DE102008003566A1 - Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil - Google Patents

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Insulinanaloga mit basalem Zeit-/Wirkungsprofil, die durch Addition und/oder Substitution negativ und positiv geladener Aminosäurereste sowie einer Amidierung der C-terminalen Carboxygruppe der B-Kette und Histidin in Position 8 der Insulin A-Kette charakterisiert sind, ihre Herstellung und Verwendung.

Description

  • Die Erfindung betrifft neue Insulinanaloga mit basalem Zeit-/Wirkungsprofil, ihre Herstellung und Verwendung.
  • Über die letzten Jahre hat die Zahl der Erkrankungen an Diabetes in einem geradezu epidemischen Ausmaß zugenommen. Aufgrund der Erkrankung kann es zu einer gravierenden Verkürzung der Lebenserwartung kommen. Menschen mit Diabetes müssen ihrem Körper oft Insulin von außen zuführen. Es ist sinnvoll, die Behandlung mit Insulin zu optimieren. Mittlerweile gibt es unterschiedliche Insuline mit spezifischen pharmakologischen Eigenschaften zur Behandlung.
  • Praktischerweise werden die unterschiedlichen Insuline nach ihrer Wirkdauer unterschieden in kurzwirksame Insuline, schnellwirkende Insuline, langwirksame Insuline und Mischinsuline. Synonym verwendete Bezeichnungen für langwirksame Insuline sind Verzögerungsinsulin, Depotinsulin oder auch Basalinsulin. Die Wirkstoffe vieler dieser Insulinpräparate sind sogenannte Insulinanaloga, die vom humanen Insulin abgeleitet worden sind durch Substitution, Deletion und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren. Die Begriffe „Insulinanaloga" und „Insuline" werden hier synonym verwendet.
  • Das Konzept der intensivierten Insulintherapie versucht das Gesundheitsrisiko abzumindern, indem eine stabile Kontrolle des Blutzuckerspiegels durch frühe Gabe von Basalinsulinen angestrebt wird. Ein Beispiel für ein gängiges Basalinsulin ist das Medikament Lantus® (Wirkstoff: Insulin Glargin = Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) Humaninsulin). Generell gilt es, bei der Entwicklung neuer, verbesserter Basalinsuline die Zahl hypoglykämischer Ereignisse zu minimieren. Ein ideales Basalinsulin wirkt dabei sicher in jedem Patienten mindestens 24 h Stunden. Idealerweise setzt die Insulinwirkung verzögert und mit einem möglichst flachen Zeit-/Wirkungsprofil ein, so dass die Gefahr einer kurzfristigen Unterzuckerung deutlich minimiert ist und die Applikation sogar ohne vorherige Einnahme von Nahrungsmitteln erfolgen kann. Eine gute Versorgung mit Basalinsulin ist dann gegeben, wenn die Insulinwirkung möglichst lange gleichbleibend anhält, d. h. der Körper mit einer konstanten Menge Insulin versorgt wird. Damit ist die Gefahr hypoglykämischer Ereignisse gering und eine Patienten- und tagesspezifische Variabilität minimiert. Das pharmakokinetische Profil eines idealen Basalinsulins sollte also durch einen verzögerten Wirkeintritt und durch eine verzögerte, d. h. lang anhaltende und gleichmäßige Wirkung gekennzeichnet sein.
  • Jedoch zeigt – trotz der bereits erreichten therapeutischen Vorteile – keines der bisher beschriebenen Verzögerungsinsuline die pharmakokinetischen Eigenschaften eines idealen Basalinsulins. Wünschens-wert sind Insuline, die ein solch flaches und lang andauerndes Zeit-/Wirkungsprofil haben, dass die Gefahr hypoglykämischer Ereignisse und der tagesabhängigen Varianz im Patienten weiter minimiert ist und die Wirkdauer weiter verzögert ist, so dass unter Umständen nicht mehr täglich Insulin verabreicht werden muss. Dies würde eine vereinfachte Behandlung von Diabetikern ermöglichen, insbesondere von älteren und pflegebedürftigen Diabetikern, die sich Insulin nicht mehr selber injizieren können und wäre somit auch von großem volkswirtschaftlichem Nutzen. In der frühen Phase des Diabetes Typ 2 wären solche Basalinsuline zudem nützlich. Kliniker berichten, dass die bei vielen Menschen vorhandene Phobie vor Spritzen sie davor zurückschrecken lässt, rechtzeitig mit der Insulintherapie zu beginnen. Als Konsequenz ergibt sich eine schlechte Blutzuckereinstellung, die diabetische Spätfolgen nach sich zieht. Ein Basalinsulin, das die Anzahl der durch Spritzen erfolgten Insulingaben vermindert, könnte bewirken, dass Patienten leichter die Insulintherapie annehmen.
  • Kohn et al. (Peptides 28 (2007) 935–948) beschreiben, dass man die Optimierung der Pharmakodynamik von Insulin dadurch erreichen kann, dass man Insulinanaloga herstellt, deren isoelektrischer Punkt (pl) durch Addition von Lysin oder Arginin an das B-Kettenende oder den N-Terminus der A und B-Kette in Richtung des alkalischen Bereichs verschoben ist, verglichen mit dem isoelektrischen Punkt von Humaninsulin (pl = 5,6), so dass die Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen verringert ist und sich ein verlängertes Zeit-/Wirkungsprofil ergibt. Verbindung 18 aus Kohn et al. (Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) Humaninsulin (pl experimentell bestimmt = 7,3; pl berechnet = 7,58) wird dabei als beste Verbindung im Sinne des Konzeptes dargestellt. Das hauptsächliche Ziel bei der Gestaltung neuer Insulinanaloga sehen Kohn et al. daher in der Addition von positiv geladenen Aminosäuren zur Aminosäuresequenz von Humaninsulin zwecks Erhöhung des isoelektrischen Punktes von pl = 5,6 in den neutralen Bereich.
  • Es wurde nun aber überraschend gefunden, dass solche Insulinanaloga zu dem beschriebenen wünschenswerten basalen Zeit-/Wirkungsprofil führen, die durch die Merkmale charakterisiert sind, dass
    • • das B-Kettenende aus einem amidierten basischen Aminosäurerest wie Lysin bzw. Argininamid besteht, und
    • • die Aminosäureposition A8 durch einen Histidinrest besetzt wird, und
    • • die Aminosäureposition A21 durch einen Glycinrest, Alaninrest, Serinrest oder Threoninrest besetzt wird, und
    • • nicht mehr als ein Aminosäurerest der Gruppe enthaltend A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 Asp oder Glu entspricht.
  • Überraschenderweise haben gerade die beschriebenen Insulinanaloga die gewünschten vorteilhaften dem Ideal nahe kommenden Zeit-/Wirkungsprofile, d. h. einen verzögerten flachem Wirkeintritt und eine längere Wirkdauer auf. Damit wird die Gefahr von hypoglykämischen Ereignissen deutlich minimiert. Die Verzögerung ist so deutlich, dass sich der Effekt überraschend sogar in Modellversuchen an Ratten nachweisen lässt, obwohl im Gegensatz dazu die verzögerte Wirkung von Insulin Glargin in der Ratte nicht eindeutig beobachtbar ist. In 1 ist die hypoglykämische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung YKL202 verglichen mit der von Insulin Glargin dargestellt. Ähnliche Ergebnisse werden im Hund erhalten. Damit sind neue Basalinsuline bereitgestellt worden, die deutlich weniger häufig appliziert werden müssen. Neben diesen beschriebenen pharmakokinetischen Vorteilen weisen die erfindungsgemäßen Analoga gegenüber Insulin Glargin bessere Eigenschaften in pharmakologischer Hinsicht auf. Zudem zeigen die beanspruchten Insuline auch in physikalisch-chemischer Hinsicht Vorteile.
  • Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Insulinanaloga der Formel I
    Figure 00040001
    wobei
    A-1 Lys, Arg oder einer Aminogruppe;
    A0 Lys, Arg oder einer chemischen Bindung;
    A1 Arg oder Gly;
    A5 Asp, Glu oder Gln;
    A15 Asp, Glu oder Gln;
    A18 Asp, Glu oder Asn;
    A21 Ala, Ser, Thr oder Gly;
    B-1 Asp, Glu oder eine Aminogruppe;
    B0 Asp, Glu oder eine chemische Bindung;
    B1 Asp, Glu, Phe oder eine chemische Bindung;
    B3 Asp, Glu oder Asn;
    B4 Asp, Glu oder Gin;
    B29 Arg, Lys oder einer Aminosäure ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Aminosäuren Phe, Ala, Thr, Ser, Val, Leu, Glu oder Asp, oder einer chemischen Bindung;
    B30 Thr oder einer chemischen Bindung;
    B31 Arg, Lys oder einer chemischen Bindung;
    B32 Arg-Amid oder Lys-Amid
    entspricht, wobei nicht mehr als ein Aminosäurerest der Gruppe enthaltend A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 Asp oder Glu entspricht, das gewünschte pharmakologische Profil, d. h. einen verzögerten Wirkeintritt und durch eine länger anhaltende und gleichmäßige Wirkung, haben. Diese Insulinanaloga sind daher Gegenstand der Erfindung.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Insulinanalogon wie oben beschrieben, wobei ein Aminosäurerest der Gruppe enthaltend A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 Asp oder Glu entspricht.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Insulinanalogon wie oben beschrieben, wobei bevorzugt A-1 Arg, A0 Arg, A5 Glu, A15 Glu, A18 Asp, A8 His, A21 Gly, B0 Glu, B3 Asp, B4 Glu, B30 Arg oder B30 Lys entspricht.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Insulinanalogon wie oben beschrieben, wobei dieses ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend
    Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin,
    Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin,
    His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin.
  • Durch die Angabe des Begriffs "Humaninsulin" in den Bezeichnungen der genannten Insulinanaloga wird Bezug auf die Aminosäuresequenzen der A- und B-Kette von Humaninsulin genommen und alle Abweichungen (Additionen, Substitutionen, Deletionen) davon sind in einer gegebenen Bezeichnung eines Insulinanalogons angegeben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei ein Vorläufer des Insulinanalogs Humaninsulin rekombinant hergestellt wird, der Vorläufer enzmatisch zu zwei-kettigem insulin prozessiert wird und eine Kupplung mit Argininamid in Gegenwart eines Enzyms mit Trypsinaktivität durchgeführt wird, und das Insulinanalogon isoliert wird.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Insulinanalogons wie oben beschrieben, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes Mellitus., insbesondere von Diabetes Mellitus Typ I oder Typ II. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend ein Insulinanalogon wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend ein Insulinanalog wie oben beschrieben, das therapeutisch zur Knorpelregeneration eingesetzt wird.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend ein Insulinanalog wie oben beschrieben, das therapeutisch zur Unterstützung der beta-Zellregeneration eingesetzt wird.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei die Formulierung in wässriger Form enthaltend das gelöste Insulinanalogon vorliegt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei die Formulierung in Form von Pulver vorliegt, insbesondere in kristalliner und/oder amorpher Form.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei die Formulierung in Form einer Suspension vorliegt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Formulierung des Insulinanalogons wie oben beschrieben, wobei die Formulierung zusätzlich ein chemisches Chaperon enthält.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA kodierend für einen Vorläufer eines Insulinanalogons wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA kodierend für die A-Kette eines Insulinanalogons wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA kodierend für die B-Kette eines Insulinanalogons wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor enthaltend eine DNA wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Wirtsorganismus enthaltend eine DNA wie oben beschrieben oder einen Vektor wie oben beschrieben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Präproinsulinanalogon, dadurch gekennzeichnet, dass das C-Peptid an seinem N-Terminus den Aminosäurerest Arginin trägt und sein C-Terminus durch die Form Arg Arg, Arg Lys oder Lys Arg Arg gekennzeichnet ist.
  • Dem Fachmann ist dabei klar, dass die erfindungsgemäßen Insuline Gegenstand einer pharmazeutischen Formulierung sein können, die nach Applikation vorteilhaft wirkt. Dabei geht man von wässrigen Lösungen aus. Entsprechend müssen weitere Komponenten mischbar sein. Die Gefahr viraler tierischer Kontamination wird dadurch minimiert, dass die Zubereitung keine Komponenten enthalten sollte, die aus tierischen Quellen stammen. Es ist weiterhin vorteilhaft, durch Zusatz von Konservierungsmitteln eine mikrobielle Verunreinigung zu verhindern. Durch den Zusatz isotoner Agentien kann eine mögliche negative Auswirkung der Formulierung auf die Physiologie der Gewebezellen an der Applikationsstelle kompensiert werden. Stabilisierend kann sich der Zusatz von Protamin auswirken, so dass man weitgehend salzfreien Insulinzubereitung gelangen kann, wenn man der Formulierung Protamin zufügt. Der Zusatz von einer phenolischen Komponente kann zu einer Stabilisierung der Struktur des verwendeten Insulinanalogons führen und so unter anderem den Verzögerungseffekt beim Wirkungseintritt zusätzlich bewirken. Der Formulierung zugesetzt können auch Substanzen sein, die die Raumstruktur der erfindungsgemäßen Verzögerungs-insuline stabilisieren und zu besserer thermischen Stabilität führen. Solche chemischen Chaperone können z. B. kurze synthetische Peptide, die auch Aminosäureanaloga enthalten können oder z. B. vom C-Peptid des Insulin abgeleitete Peptidsequenzen umfassen.
  • Zur Entwicklung von Depotformen können die erfindungsgemäßen insuline in Nanopartikel eingebunden werden. Denkbar sind auch sogenannte „Slow release" Formuierungen, bei denen das erfindungsgemäße Verzögerungsinsulin reversibel an polymere Träger gebunden vorliegt.
  • Die erfindungsgemäßen insuline können parallel zu schnellwirksamen Insulinen wie Apidra®, NovoRapid®, Humalog® oder sich in Entwicklung befindlichen Insulinderivaten oder Formulierungen mit entsprechendem Zeit-/Aktionsprofil oder inhalierbarem Insulin oder nasal oder oral applizierten Insulinen, die sich in Entwicklung befinden, verabreicht werden. Dabei ist es dem Fachmann klar, dass dazu auch entsprechend formulierte Mischungen aus schnell wirksamen und erfindungsgemäßem Verzögerungsinsulin verwendet werden können. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Insuinanaloga in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden, die Peptide, die durch eine dem GLP-1 (Glucagon like Peptide-1) oder dem Exendin-4 bzw. Exendin-3 vergleichbare Aktivität beschrieben sind, enthalten. Beispiel für solche Peptide stellen GLP-1 (7-37), Exenatide (Byetta®) oder Peptide, deren Herstellung in den Patentanmeldungen WO 2006/058620 , WO 2001/04156 , WO 2004/005342 und WO 98/08871 beschrieben sind, dar. Besonders vorteilhaft sind dabei Formulierungen, die eine Depotformulierung dieser Peptide enthalten. Vorteilhaft besonders in der Anfangsphase der Typ II Diabetes Erkrankung sind Therapieformen, die parallel zu Verabreichung der erfindungsgemäßen Pharmazeutika vorsehen, die die Insulinwirkung erhöhen, wie z. B. Metformin. Kombinationstherapien mit Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitoren, die den Spiegel an Inkretinen erhöhen, sind wie Kombinationen mit Sulfonylharnstoffen, die die Insulinausschüttung im Pankreas erhöhen, ebenfalls möglich. Besonders vorteilhaft können die erfindungsgemäßen Verzögerungsinsuline dann eingesetzt werden, wenn durch Applikation von Differenzierungsfaktoren, die Regeneration von Betazellen aus entsprechenden Stammzellen eingeleitet wird. All diese Anwendungen sind beispielhaft für die Therapie des Diabetes genannt und ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Insuline in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung von Diabetes, insbesondere Diabetes Typ I oder Typ II Diabetes.
  • Weiterer Erfindungsgegenstand ist auch eine Verwendung der erfindungsgemäßen Insuline bei Regenerationspozessen, die das Skelett, wie z. B. die Knorpelregeneration, betreffen. Bei dieser Verwendung kommt es darauf an, kontrolliert das mitogene Potential von Insulinen zu nutzen, ohne dabei eine starke metabolische Reaktion hervorzurufen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel, das ein erfindungsgemäßes Analogon enthält, welches insbesondere eine wässrige Formulierung oder ein Pulver darstellt.
  • Das Arzneimittel ist eine pharmazeutische Zubereitung, die vorzugsweise eine Lösung oder Suspension zu Injektionszwecken ist; sie ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem erfindungsgemäßen Insulinanalog, und/oder mindestens einem von deren physiologisch verträglichen Salzen in gelöster, amorpher und/oder kristalliner – vorzugsweise in gelöster – Form.
  • Die Zubereitung weist vorzugsweise einen pH-Wert zwischen etwa 2,5 und 8,5, insbesondere zwischen etwa 4,0 und 8,5 auf, enthält ein geeignetes Isotonisierungsmittel, ein geeignetes Konservierungsmittel und gegebenenfalls einen geeigneten Puffer, sowie vorzugsweise auch eine bestimmte Zink-Ionenkonzentration, in steriler wässriger Lösung. Die Gesamtheit der Zubereitungsbestandteile außer dem Wirkstoff bildet den Zubereitungs-Träger. Geeignete Isotonisierungsmittel sind z. B. Glycerin, Glukose, Mannit, NaCl, Calcium- oder Magnesium-Verbindungen wie CaCl2 etc. Durch die Wahl des Isotonisierungsmittels und/oder Konservierungsstoffes beeinflusst man die Löslichkeit der erfindungsgemäßen Insuline bzw. deren physiologisch verträgliche Salze bei schwach sauren pH-Werten.
  • Geeignete Konservierungsmittel sind z. B. Phenol, m-Cresol, Benzylalkohol und/oder p-Hydroxybenzoesäureester.
  • Als Puffersubstanzen, insbesondere zur Einstellung eines pH-Wertes zwischen etwa 4,0 und 8,5 können z. B. Natriumacetat, Natriumcitrat, Natriumphosphat etc. verwendet werden. Ansonsten sind zur Einstellung des pH-Wertes auch physiologisch unbedenkliche verdünnte Säuren (typischerweise HCl) bzw. Laugen (typischerweise NaOH) geeignet.
  • Wenn die Zubereitung einen Zinkgehalt besitzt, ist ein solcher von 1 μg/ml bis 2 mg/ml, insbesondere von 5 μg bis 200 μg Zink/ml bevorzugt.
  • Zwecks Variation des Wirkstoffprofils der erfindungsgemäßen Zubereitung kann auch unmodifiziertes Insulin, vorzugsweise Rinder-, Schweine- oder Human-Insulin, insbesondere Humaninsulin, oder Insulinanaloga und Derivate davon zugemischt werden. Ebenfalls können ein oder mehrere Exendin-4 Derivate oder Peptide, die durch eine dem GLP-1 (Glucagon like Peptide-1) vergleichbare Aktivität charakterisiert sind, zugemischt werden. Solche Arzneimittel (Zubereitungen) sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Bevorzugte Wirkstoffkonzentrationen sind solche entsprechend etwa 1–1500, weiter bevorzugt etwa 5–1000 und insbesondere etwa 40–400 internationale Einheiten/ml.
  • Die erfindungsgemäßen Insulinanaloga werden zunächst als Vorstufe, die noch nicht das Amid umfasst, biotechnologisch hergestellt. Dem Fachmann ist geläufig, das es eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Herstellung von Insulinen gibt. Als Wirtszellsysteme finden dabei Bakterien, Hefen und höhere Pflanzen bzw. fermentativ zu kultivierende Pflanzenzellen Verwendung. Falls die Kostenbetrachtung es erlaubt sind auch Expressionssysteme, die tierische Zellen als Wirtssystem nutzen, denkbar. Voraussetzung dafür ist aber eine sichere Freiheit von tierischen Viren. Somit ist klar, dass die beispielhaft beschriebenen Expressionssysteme nur einen kleinen Ausschnitt der für die rekombinante Herstellung von Proteinen entwickelten Wirts/Vektorsysteme darstellen. In der Anmeldung werden z. B. biotechnologische Verfahren, die Hefe- oder Pflanzensysteme wie Moose, Algen oder höhere Pflanzen wie Tabak, Erbse, Distel, Gerste, Mais oder Raps zur Grundlage haben nicht beschrieben. Dennoch sind Wirts/Vektor Systeme sowie kodierende DNA-Sequenzen, die die Herstellung der Zielpeptide in entsprechenden biotechnologischen Expressionssystemen erlauben, ebenfalls Bestandteil der Erfindung. Wirtsorganismen können also insbesondere ausgewählt werden aus dem Pflanzenreich aus Organismen der ersten Abteilung Schizophyta enthaltend Schizomcetes, Bakterien oder Blaualgen, Organismen der 2. Abteilung Phycophyta V. Klasse Chlorophyceae, Organismen der 2. Abteilung Phycophyta VII. Klasse Rhodophyceae, Organismen der 3. Abteilung Mycophyta, Organismen der 5. Abteilung Bryophyta und Organismen der 7. Abteilung Spermatophyta.
  • In der Europäischen Patentanmeldung EP-A 1 222 207 ist ein Plasmid pINT358d beschrieben, das für ein Prä-Proinsulin codiert, welches ein verändertes C-Peptid umfasst. Mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist es nun möglich, gezielt die das Proinsulin kodierende Sequenz so zu verändern, dass Prä-Proinsuline exprimiert werden können, die als Vorstufen für die erfindungsgemäßen Insulin dienen können. Entsprechende Fusionsproteine müssen nicht notwendigerweise intrazellulär hergestellt werden. Es ist dem Fachmann klar, dass solche Proteine auch durch bakterielle Expression mit anschließender Sekretion in das Periplasma und/oder in den Kulturüberstand hergestellt werden können. Die Europäische Patentanmeldung EP-A 1 364 029 beschreibt dies beispielhaft. Die Proinsulinvorstufen, die zu den erfindungsgemäßen Analoga führen, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Die so hergestellten Proinsuline können prinzipiell zu einer Insulinanalogavorstufe umgewandelt werden, die in Position A0 Lysin oder Arginin umfasst und am C-terminalen Ende der B-Kette Lysin oder Arginin trägt. Alternativ kann eine positiv geladene Aminosäure semisynthetisch an den N-Terminus der A-Kette addiert werden, wenn Lysin oder Arginin nicht ohnehin schon vorliegen.
  • Liegen die erfindungsgemäßen Proinsuline nach intrazellulärer Expression in Bakterien als Einschlusskörper oder löslich vor, müssen diese Vorstufen durch in vitro Faltung in die richtige Konformation gefaltet werden, bevor die Prozessierung und biochemische Modifikation vorgenommen werden kann. Dabei erlaubt das beschriebene Fusionsprotein eine direkte Faltung nach Denaturierung mittels Harnstoff oder Guanidinium Hydrochlorid, Faltungsintermediate sind dabei ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Zur Anreicherung der einzelnen Zwischenstufen finden biochemische Methoden insbesondere Trennverfahren Verwendung, deren zugrunde liegenden Prinzipien publiziert und sogar Gegenstand von Lehrbüchern sind. Dem Fachmann ist klar, dass solche Prinzipien in Folge kombiniert werden können und so zu Verfahren führen können, die in ihre Abfolge vorher nicht publiziert wurden. Verfahren, die zur Reinigung der erfindungsgemäßen Analoga führen sind somit ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Insulinanaloga, wobei ein Vorläufer des Insulinanalogons rekombinant hergestellt und enzymatisch zu einer 2-kettigen Insulinvorstufe umgewandelt wird, die N-terminal zu Aminosäure 1 der A-Kette Arginin bzw. Lysin trägt und am C-terminalen Ende der B-Kette einen Lysin oder Argininrest aufweist, der mit Argininamid oder Lysinamid in Gegenwart eines Enzyms mit Trypsinaktivität in das Amid und somit in das erfindungsgemäße Verzögerungsinsulin überführt und über ein biochemischer Reinigungsverfahren hochrein dargestellt wird.
  • Figurenlegende:
  • 1: Blutzuckersenkende Wirkung von erfindungsgemäßen Insulinanaloga in Ratten
  • Die folgenden Beispiele sollen den Erfindungsgedanken illustrieren, ohne dabei beschränkend zu wirken.
  • Beispiel 1: Herstellung des Vektorderivates pINT3580, das für Gly (A21)-Insulin und ein modifiziertes C-Peptid, das an der C/A-Kettengrenze Arg Arg trägt, kodiert.
  • Die Europäische Patentanmeldung EP-A 1 222 207 beschreibt die Plasmide pINT358d, pINT91d und die Primer-Sequenz Tir. DNA dieser Produkte findet Verwendung in der Konstruktion des Plasmides pINT3580. Das Plasmid pINT358d ist dabei durch eine Gensequenz charakterisiert, die für ein modifiziertes C-Peptid mit besonderen Eigenschaften kodiert. Drei Primersequenzen werden synthetisiert:
    Figure 00140001
  • Dieser Primer dient nach Aufarbeitung dazu in Position 21 der A-Kette der von pINT358d kodierten Proinsulinsequenz Glycin (fett gedruckt, unterstrichen) anstelle von Asparagin einzuführen.
  • Figure 00140002
  • Dieser Primer dient, wie der Primer arg_cjunc_rev, zur Einführung von Arginin anstelle von Lysin an der Insulin A-/B-Kettengrenze.
  • Figure 00140003
  • Das Codon für das einzuführende Arginin ist in beiden Primern fett gedruckt. Mit DNA des Plasmides pINT358d als Matrize wird mit den Primerpaaren Tir/arg_cjunc_rev und arg_cjuncf/pint3580_glya21rev entsprechend der Europäischen Patentanmeldung EP-A 1 222 207 je eine PCR durchgeführt. Aliquots der Produkte beider Reaktionen werden kombiniert und zusammen mit dem Primerpaar Tir/pint3580_glya21rev in einer dritten PCR eingesetzt. Das Produkt dieser Reaktion wird nach gelektrophoretischer Auftrennung des Reaktionsgemisches gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Sal1/Nco1 nach Angaben des Herstellers in ein und derselben Reaktion verdaut, das Reaktionsgemisch gelelektrophoretisch aufgetrennt und das die Proinsulinsequenz kodierende DNA-Fragment isoliert. Das Fragment wird anschließend über eine DNA-Ligasereaktion in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert.
  • Mit dem Ligationsgemisch werden kompetente E. coli Bakterienzellen transformiert. Das Transformationsgemisch wird auf Selektionsplatten, die 25 mg/l Ampicillin enthalten, ausplattiert. Plasmid DNA wird von Kolonien isoliert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3580.
  • Beispiel 2: Konstruktion des Plasmides pINT3581 kodierend für His (A8), Gly (A21)-Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya2lrev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00150001
  • Das Codon, das für Histidin in Position 8 der A-Kette kodiert ist jeweils fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template für PCR1 und 2 ist DNA des Plasmides pINT3580. PCR1 wird mit dem Primerpaar Tir/pint3580_Ha8rev und PCR2 mit dem Primerpaar pint3580_Ha8f/pint3580_glya21rev durchgeführt. In PCR3 wird mit dem Primer paar Tir/pint3580_glya21rev eingesetzt. Template ist dabei ein Gemisch der Reaktionsprodukte von PCR1 und PCR2. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3581.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Beispiel 3: Konstruktion des Plasmides pINT3582 kodierend für His (A8), Glu (A5), Gly (A21)-Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00160001
  • Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 5 der A-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3582.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Beispiel 4: Konstruktion des Plasmides pINT3583 kodierend für His (A8), Asp (A18), Gly (A21)-Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt abweichend von Beispiel 1 über nur eine Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt dieser Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet wird der Primer Tir. Ein weiterer Primer wird synthetisiert:
    Figure 00170001
  • Das Codon, das für Asparaginsäure in Position 18 der A-Kette kodiert, ist fett herausgestellt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3583.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Beispiel 5: Konstruktion des Plasmides pINT3585 kodierend für His (A8), Glu (A15), Gly (A21)-Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt abweichend von Beispiel 1 über nur eine Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt dieser Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet wird der Primer Tir. Ein weiterer Primer wird synthetisiert:
    Figure 00180001
  • Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 15 der A-Kette kodiert, ist fett herausgestellt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3585.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Beispiel 6: Konstruktion des Plasmides pINT3588 kodierend für His (A8), Gly (A21), Asp (B3)-Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya2lrev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00190001
  • Das Codon, das für Asparagin in Position 3 der Insulin B-Kette kodiert ist jeweils fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3588.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Beispiel 7: Konstruktion des Plasmides pINT3593 kodierend für His (A8), Gly (A21), Glu (B4) Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben über 3 Polymerase Kettenreaktionen. Das Produkt der dritten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Verwendet werden die Primer Tir und pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert :
    Figure 00200001
  • Das Codon, das für Glutamin in Position 4 der Insulin B-Kette kodiert, ist fett herausgestellt. Die Konstruktion wird wie ins Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Template ist DNA des Plasmides pINT3581. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3593.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Beispiel 8: Konstruktion des Plasmides pINT3597 kodierend für His (A8), Gly (A21), Glu (B0)-Präproinsulin
  • Die Konstruktion erfolgt über 2 Polymerase Kettenreaktionen. Verwendet wird der Primer pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
    Figure 00210001
  • Dabei überlappen sich die beiden Primer partial. Pint3581_Eb0f2 enthält eine Nco1-Erkennungssequenz. Diese ist unterstrichen dargestellt. Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 0 am Anfang B-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Template für PCR1 ist DNA des Plasmides pINT3581.
  • PCR1 wird mit dem Primerpaar pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev. Template für PCR2 ist das Produkt aus PCR1. PCR2 wird mit dem Primerpaar pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev durchgeführt. Das Produkt aus PCR2 übereckt die vollständige Präproinsulinsequenz. Das Produkt der zweiten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3597.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Argininamid entsteht.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Ersetzt man das Codon für Glutaminsäure in Position B0 durch das Codon von Asparaginsäure und folgt dem Beispiel, so gelangt man zu Plasmiden, die in Position B0 anstelle von Glutaminsäure Asparaginsäure tragen.
  • Beispiel 9: Konstruktion des Plasmides pINT3700 kodierend für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin
  • Die Konstruktion dient dazu, an der Grenze zwischen Präsequenz und Start der B-Kette anstelle des Codons für Arginin das Codon für Lysin einzuführen. Die Konstruktion erfolgt über zwei Polymerase Kettenreaktionen. Verwendet wird der Primer pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert.
  • Figure 00220001
  • Dabei überlappen sich die beiden Primer partial und pint3581_Eb0f2 enthält eine NcoI-Erkennungssequenz. Diese ist unterstrichen dargestellt. Das Codon, das für Glutaminsäure in Position 0 am Anfang B-Kette kodiert, ist jeweils fett herausgestellt. Template für PCR1 ist DNA des Plasmides pINT3581. PCR1 wird mit dem Primerpaar pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev durchgeführt. Template für PCR2 ist das Produkt aus PCR1. PCR2 wird mit dem Primerpaar pint3581_Eb- 1f2/pint3580_glya21rev durchgeführt. Das Produkt aus PCR2 überdeckt die vollständige Präproinsulinsequenz. Das Produkt der zweiten Reaktion wird nach Nco1/Sal1 Spaltung in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3700.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin. Um zu der Verbindung zu gelangen stellt man zunächst durch Umsetzung mit Trypsin und Lysyl-Endopeptidase C die Zwischenstufe Arg (A0), His (A8), Gly (A21), des Thr (B30)-Humaninsulin her, die anschließend über Amidierung mit Argininamid zu der gewünschten Verbindung umgewandelt wird.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Beispiel 10: Konstruktion des Plasmides pINT3701 kodierend für Gly (A21) Lys (B0)-Präproinsulin
  • Die Konstruktion dient dazu, an der Grenze zwischen Präsequenz und Start der B-Kette anstelle des Codons für Arginin das Codon für Lysin einzuführen. Folgt man der Konstruktionsstrategie aus Beispiel 10, verwendet aber als Template für PCR1 DNA des Plasmides pINT358d, so gelangt man zu dem Plasmid pINT3701, das wie das ursprüngliche Plasmid pINT358d dadurch charakterisiert ist, das die Grenze zwischen C-Peptid und A-Kette durch die Aminosäurefolge Lys-Arg gebildet wird
  • Beispiel 11: Konstruktion des Plasmides pINT3702 kodierend für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin mit dem C-Peptid gemäß Beispiel 10
  • Folgt man dem im Beispiel 2 beschriebenen Konstruktionsplan, verwendet aber als Template DNA des Plasmides pINT3701, so gelangt man zu dem Plasmid pINT3702.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin. Um zu der Verbindung zu gelangen stellt man zunächst durch Umsetzung nur mit Lysyl-Endopeptidase C die Zwischenstufe Arg (A0), His (A8), Gly (A21), des Thr (B30)-Humaninsulin her, die anschließend über Amidierung mit Argininamid zu der gewünschten Verbindung umgewandelt wird
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entseht.
  • Beispiel 12: Herstellung des Vektorderivates pINT3703, das für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin und ein modifiziertes C-Peptid, das an der C/A-Kettengrenze das Tri-Peptid Lys-Arg-Arg trägt, kodiert.
  • Benutzt wird DNA des Plasmides pINT3702 als Template, sowie die Primer pint3580_glya21rev und Tir. Zwei Primersequenzen werden synthetisiert.
  • Figure 00240001
  • Dieser Primer dient wie der Primer arg_cjunc_rev zur Einführung von Arginin an der Insulin A-/B-Kettengrenze.
  • Figure 00240002
  • Das Codon für das einzuführende Arginin ist in beiden Primern fett gedruckt. Mit DNA des Plasmides pINT3702 als Matrize werden mit den Primerpaaren Tir/3702_cjunc_rev und 3702_arg_cjuncf/pint3580_glya21rev entsprechend EP-A 1 222 207 je eine PCR durchgeführt. Aliquots der Produkte beider Reaktionen werden kombiniert und zusammen mit dem Primerpaar Tir/pint3580_glya21rev in einer dritten PCR eingesetzt. Das Produkt dieser Reaktion wird nach gelektrophoretischer Auftrennung des Reaktionsgemisches gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Sal1/Nco1 nach Angaben des Herstellers in ein und derselben Reaktion verdaut, das Reaktionsgemisch gelelektrophoretisch aufgetrennt und das die Proinsulinsequenz kodierende DNA-Fragment isoliert. Das Fragment wird anschließend über eine DNA-Ligasereaktion in die Nco1/Sal1 geöffnete pINT91d Vektor DNA insertiert.
  • Mit dem Ligationsgemisch werden kompetente E. coli Bakterienzellen transformiert. Das Transformationsgemisch wird auf Selektionsplatten, die 25 mg/l Ampicillin enthalten ausplattiert. Plasmid DNA wird von Kolonien isoliert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Richtige Plasmide erhalten die Bezeichnung pINT3702.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin. Um zu der Verbindung zu gelangen, stellt man zunächst durch Umsetzung mit Lysyl-Endopeptidase C die Zwischenstufe Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), des Thr (B30)-Humaninsulin her, die anschließend über Amidierung mit Argininamid zu der gewünschten Verbindung umgewandelt wird.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Es ist dem Fachmann klar, dass man entsprechend den Beispielen 3–8 Asparaginsäure oder Glutaminsäure in die entsprechenden Positionen der A bzw. B-Kette einführen kann. Diese Proinsuline sind Vorstufe für die Verbindungen
    YKL202-10a Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-10b Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-11a Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-11b Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-12a Arg (A-1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-12b Arg (A-1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-13a Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-13b Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-14a Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-14b Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-15a Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin
    YKL202-15b Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin
  • Beispiel 13: Herstellung des Vektorderivates pINT3704, das für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin kodiert
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des Vektorderivates pINT3704, das für His (A8), Gly (A21), Lys (B0)-Präproinsulin kodiert und ein modifiziertes C-Peptid, das an der C/A-Kettengrenze das Tri-Peptid Lys-Arg-Arg trägt, und bei dem die Aminosäure Glycin, welche in Humaninsulin in Position A21 vorkommt, deletiert ist.
  • Folgt man dem in Beispiel 12 beschrieben Syntheseschema und ersetzt die Primer 3702_arg_cjuncf und 3702_arg_cjuncfrev durch die Primer 3703_Δ Ga1f und 3703_Δ Ga1rev und benutzt DNA des Plasmides pINT3073 als Template, so gelangt man zu dem Plasmid pINT3704, das dadurch gekennzeichnet ist, das das in dem kodierten Präproinsulin die Aminosäure Glycin in Position1 der A-Kette deletiert ist und der übrige Sequenzverlauf dem, der von pINT3703 kodierten Sequenz entspricht.
  • Figure 00270001
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin. Um zu der Verbindung zu gelangen, stellt man zunächst durch Umsetzung mit Lysyl-Endopeptidase C die Zwischenstufe Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), des Thr (B30)-Humaninsulin her, die anschließend über Amidierung mit Argininamid zu der gewünschten Verbindung umgewandelt wird.
  • Das von dem Plasmid kodierte Prä-Proinsulin ist Vorstufe für die Verbindung Arg (A0), Arg (Al), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, die nach Amidierung mit Lysinamid entsteht.
  • Dem Fachmann ist klar, dass man entsprechend Beispiel 12 negativ geladene Aminosäuren in die Präproinsulinsequenz einführen kann. Auch lässt sich in Analogie zu Beispiel 13 aus dem Plasmid pINT3702 ein Plamid herstellen, dass für eine Proinsulinsequenz kodiert, die die Herstellung von Insulinderivaten erlaubt, die in Position 1 der A-Kette ein Arginin als N-terminale Aminosäure tragen.
  • Beispiel 14: Expression der Proinsulinderivate
  • Die Expression wird entsprechend Beispiel 1 der Europäischen Patentanmeldung EP-A 1 222 207 durchgeführt.
  • Beispiel 15: Faltung der Proinsulinderivate
  • Die Faltung erfolgt prinzipiell nach der in EP-A 0 668 282 beschriebenen Methode.
  • Beispiel 16: Prozessierung der Proinsuline aus den Beispielen 2–8 mittels Trypsin
  • Es erfolgt die enzymatische Prozessierung der gefalteten Präproinsulin zu der zweikettigen Arg (A0)-Insulinvorstufe, deren C-terminales B-Kettenende durch Lysin oder Arginin charakterisiert ist. Die enzymatische Prozessierung der gefalteten Präproinsulinvorstufe erfolgt wie z. B. in Beispiel 4 von WO91/03550 beschrieben. Als besonders vorteilhaft erweist sich dabei der Einsatz der in WO 2007/031187 A1 beschriebenen Trypsinvariante.
  • Beispiel 17: Prozessierung der Proinsuline aus den Beispielen 9–13 mittels Endoproteinase Lys-C
  • Endoprotease Lys-C aus Achromobacter lyticus ist kommerziell erhältlich (Merck/Calbiochem). Die Reaktion wird leicht modifiziert wie von Jekel, P. A. et al. [Anal. Biochem. 134, 347–354,(1983)] beschrieben durchgeführt. Es wird ein pH von 9,5 eingestellt und die Reaktionstemperatur beträgt 30°C.
  • In der Eintopfreaktion wir die Präsequenz abgespalten und das C-Peptid beginnend mit Thr (B30) herausgespalten, so dass das C-terminale Ende der B-Kette von Lysin gebildet wird, das als reaktive Stelle für die enzymkatalysierte Kupplungsreaktion vorliegt.
  • Beispiel 18: Herstellung der Arg-NH2 bzw. Lys-NH2 Insulinverbindung aus der zweikettigen Vorstufe über Kupplung mit Arginin – bzw. Lysinamid
  • Unabhängig von der Positionierung der zusätzlichen sauren Aminosäuren wird eine Standardreaktion wie folgt durchgeführt: 100 mg Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31)-Insulinanalog werden in 0.95 ml Argininamidlösung (446 g/L) gelöst, 0.13 ml M Na-Acetatpuffer (pH 5.8) und 2 ml DMF zugegeben. Die Reaktionsmischung wird auf 12°C gekühlt und durch Zugabe von 0.094 ml Trypsin (0.075 mg, Roche Diagnostics) gestartet. Nach 8 h wird die Reaktion durch Zugabe von TFA bis pH 2.5 gestoppt und per HPLC analysiert. Es bildet sich > 60%. Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Insulinanalogon Nach Zusatz von Trypsininhibitorlösung erfolgt die Reinigung des amidierten Analogs in Analogie zu US 5,656,722 .
  • Die Herstellung der entsprechenden Lysinamid-Verbindung erfolgt analog. Allerdings geht man von einer wässrigen Lysinamid Stammlösung aus, die 366g/L Lysinamid gelöst enthält.
  • Beispiel 19: Semisynthetische Herstellung von Lys (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-Insulinamid
  • Die in Beispiel 11 beschriebene Verbindung YKL202-8, die einem Insulinderivat der Struktur Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-Insulinamid entspricht, dient als Ausgangsmaterial zur Herstellung der Verbindung YKL202-11, die Lys (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-Insulinamid. 200 mg der Verbindung werden in 40 ml eines 100 mMl Na2 HPO4/CH3CN (50:50)-Gemisches gelöst und ein pH von 7,7–8,2 eingestellt. Als weiteres Material wird ein Boc-Lys (Boc)-NHS Ester hergestellt indem man 0,3 mM Boc-Lys (Boc)-OH, 0,4 mM N-hydroxysuccineimide (NHS) und 0,4 mM Dicyclohexylcarbodiimid (DCVC) in Dichlormethan 40 Minuten mischt. Das Reaktionsgemisch im Rotationsvakuumverdampfer zur Trockene eingeengt. Das Gemisch wird anschließend in 5 ml Methanol aufgenommen und dem gelösten Ausgangsinsulin zugesetzt. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur mindestens 60, maximal aber 120 Minuten gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 200 μl TFA gestoppt. Die Masse der Reaktionsprodukte wird über LC-MS massenspektroskopisch charakterisiert, um den Nachweis zu erbringen, dass monoacyliertes Produkt, das aus drei Komponenten besteht vorliegt. Die Komponenten werden über HPLC getrennt. Dabei werden auch di-acylierte und tri-acylierte Nebenprodukte abgetrennt. Die Fraktionen der HPLC-Trennung werden massenspektrokopisch analysiert. Die 3 Fraktionen, in denen jeweils monoacyliertes Produkt enthalten, werden einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen, deren Interpretation die Identifikation der HPLC-Fraktion erlaubt, die die gewünschte Verbindung enthält von der anschließend durch Hydrolyse die Boc-Schutzgruppen entfernt werden. Nach erneuter HPLC-Reinigung wird das gewünschte Produkt auf seine biologischen Eigenschaften getestet.
  • Beispiel 20: Herstellung des Plasmides pINT358_ha8, das für His (A8), Gly (A21) Proinsulin kodiert.
  • Folgt man dem Herstellungsschema aus Beispiel 2 und verwendet als Template für die PCR1 und PCR2 DNA des Plasmides pINT358d, so gelangt man zu dem Plasmid pINT358_ha8, das für His (A8), Gly (A21) Proinsulin kodiert. Das von dem Plasmid kodierte Proinsulin dient als, dient als Vorstufe für die Verbindung der Form His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin charakterisiert. Die Prozessierung des Präproinsulins zu His (A8), Gly (A21), Arg (B31) als Zwischenstufe vor Amidierung erfolgt dabei wie in WO91/03550 beschrieben. Dabei setzt man herkömmliches Trypsin ein.
  • Beispiel 21: Formulierung der amidierten Insulinderivate
  • Um die erfindungsgemäßen Insulinderivate auf ihre biologisch, pharmakologischen und physikalisch chemischen Eigenschaften zu testen, wurde von den Verbindungen wie folgt eine Lösung hergestellt: Das erfindungsgemäße Insulinderivat wurde mit einer Zielkonzentration von 240 ± 5 μM in 1 mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink (als Zinkchlorid) aufgelöst. Hierzu wurde von dem gefriergetrockneten Material zunächst eine um etwa 30% höhere Menge als aufgrund des Molekulargewichts und der angestrebten Konzentration benötigt eingewogen. Danach wurde die vorliegende Konzentration mittels analytischer HPLC bestimmt und die Lösung anschließend auf das zur Erreichung der Zielkonzentration erforderliche Volumen 5 mM Salzsäure mit 80 μg/mL Zink aufgefüllt. Falls erforderlich, wurde dabei der pH-Wert auf 3,5 ± 0,1 nachjustiert. Nach der endgültigen Analyse durch HPLC zur Absicherung der Zielkonzentration von 240 ± 5 μM wurde die fertige Lösung mittels einer Spritze mit einem 0,2 μm Filtervorsatz in ein mit einem Septum und einer Bördelkappe verschlossenes steriles Fläschchen überführt. Für die kurzfristige, einmalige Testung der erfindungsgemäßen Insulinderivate wurde keine Optimierung der Formulierungen, z. B. hinsichtlich eines Zusatzes isotonischer Agentien, Konservierungsmittel oder Puffersubstanzen, vorgenommen.
  • Beispiel 22: Herstellung von His (A8), Gly (A21), Arg (B31) Humaninsulin mittels Hefeexpression
  • EP-A 1 364 032 beschreibt die Expression und Sekretion eines Fusionsporteins aus Hirudin und Miniproinsulin durch Hefe. Als besonders vorteilhafte Hefewirtsorganismen werden dabei S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha und P. pastoris benannt. In Beispiel 4 der genannten Patentanmeldung ist die Konstruktion eines Plasmides beschrieben, das die Herstellung des Fusionsprotein in P. pastoris erlaubt und dessen DNA als Template zur Herstellung eines Miniproinsulins dient, dessen Aminosäuresequenz in der A-Kette in den Positionen A8, A15, A18 und A21 durch die Aminosäuren Histidin (A8), Glutaminsäure (A15), Asparaginsäure (A18) und Glycin (A21) charakterisiert ist. Verwendet wird der Primer pichia_H_if1. Neu synthetisiert und nach Synthese gereinigt werden folgende Primer:
    Figure 00310001
  • Das fett hervorgehobene Codon markiert die Positionen A 21.
  • Figure 00320001
  • Das fett hervorgehobene Codon markiert die Positionen A 8.
  • Figure 00320002
  • Das fett hervorgehobene Codon markiert die Positionen A 8.
  • Äquimolare Mengen (1 μg) an Primer pichia_G21_rev und Primer pichia_H8f, die sich partial überdecken, werden in Gegenwart einer thermophilen Polymerase und Polymerasepuffer, der die 4 Deoxynukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP 5' enthält, bei 95°C denaturiert, anschließend 10–15 Minuten bei 56°C inkubiert. Das Reaktionsvolumen dieser Reaktion 1 beträgt 25 μl. In einer Standard Polymerasekettenreaktion (Reaktion 2) werden parallel die Primer pichia_H_if1 und pichia-a1-12rev mit der beschriebenen Template DNA umgesetzt. In einer weiteren Polymerasekettenreaktion werden die Reaktionsprodukte der Reaktionen 1 und 2 als Template mit den Primern pichia_H_if1/pichia_G21rev umgesetzt. Das Reaktionsprodukt dieser Reaktion wird mittels Gelelektrophorese gereinigt. Nach Umsetzung mit den Restriktionsenzymen XhoI und SacII wird das DNA-Fragment, welches das Fusionsprodukt überdeckt in, Analogie zu Beispiel 4 in den beschrieben Vektor pPlCZαA eingesetzt. Es entsteht das Plasmid pPIC_ins202. Unter Anwendung des beschriebenen kommerziell erhältlichen Expressions-Kits erfolgt die Expression des von dem Plasmid kodierten Fusionsproteins. Nach Herstellung der His (A8), Gly (A21), Arg (B31)-Humaninsulinvorstufe erfolgt nun die Kupplung von Arginin-Amid entsprechend der Beschreibung an Arginin (B31). Es entsteht die Verbindung His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Insulin, die bereits ein neues Verzögerungsinsulin entsprechend Beispiel 20 darstellt und im Rattenversuch getestet wird.
  • Die Verbindung kann aber auch als Zwischenstufe zur Darstellung der Verbindung Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31) Arg (B32)-NH2-Insulin, die in Anlehnung an Kohn et al. [Peptides 28 (2007) 935–948] hergestellt wird, dienen. Dazu werden 200 mg der Verbindung His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin in 40 ml eines Gemisches von 100 mM Na2HPO4/CH3CN (50:50) gelöst und ein pH von 7,7–8,2 eingestellt.
  • Als weiteres Material wird ein Boc-Arg-NHS Ester hergestellt, indem man 0,3 mM Boc-Arg-OH, 0,4 mM N-hydroxysuccineimide (NHS) und 0,4 mM Dicyclohexylcarbodiimid (DCVC) in Dichlormethan 40 Minuten mischt. Das Reaktionsgemisch wird im Rotationsvakuumverdampfer zur Trockene eingeengt. Das Gemisch wird anschließend in 5 ml Methanol aufgenommen und dem gelösten Ausgangsinsulin zugesetzt. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur mindestens 60, aber maximal 120 Minuten gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 200 μl TFA gestoppt. Die Masse der Reaktionsprodukte wird über LC-MS massenspektroskopisch charakterisiert, um den Nachweis zu erbringen, dass monoacyliertes Produkt, das aus drei Komponenten besteht, vorliegt. Die Komponenten werden über HPLC getrennt. Dabei werden auch di-acylierte und tri-acylierte Nebenprodukte abgetrennt. Die Fraktionen der HPLC-Trennung werden massenspektrokopisch analysiert. Die drei Fraktionen, die jeweils monoacyliertes Produkt enthalten, werden einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen, deren Interpretation die Identifikation der HPLC-Fraktion erlaubt, die die gewünschte Verbindung enthält von der anschließend durch schonende Hydrolyse die Boc-Schutzgruppen entfernt werden. Nach erneuter HPLC-Reinigung wird das gewünschte Produkt auf seine biologischen Eigenschaften getestet.
  • Beispiel 23: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung von neuen Insulinanaloga in der Ratte
  • Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Wistarratten geprüft. Männlichen Ratten wird eine Dosis von 9 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu acht Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich (vgl. 1), dass das erfindungsgemäße Insulinanalogon zu einem deutlich verzögerten Wirkeintritt und einer längeren, gleichmäßigen Wirkdauer führt.
  • Beispiel 24: Evaluierung der blutzuckersenkenden Wirkung von neuen Insulinanaloga im Hund
  • Die blutzuckersenkende Wirkung von ausgewählten neuen Insulinanaloga wird in männlichen, gesunden, normoglykämischen Beaglehunden geprüft. Männlichen Tieren wird eine Dosis von 6 nmol/kg eines Insulinanalogons subkutan injiziert. Unmittelbar vor der Injektion des Insulinanalogons und in regelmäßigen Abständen bis zu achtundvierzig Stunden nach der Injektion werden den Tieren Blutproben entnommen und darin der Blutzuckergehalt bestimmt. Das Experiment zeigt deutlich, dass das erfindungsgemäße Insulinanalogon zu einem deutlich verzögerten, flachen Wirkeintritt und einer längeren, gleichmäßigen Wirkdauer führt.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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    • - EP 1364029 A [0041]
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    • - Peptides 28 (2007) 935–948 [0117]

Claims (30)

  1. Insulinanalogon der Formel I
    Figure 00350001
    wobei A-1 Lys, Arg oder einer Aminogruppe; A0 Lys, Arg oder einer chemischen Bindung; A1 Arg oder Gly; A5 Asp, Glu oder Gln; A15 Asp, Glu oder Gln; A18 Asp, Glu oder Asn; A21 Ala, Ser, Thr oder Gly; B-1 Asp, Glu oder eine Aminogruppe; B0 Asp, Glu oder eine chemische Bindung; B1 Asp, Glu, Phe oder eine chemische Bindung; B3 Asp, Glu oder Asn; B4 Asp, Glu oder Gin; B29 Arg, Lys oder einer Aminosäure ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Aminosäuren Phe, Ala, Thr, Ser, Val, Leu, Glu oder Asp, oder einer chemischen Bindung; B30 Thr oder einer chemischen Bindung; B31 Arg, Lys oder einer chemischen Bindung; B32 Arg-Amid oder Lys-Amid entspricht, wobei nicht mehr als ein Aminosäurerest der Gruppe enthaltend A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 und B4 gleichzeitig und unabhängig voneinander Asp oder Glu entsprechen.
  2. Insulinanalogon gemäß Anspruch 1, wobei A-1 Arg entspricht.
  3. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei A0 Arg entspricht.
  4. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei A5 Glu entspricht.
  5. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei A15 Glu entspricht.
  6. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei A18 Asp entspricht.
  7. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei A8 His entspricht.
  8. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei A21 Gly entspricht.
  9. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B0 Glu entspricht.
  10. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B3 Asp entspricht.
  11. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B4 Glu entspricht.
  12. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B30 Arg entspricht.
  13. Insulinanalogon gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei B30 Lys entspricht.
  14. Insulinanalogon nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13 ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (1330)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Lys (B30)-NH2 Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (1331), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), Asp (A18), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (1331), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), Glu (A15), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin, Arg (A-1), Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-Humaninsulin, Arg (A0), Arg (A1), His (A8), Gly (A21), Lys (B30)-NH2-Humaninsulin, His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2-Humaninsulin.
  15. Verfahren zur Herstellung eines Insulinanalogs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei ein Vorläufer des Insulinanalogs Humaninsulin rekombinant hergestellt wird, der Vorläufer enzmatisch zu zwei-kettigem Insulin prozessiert wird und eine Kupplung mit Argininamid in Gegenwart eines Enzyms mit Trypsinaktivität durchgeführt wird, und das Insulinanalogon isoliert wird.
  17. Verwendung eines Insulinanalogs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes Mellitus.
  18. Verwendung gemäß Anspruch 17 in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes Mellitus Typ I oder Typ II, zur Knorpelregeneration oder zur Unterstützung der beta-Zellregeneration.
  19. Arzneimittel enthaltend ein Insulinanalog gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14.
  20. Formulierung des Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Formulierung in wässriger Form enthaltend das gelöste Insulinanalogon vorliegt.
  21. Formulierung des Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Formulierung in Form von Pulver vorliegt.
  22. Formulierung gemäß Anspruch 21, wobei das Insulinanalogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 in kristalliner und/oder amorpher Form vorhanden ist.
  23. Formulierung des Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Formulierung in Form einer Suspension vorliegt.
  24. Formulierung des Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Formulierung zusätzlich ein chemisches Chaperon enthält.
  25. DNA kodierend für einen Vorläufer eines Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14.
  26. DNA kodierend für die A-Kette eines Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14.
  27. DNA kodierend für die B-Kette eines Insulinanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14.
  28. Vektor enthaltend eine DNA nach einem oder mehreren der Ansprüche 25 bis 27.
  29. Wirtsorganismus enthaltend eine DNA nach einem oder mehreren der Ansprüche 25 bis 27 oder einen Vektor gemäß Anspruch 28.
  30. Präproinsulinanalogon, dadurch gekennzeichnet, dass das C-Peptid an seinem N-Terminus den Aminosäurerest Arginin trägt und sein C-Terminus durch die Form Arg Arg, Arg Lys oder Lys Arg Arg gekennzeichnet ist.
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