或GLP-1-R的DNA。5’端引物还编码类似的Kozak共有序列以确保有效翻译。通过DNA测序来验证编码胰高血糖素-R和GLP-1-R的DNA的准确性。将编码胰高血糖素-R或GLP-1-R的PCR产物亚克隆进含有新霉素(G418)抗性标记的哺乳动物表达载体中。
通过标准的磷酸钙转染法将编码胰高血糖素-R或GLP-1-R的哺乳动物表达载体转染入HEK293细胞。转染48小时后将细胞接种用于有限稀释克隆，并在培养基中用1mg/ml G418进行选择。3周后，挑取表达胰高血糖素-R和GLP-1-R的细胞的12个存活克隆，扩增并进行如下所述的胰高血糖素-R和GLP-1-R效力测定。选择一个表达胰高血糖素-R之克隆和一个表达GLP-1-R之克隆进行化合物分析。
胰高血糖素受体和GLP-1受体效力测定
将表达人胰高血糖素-R或人GLP-1-R的HEK293细胞以40,000个细胞/孔接种在包被了0.01％聚-L-赖氨酸的96孔微滴定板上，并培养在100μl生长培养基中培养1天。在分析当天，去除生长培养基，用200μl Tyrode缓冲液清洗细胞1次。在37℃下在含有浓度递增的测试肽、100μM IBMX和6mM葡萄糖的100μl Tyrode缓冲液中孵育细胞15分钟。通过加入25μl 0.5MHCl终止反应，并在冰上孵育60分钟。使用来自Perkin-Elmer的FlashPlatecAMP试剂盒估计cAMP含量。通过计算机辅助的曲线拟合估计EC50和与参照化合物(胰高血糖素和GLP-1)相比较的相对效力。
原代大鼠脂肪细胞的脂肪分解
在原代大鼠脂肪细胞培养物中评估胰高血糖素类似物对脂肪分解的作用。脂肪细胞从解剖自正常年轻成年Sprague-Dawley大鼠的附睾脂肪中分离。将脂肪块切碎，在37℃下用含有4％BSA(KRB-BSA)之Krebs-Ringer缓冲液中的胶原酶(1mg/ml)孵育并振摇(220rpm)60分钟。悬液通过尼龙滤网(160μm孔径)过滤并以200×g将滤液离心3分钟。用巴氏吸管将上层漂浮的脂肪细胞下方的培养基去除。通过重悬浮和离心用KRB-BSA缓冲液清洗脂肪细胞3次。将脂肪细胞重悬于KRB-BSA中，混合，在37℃下与测试化合物一起在96深孔板(50,000个细胞/孔)中以1ml的总体积孵育并振摇60分钟。孵育后，将板置于冰上至少10分钟，而后以200×g离心3分钟。将脂肪细胞层下300μl的缓冲液收集在96深孔板中。再重复两次该过程，将从每个培养物中收集的3份提取物合并在一起。通过向等分(25μl)的脂肪细胞提取物中加入游离甘油试剂(200μl)、在室温下孵育15分钟并测量540nm处吸光度来测量脂肪细胞培养物中脂肪分解形成的甘油。
db/db小鼠的口服葡萄糖耐受测试(OGTT)
db/db小鼠被禁食过夜并在即将要施用(腹膜内)运载体(PBS)或ZP2653(SEQ ID NO：4)(45nmol/kg，在PBS中)之前采集初始血样(禁食血液葡萄糖水平)。在实验期间动物仍禁食以防止食物摄取的干扰。15分钟后给与口服剂量的葡萄糖(5ml/kg中的1g/kg)，并在t＝30分钟、t＝60分钟、t＝120分钟和t＝240分钟测量BG水平。
针对每个时间点计算与基线(t＝0)的差异，并测定AUC0-240分钟的值。用GraphPad Prism第4版通过单向ANOVA和Dunnetts事后分析来进行AUC的统计分析。认为p＜0.05的水平具有显著差异。
用ZP2653(SEQ ID NO：4)处理饮食诱导肥胖(DIO)小鼠28天对体重增 加和胆固醇的作用
在药物处理4周前，对C57Bl/6雄性小鼠(7周龄)(每组10-12只动物)饲喂高脂饮食(HFD)，将它们的昼夜周期通过开/关灯调整为2000/0800小时。在开始施用药物前一周对实验动物进行如下处理：每天注射(皮下)0.1ml运载体并通过一周两次称重使其适应。按照相似的体重(BW)在实验开始前一天将小鼠分类，第二天用ZP2653(SEQ ID NO：4)(500nmol/kg)或运载体(PBS，pH7.4；2.5μl/g体重)处理(每日两次，皮下)多组经分类的小鼠。将一直饲喂常规鼠食的非肥胖对照组用与DIO组相同的治疗方案用运载体处理。每天记录体重，并利用其在整个研究中施用经体重修正之剂量的肽。在处死前将动物禁食过夜。在下一天早上即将进行颈椎脱位前收集眼血样(0.6ml EDTA)。将血浆样本储存在-80℃直至用市售试剂盒分析胆固醇、HDL和LDL。通过减去处理开始时的体重，计算每只动物在整个处理期间的体重增加。
用GraphPad Prism第4版通过重复测量的双向ANOVA和Bonferoni事后分析来进行处理对体重增加和胆固醇的数据的统计分析。认为p＜0.05的水平具有显著差异。
结果
实施例1：肽稳定性
表2：胁迫(stress)后，通过RP-HPLC测量的回收率结果
  ZP   回收率(％)   回收率(％)
  化合物   固体肽   0.1M HCl
  胰高血糖素   91   15
  2653(SEQIDNO：4)   108   102
表2中显示了在HCl胁迫溶液中孵育的结果。在40℃下，类似物和胰高血糖素均保持稳定超过5周，并具有超过90％纯度的回收率。然而，化合物的酸降解结果显示，与本源胰高血糖素相比，胰高血糖素类似物的稳定性高6倍。
实施例2：对胰高血糖素受体和GLP-1受体的效力
表3：胰高血糖素类似物对胰高血糖素受体和GLP-1受体的EC50值
标记“*”的化合物为纯度小于90％的粗制肽。EC50被修正至纯度50％。
实施例3：脂肪分解测定
表4：原代大鼠脂肪细胞培养物中的脂肪分解激活(详见方法部分)
与胰高血糖素和OXM不同，GLP-1激动剂exendin-1对原代脂肪细胞培养物的脂肪分解无作用。ZP2653(SEQ ID NO：4)与胰高血糖素等效力，并且效力为OXM的50倍。用ZP2653(SEQ IDNO：4)处理DIO小鼠4周显著降低脂肪沉积的发现与在原代脂肪细胞培养物中对脂质代谢的作用(表4)相一致。
实施例4：对db/db小鼠口服葡萄糖耐受的作用
ZP2653(SEQ ID NO：4)显著提高患糖尿病之db/db小鼠中在OGTT期间测量的葡萄糖耐受(图1)。在45nmol/kg，ZP2653(SEQID NO：4)(45nmol/kg)将葡萄糖耐受提高了39.5％(通过曲线下面积(AUC)的降低来测量)(图1)。
实施例5：皮下施用对饮食诱导肥胖小鼠之体重增加的作用
ZP2653(SEQ ID NO：4)将体重增加降低至与饲喂鼠食所观察倒的相近的水平(图2)。与运载体组相比，体重增加统计学显著降低了。
实施例6：对LDL和HDL的作用
Exendin-4为强效GLP-1R激动剂，但对GluR无作用，并在上述大鼠脂肪细胞脂肪分解测定中无作用。Exendin-4对db/db小鼠的葡萄糖耐受和正常小鼠的食物摄取有强效作用，但对总胆固醇、HDL、LDL的血液浓度或HDL/LDL比值无作用(图3、4)。
相反，与运载体相比，用ZP2653(SEQ ID NO：4)处理DIO小鼠4周也对LDL胆固醇(P＝0.019)的血液浓度和HDL/LDL比值(P＝0.026)有显著作用(图3、4)。

Claims (11)

1.式R1-X-R2的化合物或其可药用盐，其中：
R1为H；
R2为OH或NH2；
X为式I的肽：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Leu-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Glu-Ser-Ala
或在1个或更多个的以下位置处与式I不同；如果与式I不同，则：
第2位残基选自：Aib、D-Ser；
第20位残基选自：Gln、Glu；
第24位残基选自：Gln、Lys。
2.权利要求1的化合物，其中第2位残基为Ser。
3.式R1-X-R2的化合物，其中：
R1为H；
R2为OH或NH2；
X为以下序列的肽：
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLESA(SEQ ID NO：4)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFIEWLESA(SEQ ID NO：5)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFVEWLESA(SEQ ID NO：6)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIQWLESA(SEQ ID NO：7)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLEST(SEQ ID NO：8)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLMNT(SEQ ID NO：9)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFVQWLESA(SEQ ID NO：10)；
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAEDFIKWLESA(SEQ ID NO：11)或
HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLERA(SEQ ID NO：12)。
4.前述权利要求中任一项的化合物，其中R2为NH2。
5.前述权利要求中任一项的化合物，其中所述化合物中一个或多个氨基酸侧链与亲脂取代基或聚合部分缀合。
6.编码前述权利要求中任一项之化合物的核酸。
7.包含权利要求6之核酸的表达载体。
8.包含权利要求6之核酸或权利要求7之表达载体的宿主细胞。
9.药物组合物，其包含与可药用载体混合的前述权利要求中任一项的化合物、核酸、表达载体或宿主细胞。
10.权利要求1至9中任一项之化合物、核酸、表达载体或宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于防止体重增加、促进体重减轻或者用于治疗由体重超重或肥胖引起或与其相关的病症，其中所述由体重超重或肥胖引起或与其相关的病症选自病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病和肥胖引起的睡眠呼吸暂停，或者用于治疗胰岛素抗性、葡萄糖不耐受、2型糖尿病、高血压、致动脉粥样化血脂异常、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病或中风。
11.权利要求1至8中任一项的化合物、核酸、表达载体或宿主细胞在制备用于医学治疗方法的药物中的用途。
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