TWI433681B - 具有極度延遲時間／作用型態之新穎胰島素衍生物（二） - Google Patents

具有極度延遲時間／作用型態之新穎胰島素衍生物（二） Download PDF

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Description

具有極度延遲時間/作用型態之新穎胰島素衍生物(二)
本發明是有關於具有基礎時間/作用型態的新穎胰島素類似物，它們的製備以及用途。
糖尿病的發生率(incidence)在近年來已上升至一個近乎流行性的程度。該疾病可能造成預期壽命(life expectancy)的一個嚴重縮短。帶有糖尿病的人必須頻繁地爲他們的身體從外面補充胰島素。最適化使用胰島素的治療是實用的。具有專一性藥理學特性的不同胰島素目前是可取得的。實際上，不同的胰島素是依據它們的作用期間(duration of action)而被區分成短效胰島素(short-acting insulins)、速效胰島素(fast-acting insulins)、長效胰島素(long-acting insulins)以及混合型胰島素(mixed insulins)。就長效胰島素而言被同義地使用的命名是慢胰島素(slow insulins)、貯存胰島素(depot insulin)或是基礎胰島素(basal insulin)。在許多這些胰島素產品中的活性成分是所謂的胰島素類似物，其已藉由置換、刪除和/或添加一或多個胺基酸而衍生自人類胰島素。術語“胰島素類似物”以及“胰島素”在這裡被同義地使用。
經強化的胰島素治療的策略嘗試要藉由針對血糖水準的一個穩定控制而透過基礎胰島素的早期投藥來減低健康風險。一個流行的基礎胰島素的一個實例是藥劑蘭德仕medicament)(活性成分：甘精胰島素(insulin glargine)=Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)人類胰島素)。發展新穎、經改良的基礎胰島素的普遍目標是要將低血糖事件(hypoglycemic events)減至最低。就這點而論一個理想的基礎胰島素是一個在每位病患體內確實地作用達至少24小時者。這個胰島素效果理想地具有一個延遲開始(delayed onset)以及一盡可能為淺的時間/作用型態，以使得短暫的低血糖症(hypoglycemia)的風險確實地被減至最低並且投藥甚至可能不需要預先攝取食物。當胰島素效果盡可能長時間地存留於相同的水準時，有一個基礎胰島素的良好補充，亦即身體被補充以一恆定數量的胰島素。低血糖事件的風險因而是低的並且一個病患-與一個天數-專一性的變異性(a patient-and a day-specific variability)被減至最低。因而一理想的基礎胰島素的藥物動力學型態之特徵理應在於作用的一延遲開始以及在於一延遲，亦即長效與一致的作用。
然而-儘管治療利益已經達成-至今沒有所述的慢胰島素顯示出一理想的基礎胰島素的藥物動力學特性。所欲的胰島素具有這樣一個淺的並且長效的時間/作用型態而使得在病患體內的低血糖事件與天數-依賴型變異之風險被進一步降至最低以及作用的期間被更為延長，以至於在某些情況下不再需要每天投藥胰島素。這將使得糖尿病的簡化治療變得可行，特別是年長的糖尿病患者與那些需要照護者(他們不能夠自行注射胰島素)，並且將因而有極大的經濟利益。這樣的基礎胰島素在第2型糖尿病的早期中是額外有幫助的。臨床醫師報導，存在於許多人中的注射恐懼(injection phobia)會遏嚇他們在適合的時間開始胰島素治療。因此，血糖的控制是差的，導致糖尿病的後遺症。一基礎胰島素(其降低藉由注射而被給予的胰島素劑量之數目)可能具有讓病患更能接受胰島素治療的效果。
Kohn等人(Peptides 28(2007)935-948)描述在相較於人類胰島素的等電點(pI=5.6)的鹼性範圍方面，如何藉由製備胰島素類似物(其等電點(pI)是藉由在B鏈末端或在A與B鏈的N端處添加離胺酸或精胺酸而被改變)而將胰島素的藥物動力學予以最佳化，以使得在生理條件下的溶解度被降低以及一個被延長的時間/作用型態結果。來自於Kohn等人的化合物18(Arg(A0),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)人類胰島素(實驗地被決定的pI=7.3；經計算的pI=7.58))就這點而論被描述有如該計畫之全文中的最佳化合物。Kohn等人因此認為將帶正電的胺基酸添加到人類胰島素的胺基酸序列中以將等電點從pI=5.6增高至中性範圍在設計新穎胰島素類似物方面會是主要目標。
然而，現在已驚訝地發現到，被描述的所欲基礎時間/作用型態是利用胰島素類似物而被獲得，該胰島素類似物的特徵在於：
‧B鏈末端由一醯胺化鹼性胺基酸殘基(amidated basic amino acid residue)(諸如離胺酸或精胺醯胺(argininamide))所構成，以及
‧A8胺基酸位置是被一組胺酸殘基所佔據，以及
‧A21胺基酸位置是被一甘胺酸殘基、丙胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基所佔據，以及
‧包含有A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3以及B4之群組中沒有超過一個胺基酸殘基對應於Asp或Glu。
令人驚訝地，所述胰島素類似物精確地具有所欲的有利時間/作用型態而達到理想的，亦即一個延遲的淺的作用開始以及一個較長的作用期間。低血糖事件的風險因而無疑地被減至最低。延遲是這樣地明顯以使得即使在大鼠身上的模型實驗可以令人驚訝地偵測到效果。甘精胰島素的延遲作用相較之下在大鼠中無法被明確地觀察到，有如在第2圖中所顯示的。第1圖顯示本發明的化合物YKL202與203的低血糖效果。在對於大鼠的實驗中所獲得的結果在一對於狗的實驗中被確認。再一次，作用的期間被觀察到要比甘精胰島素所具有者明顯地更長。因而，無疑地需要被投藥較低頻率的新穎基礎胰島素已被提供。除了這些所述的藥物動力學優點之外，本發明的類似物相較於甘精胰島素在藥理學方面顯示出明確較佳的特性。此外，所請求的胰島素亦顯示出在物化方面的優點。
具有式I的胰島素類似物現在已被驚訝地發現
其中A-1對應於Lys、Arg或一胺基基團；A0對應於Lys、Arg或一化學鍵；A1對應於Arg或Gly；A5對應於Asp、Glu或Gln；A15對應於Asp、Glu或Gln；A18對應於Asp、Glu或Asn；A21對應於Ala、Ser、Thr或Gly；B-1對應於Asp、Glu或一胺基基團；B0對應於Asp、Glu或一化學鍵；B1對應於Asp、Glu、Phe或一化學鍵；B3對應於Asp、Glu或Asn；B4對應於Asp、Glu或Gln；B29對應於Arg、Lys或一選自於包含有下列胺基酸的群組的胺基酸：Phe、Ala、Thr、Ser、Val、Leu、Glu或Asp，或一化學鍵；B30對應於Thr或一化學鍵；B31對應於Arg、Lys或一化學鍵；B32對應於Arg-醯胺或Lys-醯胺，其中包含有A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3以及B4之群組中沒有超過一個胺基酸殘基對應於Asp或Glu，該胰島素類似物具有所欲的藥理學型態，亦即作用的一延遲開始以及藉由一更長效與一致的效果。本發明因此是有關於這些胰島素類似物。
本發明進一步是有關於一種如上所述的胰島素類似物，其中包含有A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3以及B4之群組中的一胺基酸殘基對應於Asp或Glu。
本發明進一步是有關於一種如上所述的胰島素類似物，其中，較佳地A-1對應於Arg、A0對應於Arg，A5對應於Glu，A15對應於Glu，A18對應於Asp，A8對應於His，A21對應於Gly，B0對應於Glu，B3對應於Asp，B4對應於Glu，B30對應於Arg或B30對應於Lys。
本發明進一步是有關於一種如上所述的胰島素類似物，其中它是選自於一包含有下列的群組
Arg(A-1),Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Asp(A18),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Asp(A18),His(A8),G1y(A21),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 人類胰島素，Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Asp(A18),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Asp(A18),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Arg(A1),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Arg(A1),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素，His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素。
在所提到的胰島素類似物的命名中，術語“人類胰島素”的詳述是參照人類胰島素的A鏈與B鏈的胺基酸序列，並且出自於其的所有偏差(添加、置換、刪除)在一胰島素類似物的一給定命名中被指明。
本發明進一步是有關於一種用以製備一如上所述之胰島素類似物的方法，其中該胰島素類似物的一前驅物被重組地製備，該前驅物被酵素地加工處理成雙-鏈胰島素，以及一個與精胺醯胺的偶合在一具有胰蛋白酶活性的酵素存在下被執行，並且該胰島素類似物被分離。
本發明進一步是有關於一種如上所述之胰島素類似物供製造一用以治療糖尿病的一藥劑的用途，特別是第I型或第II型糖尿病。
本發明進一步是有關於一種包含有一如上所述之胰島素類似物的藥品(pharmaceutical)。
本發明進一步是有關於一種包含有一如上所述之胰島素類似物的藥品，它在治療上被用於軟骨再生。
本發明進一步是有關於一種包含有如上所述之胰島素類似物的藥品，它在治療上被用於促進貝他細胞再生(beta cell regeneration)。
本發明進一步是有關於一種如上所述之胰島素類似物的調配物，其中該調配物是呈包含有被溶解的胰島素類似物的水性形式(aqueous form)。
本發明進一步是有關於一種如上所述之胰島素類似物的調配物，其中該調配物是呈粉末的形式，特別地呈結晶和/或無定形形式。
本發明進一步是有關於一種如上所述之胰島素類似物的調配物，其中該調配物是呈一懸浮液的形式。
本發明進一步是有關於一種如上所述之胰島素類似物的調配物，其中該調配物額外地包含有一化學伴隨蛋白(chaperone)。
本發明進一步是有關於一種編碼如上所述之胰島素類似物的一前驅物的DNA。
本發明進一步是有關於一種編碼如上所述之胰島素類似物的A鏈的DNA。
本發明進一步是有關於一種編碼如上所述之胰島素類似物的B鏈的DNA。
本發明進一步是有關於一種包含如上所述之DNA的載體。
本發明進一步是有關於一種包含如上所述之DNA或一如上所述之載體的宿主生物。
本發明進一步是有關於一種前原胰島素類似物(preproinsulin analogue)，其中C肽在它的N端帶有胺基酸殘基精胺酸並且它的C端的特徵在於形式Arg Arg、Arg Lys或Lys Arg Arg。
本發明進一步是有關於一種如上所述的調配物，其額外地包含有一類升糖素肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)或其一類似物或衍生物，或艾塞那肽-3(exendin-3)或-4或其一類似物或衍生物，較佳地艾塞那肽-4。
本發明進一步是有關於一種如上所述的調配物，其中艾塞那肽-4的一類似物是選自於一包含有下列的群組
H-desPro36 -艾塞那肽-4-Lys6 -NH2 ，H-des(Pro36,37 )-艾塞那肽-4-Lys4 -NH2 以及H-des(Pro36,37 )-艾塞那肽-4-Lys5 -NH2 ，或其一藥理學上可耐受的鹽類。
本發明進一步是有關於一種如上所述的調配物，其中艾塞那肽-4的一類似物是選自於一包含有下列的群組
desPro36 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)，desPro36 [IsoAsp28 ]艾塞那肽-4(1-39)，desPro36 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)，desPro36 [Met(O)14 ,IsoAsp28 ]艾塞那肽-4(1-39)，desPro36 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-2(1-39)，desPro36 [Trp(O2 )25 ,IsoAsp28 ]艾塞那肽-2(1-39)，desPro36 [Met(O)14 Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)以及desPro36 [Met(O)14 Trp(O2 )25 ,IsoAsp28 ]艾塞那肽-4(1-39)，或其一藥理學上可耐受的鹽類。
本發明進一步是有關於一種如在前段中所述的調配物，其中該肽-Lys6 -NH2 被接附至艾塞那肽-4的類似物的C端。
本發明進一步是有關於一種如上所述的調配物，其中艾塞那肽-4的一類似物是選自於一包含有下列的群組
H-(Lys)6 -des Pro36 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 des Asp28 Pro36 ,Pro37 ,Pro38 艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ,H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 ，H-des Asp28 Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 ，des Met(O)14 Asp28 Pro36 ,Pro37 ,Pro38 艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 ，des Asp28 Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36, Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，或其一藥理學上可耐受的鹽類。
本發明進一步是有關於一種如上所述的調配物，其額外地包含有Arg34 ,Lys26 (Nε (γ-麩胺醯基(Nα -十六醯基)))GLP-1(7-37)[利拉魯肽(liraglutide)]或其一藥理學上可耐受的鹽類。
就這點而論對於一熟習技藝者來說清楚的是，本發明的胰島素可以是一藥學調配物的項目，其在投藥之後具有一有利的效果。水溶液就這點而論是起點。更多的成分因此必須是互溶的。病毒動物污染的風險會因為製劑不應該包含有任何衍生自動物來源的成分而被減至最低。更有利的是藉由添加防腐劑來防止微生物污染。藉由添加等張劑來抵銷該調配物在投藥位置處對於組織細胞之生理學的可能負面效果是可行的。魚精蛋白(protamine)的添加可能具有一安定效果，以使得本質上無鹽的胰島素製劑可以藉由將魚精蛋白添加至調配物中而被獲得。一酚成分的添加可能會造成所使用之胰島素類似物的結構的安定並且因而另外引起尤其是對於作用開始的延遲效果。將會穩定本發明之慢胰島素的空間結構並且造成更佳的熱安定性的物質添加至調配物中亦是可行的。此等化學帶位子可以是例如短的合成肽，其亦可能包含有胺基酸類似物或包括例如衍生自胰島素之C肽的肽序列。
本發明的胰島素可以被併入奈米粒子以供發展成貯存形式(depot forms)。亦可理解的是所謂緩慢釋放調配物(其中存在有本發明的慢胰島素)是可逆地被結合至一聚合物載體。
本發明的胰島素可以與速效胰島素(諸如、、或正在經歷發展中的胰島素衍生物或具有一適當的時間/作用型態的調配物)或可吸入胰島素或經鼻地或口服地被投藥的胰島素(其正在經歷發展中)來平行地被投藥。就這點而論對於一熟習技藝者將為清楚的是，速效以及本發明的慢胰島素的適當調配物混合物可以被用於這個目的。本發明的胰島素類似物可進一步被用在藥學製劑中，該藥學製劑包含有被描述為一活性可比擬GLP-1(類升糖素肽-1)或艾塞那肽-4或艾塞那肽-3的肽。GLP-1(7-37)、艾塞那肽()或肽(其製劑被描述於專利申請案WO 2006/058620、WO 2001/04156、WO 2004/005342以及WO 98/08871)代表此等肽的實例。在這點而論尤為有利的調配物是那些包含有這些肽的一貯存調配物者。在第II型糖尿病的初期特別有利的治療類型是那些與本發明的藥品的投藥平行地被提供者(諸如，例如甲福明(metformin))，其會增高胰島素的效果。與二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4)抑制劑(其會增高腸促胰液素(incretins)的水準)的組合治療會盡可能地像是與磺醯尿素(sulfonylureas)(其在胰臟中會增高胰島素分泌)的組合。當貝他細胞從適當的幹細胞中的再生藉由分化因子的投藥而被起始時，本發明的慢胰島素可以特別有利地而被採用。所有這些應用是藉著有關糖尿病的治療為例而被提及，並且本發明亦與其相關。本發明因而進一步是有關於本發明的胰島素組合其他用於治療糖尿病(特別是第I型或第II型的糖尿病)之活性成分的用途。
本發明亦是有關於本發明之胰島素在有關於與骨骼相關之再生過程(諸如，例如軟骨再生)中的用途。在這個用途中要控制使用胰島素的細胞分裂潛力而不會同時引起一個嚴重的代謝反應是重要的。
本發明進一步是有關於一種藥品，其包含有本發明的一類似物，其特別地表現一水性調配物或一粉末。
該藥品是一種藥學製劑，其較佳地是一用於注射目的之溶液或懸浮液；其特徵在於本發明的至少一胰島素類似物的一含量，和/或其至少一生理學上可耐受的鹽類呈溶解的，無定形和/或結晶-較佳地呈溶解的-形式。
該製劑在無菌水溶液中較佳地具有一介於大約2.5至8.5的pH，特別地介於4.0與8.5，它包含有一適當的張力劑(tonicity agent)、一適當的防腐劑以及，若適當的話，一適當的緩衝劑，並且亦較佳地一特定的鋅離子濃度。除了活性成分以外的製劑成分的總體形成製劑載體。適當的張力劑是例如甘油、葡萄糖、甘露糖醇、NaCl、鈣或鎂化合物(諸如CaCl2 等等)。本發明之胰島素或其生理學上可耐受的鹽類的溶解度在弱酸性pH值下是受到張力劑和/或防腐劑的選擇所影響。
適當的防腐劑的實例是酚、m-甲酚、苯甲醇和/或p-對羥苯甲酸酯。
可以特別被用於調整一pH介於大約4.0與8.5之間的緩衝物質是例如醋酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉等等。除此之外，生理學上可接受的稀酸(典型地HCl)或鹼(典型地NaOH)亦適用於調整pH。
若該製劑具有一鋅含量，偏好是給予從1μg/ml至2mg/ml的一者，特別地從1μg/ml至200μg鋅/ml。本發明之胰島素類似物的作用型態令人驚訝地是藉由添加Zn而被令人滿意地影響。這容許生產在作用的總期間、作用開始的速度以及效果曲線的型態上有所不同的製劑並且因而容許病患的個別安定。
爲了要改變本發明之製劑的活性成分型態，混合未經修飾的胰島素(較佳地牛、豬或人類胰島素，特別是人類胰島素)或其胰島素類似物與衍生物亦是可行的。混合一或多個艾塞那肽-4衍生物或肽(其特徵在於一與GLP-1(類升糖素肽-1)可相比擬的活性)亦是可行的。本發明亦有關於此等藥品(製劑)。
被偏好的活性成分濃度是那些對應於大約1-1500，更佳地大約5-1000以及特別地大約40-400國際單位/ml者。
本發明的胰島素類似物起初地有如前驅物而被生物技術地製備，該前驅物尚未包括醯胺。習於技藝者熟悉一大數目的有關製備胰島素的可能性。所使用的宿主細胞系統就這點而論是藉由發酵以供用於培育的細菌、真菌以及植物或植物細胞。若費用考量允許的話，使用動物細胞作為宿主系統的表現系統亦是可推想的。然而，針對其的先決條件是要確實沒有動物病毒。因此明顯的是，藉由實例而被描述的表現系統僅表現被發展出的宿主/載體系統的一小片段以供蛋白質的重組製備。舉例來說，以真菌或植物系統(諸如苔蘚、藻類或高等植物(諸如菸草、豌豆、紅花、大麥、玉米或歐洲油菜))為基礎的生物技術方法並未被描述在申請案中。然而，本發明亦包括宿主/載體系統以及容許目標肽在適當的生物技術表現系統中被製備的編碼DNA序列。宿主生物因而可以特別選自於植物界，來自於包含有裂殖菌類(Schizomycetes)、細菌或藍藻的第一分類裂殖植物(Schizophyta)的生物、來自於第二分類藻類門(Phycophyta)第V綱綠藻綱(Chlorophyceae)的生物、第二分類藻類門第VII綱紅藻綱(Rhodophyceae)的生物、第三分類黏菌類(Mycophyta)的生物、第五分類苔蘚類(Bryophyta)的生物以及第七分類種子植物門(Spermatophyta)的生物。
歐洲專利申請案EP-A 1 222 207描述一種質體pINT358d，其編碼有關一種包括一經修飾之C肽的前原胰島素。在聚合酶鏈反應(PCR)的協助下來專一地修飾原胰島素-編碼序列是可行的，以使得表現可當作本發明之胰島素的前驅物的前原胰島素是可行的。對應的融合蛋白不必然地需要被細胞內地製備。對於熟習技藝者來說明顯的是，此等蛋白質也可以藉由具有隨後分泌至胞外質(periplasm)中和/或至培養物上清液中的細菌表現而被製備。歐洲專利申請案EP-A 1 364 029藉由實例來描述此者。本發明亦有關於會致使本發明之類似物的原胰島素前驅物。
以這個方法來製備的原胰島素原則上可以被轉換成一胰島素類似物前驅物，其在位置A0包括離胺酸或精胺酸並且在B鏈的C端末端帶有離胺酸或精胺酸。若離胺酸或精胺酸不是已經存在的，另擇地將帶正電的胺基酸半合成地添加至A鏈的N端是可行。
若本發明的原胰島素在細菌中的細胞內表現之後呈包涵體(inclusion bodies)的形式或可溶解的形式，這些前驅物必須藉由活體外摺疊而在加工處理與生化修飾可以被進行之前被摺疊成正確的構形。就此點而論，所述的融合蛋白容許在變性之後藉由尿素或胍鹽酸鹽(guanidinium hydrochloride)來直接摺疊，並且本發明亦有關於摺疊中間產物。
生化方法被用來濃縮個別的中間產物，特別是其基本原則已被公開並且事實上在教科書之題材內的分離步驟。對於熟習技藝者來說為清楚的是，此等原則可以因此被組合並且因而可能造成先前尚未按照它們的順序而被發表的步驟。本發明因而亦有關於造成本發明之類似物的純化的方法。
本發明進一步是有關於一種用以製備本發明之胰島素類似物的方法，其中該胰島素類似物的一前驅物是重組地被製備並且被酵素地轉換成一個雙-鏈胰島素前驅物，該雙-鏈胰島素前驅物在N端帶有關於A鏈之胺基酸1的精胺酸或離胺酸，並且在B鏈的C端末端具有一離胺酸或精胺酸殘基，該離胺酸或精胺酸殘基在一具有胰蛋白酶活性之酵素存在下使用精胺醯胺或離胺醯胺而被轉換成醯胺並且因而成為本發明的慢胰島素，並且藉由一生化純化方法而以高純度來被製備。
經由至少一天然存在的胺基酸殘基藉由其他胺基酸殘基的置換和/或至少一胺基酸殘基的添加和/或刪除而與對應的、相同之天然存在蛋白質而有所不同的蛋白質被意指為蛋白質的“類似物”。就此點而論，對於被添加和/或被置換的胺基酸殘基來說成為不是天然存在者是可行的。
藉由起始蛋白質的特定胺基酸殘基的化學修飾而被獲得的蛋白質被意指為蛋白質的“衍生物”。化學修飾可能例如由將一或多個特定化學基團添加至一或多個胺基酸所構成。
下列實例意欲要說明本發明的概念但就此點而論不具有一限制效果。
實例1：製備編碼有關Gly(A21)-胰島素以及一在C/A鏈邊界處帶有Arg Arg之經修飾的C肽的載體衍生物pINT3580
歐洲專利申請案EP-A 1 222 207描述質體pINT358d、pINT91d以及引子序列Tir。這些產物的DNA被用來建構質體pINT3580。此外該質體pINT358d的特徵在於一編碼有關一具有特定特性之經修飾的C肽的基因序列。三個引子序列被合成：
pint3580_glya21rev
5' -CAAAGGTCGACTATTA GCC GCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3' (序列辨識編號：3)
這個引子在加工之後可以在由pINT358d所編碼之原胰島素序列的A鏈的位置21引入甘胺酸(粗體，底線)來代替天門冬醯胺酸。
arg_cjuncf
5' -GTCCCTGCAGCGT CGCGGCATCGTGGAGCAG-3' (序列辨識編號：4)
這個引子類似引子arg_cjunc_rev可以用於將精胺酸引入胰島素A/B鏈邊界來代替離胺酸。
arg_cjunc_rev
5' -CCACGATGCC GCGACG CTGC AGGGACCCCT CCAGCG-3' (序列辨識編號：5)
有關於要被引入的精胺酸的密碼子在兩個引子中是呈粗體印刷。一個PCR是依據歐洲專利申請案EP-A 1 222 207而使用引子對Tir/arg_cjunc_rev以及arg_cjuncf/pint3580_glya21rev的各者並且使用質體pINT358d的DNA作為模版而被執行。兩個反應的產物的部分被組合並且在一個第三PCR中使用引子對Tir/pint3580_glya21rev而被一起採用。這個反應的產物在反應混合物藉由凝膠電泳的分離之後被純化並且依據製造商的操作指南在一個以及相同的反應中使用限制酵素Sal1/Nco1予以消化，反應混合物藉由凝膠電泳而被分離，並且編碼原胰島素序列的DNA片段被分離。該片段接著藉由一DNA接合酶反應而被插入至NCo1/Sal1-打開的pINT91d載體DNA。
接合混合物被用來轉形勝任E. Coli細菌細胞。轉形混合物被取出到在含有25mg/l安比西林的選擇平盤上。質體DNA從菌落被分離且藉由DNA序列分析而被特徵鑑定。正確的質體被稱為pINT3580。
實例2：建構編碼有關His(A8),Gly(A21)-前原胰島素的質體pINT3581
建構有如在實例1中所描述的藉由3個聚合酶鏈反應而發生。第三個反應的產物在Nco1/Sal1切割之後被插入至Nco1/Sal1-打開的pINT91d載體DNA。引子Tir以及pint3580_glya21rev被使用。兩個另外的引子被合成：pint3580_Ha8f
5’-AGCAGTGCTGCCAC AGCATCTGCTCCCTCTAC-3’(序列辨識編號：6)
pint3580_Ha8rev
5’-GAG CAGATGCTGTG GCAGCACTG CTCCACGATG-3’(序列辨識編號：7)
編碼有關在A鏈的位置8之組胺酸的密碼子藉由在各個例子中的粗體而被強調。建構有如在實例1中所描述的被執行。用於PCR1與2的模版為質體pINT3580的DNA。PCR1是使用引子對Tir/pint3580_Ha8rev而被執行以及PCR2是使用引子對pint3580_Ha8f/pint3580_glya21rev而被執行。引子對Tir/pint3580_glya21rev 在PCR3中被採用。在這個例子中模版是PCR1與PCR2的反應產物的一混合物。正確的質體被稱為pINT3581。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與精胺醯胺的醯胺化之後產生。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202b的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
實例3：建構編碼有關His(A8),Glu(A5),Gly(A21)-前原胰島素的質體pINT3582
建構有如在實例1與2中所描述的藉由3個聚合酶鏈反應而發生。第三個反應的產物在Nco1/Sal1切割之後被插入至Nco1/Sal1-打開的pINT91d載體DNA。引子Tir以及pint3580_glya21rev被使用。兩個另外的引子被合成。
pint3581_Ea5f
5' GCATCGTGGAGGAG TGCTGCCACAGCATCTG3' (序列辨識編號：8)
pint3581_Ea5rev
5’-CTGT GGCAGCACTC CTCCACGATG CCGCGACG-3’(序列辨識編號：9)
編碼有關在A鏈的位置5的麩胺酸的密碼子藉由在各個例子中的粗體而被強調。建構有如在實例1中所描述的被執行。模版是質體pINT3581的DNA。正確的質體被稱為pINT3582。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-1的前驅物，其特徵在於Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與精胺醯胺的醯胺化之後產生。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-1b的前驅物，其特徵在於Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
實例4：建構編碼有關His(A8),Asp(A18),Gly(A21)-前原胰島素的質體pINT3583
建構是藉由透過僅有一個聚合酶鏈反應的發生而不同於實例1。這個反應的產物在Nco1/Sal1切割之後被插入至Nco1/Sal1-打開的pINT91d載體DNA。引子Tir被使用。一個另外的引子被合成：
pint3580_Da18rev
5' CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTC CTCCAGCTGGTAGAGGGAG 3' (序列辨識編號：10)
編碼有關在A鏈的位置18的天門冬醯胺酸的密碼子藉由粗體而被強調。模版是質體pINT3581的DNA。正確的質體被稱為pINT3583。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202的前驅物，其特徵在於Arg(A0),Asp(A18),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與精胺醯胺的醯胺化之後產生。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-2b的前驅物，其特徵在於Arg(A0),Asp(A18),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
實例5：建構編碼有關His(A8),Glu(A15),Gly(A21)-前原胰島素的質體pINT3585
建構是藉由透過僅有一個聚合酶鏈反應的發生而不同於實例1。這個反應的產物在Nco1/Sal1切割之後被插入至Nco1/Sal1-打開的pINT91d載體DNA。引子Tir被使用。一個另外的引子被合成：
pint3580_Ea15rev
5' -CAAAGGTCGA CTATTAGCCG CAGTAGTTCTCCAGCTC GTA GAGGGAGCAGATGCTG-3' (序列辨識編號：11)
編碼有關在A鏈的位置15的麩胺酸的密碼子藉由粗體而被強調。模版是質體pINT3581的DNA。正確的質體被稱為pINT3585。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-3的前驅物，其特徵在於Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與精胺醯胺的醯胺化之後產生。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-3b的前驅物，其特徵在於Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
實例6：建構編碼有關His(A8),Gly(A21),Asp(B3)-前原胰島素的質體pINT3588
建構有如在實例1與2中所描述的藉由3個聚合酶鏈反應而發生。第三個反應的產物在Ncol/Sall切割之後被插入至Nco1/Sal1-打開的pINT91d載體DNA。引子Tir以及pint3580_glya21rev被使用。兩個另外的引子被合成：
pint3581_Db3f
5' -GCACGATTTGTGGAC CAGCACCTGTGCGGC-3' (序列辨識編號：12)
pint3581_Db3rev
5' -CACAGG TGCTGGTC CA CAAATCGTGC CGAATTTC-3' (序列辨識編號：13)
編碼有關在B鏈的位置3的天門冬醯胺酸的密碼子藉由在各個例子中的粗體而被強調。建構有如在實例1中所描述的被執行。模版是質體pINT3581的DNA。正確的質體被稱為pINT3588。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-4的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與精胺醯胺的醯胺化之後產生。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-4b的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
實例7：建構編碼有關His(A8),Gly(A21),Glu(B4)前原胰島素的質體pINT3593
建構有如在實例1與2中所描述的藉由3個聚合酶鏈反應而發生。第三個反應的產物在Nco1/Sal1切割之後被插入至Nco1/Sal1-打開的pINT91d載體DNA。引子Tir以及pint3580_glya21rev被使用。兩個另外的引子被合成：
pint3581_Eb4f
5' -ACGATTTGTGAACGAG CACCTGTGCGGCTC-3' (序列辨識編號：14)
pint3581_Eb4rev
5' -CGCACAGG TGCTC GTTCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3' (序列辨識編號：15)
編碼有關在胰島素B鏈的位置4的麩胺酸的密碼子藉由粗體而被強調。建構有如在實例1中所描述的被執行。模版是質體pINT3581的DNA。正確的質體被稱為pINT3593。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-5的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與精胺醯胺的醯胺化之後產生。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-5b的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
實例8：建構編碼有關His(A8),Gly(A21),Glu(B0)-前原胰島素的質體pINT3597
建構是藉由2個聚合酶鏈反應而發生。引子pint3580_glya21rev被使用。兩個另外的引子被合成：
pint3581_Eb0f1
5' -CAACAGGAA ATTCGGCACG AGAG TTTGTG AACCAGCACC TGTG-3’(序列辨識編號：16)
pint3581_Eb01f2
5' -TATCGACCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCACG AGAG -3’
(序列辨識編號：17)
在這個例子中兩個引子有部分重疊。Pint3581_Eb0f2含有一個NcoI辨識序列。這被畫上底線。編碼有關在B鏈起始處的位置0的麩胺酸的密碼子藉由在各個例子中的粗體而被強調。用於PCR1的模版是質體pINT3581的DNA。
PCR1是使用引子對pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev而被執行。用於PCR2的模版是來自於PCR1的產物。PCR2是使用引子對pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev而被執行。來自於PCR2的產物涵蓋完整的前原胰島素序列。第二個反應的產物在Ncol/Sall切割之後被插入至Ncol/Sall-打開的pINT91d載體DNA。正確的質體被稱為pINT3597。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-6的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與精胺醯胺的醯胺化之後產生。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-6b的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，並且其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
有關於藉由天門冬醯胺酸的密碼子以及下列的實例來置換有關在位置B0的麩胺酸造成在位置B0有天門冬醯胺酸取代麩胺酸的質體。
實例9：建構編碼有關His(A8),Gly(A21),Lys(B0)-前原胰島素的質體pINT3700
建構是用來將有關離胺酸的密碼子引入B鏈的前序列與起始之間的邊界處以替代有關精胺酸的密碼子。
建構是藉由2個聚合酶鏈反應而發生。引子pint3580_glya21rev被使用。兩個另外的引子被合成：
pint3581_Eb0f1
5' -CAACAGGAA ATTCGGCAAAG TTTGTG AACCAGCACC TGTG-3(序列辨識編號：18)
pint3581_Eb01f2
5' -TATCGA CCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCAGAG -3’(序列辨識編號：19)
在這個例子中兩個引子有部分重疊，並且pint3581_Eb0f2含有_個NcoI辨識序列。這被畫上底線。編碼有關在B鏈起始處的位置0的麩胺酸的密碼子藉由在各個例子中的粗體而被強調。用於PCR1的模版是質體pINT3581的DNA。PCR1是使用引子對pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev而被執行。用於PCR2的模版是來自於PCR1的產物。PCR2是使用引子對pint3581_Eb_1f2/pint3580_glya21rev而被執行。來自於PCR2的產物涵蓋完整的前原胰島素序列。第二個反應的產物在Nco1/Sal1切割之後被插入至Nco1/Sal1-打開的pINT91d載體DNA。正確的質體被稱為pINT3700。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素的前驅物。該化合物藉由起初透過與胰蛋白酶與離胺醯基內肽酶C的反應來製備中間產物Thr(B30)-人類胰島素的Arg(A0),His(A8),Gly(A21)，它的中間產物接著藉由與精胺醯胺的醯胺化而被轉換成所欲的化合物YKL202-7，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-7b的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素，並且其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
實例10：建構編碼有關Gly(A21),Lys(B0)-前原胰島素的質體pINT3701
建構是用來將有關離胺酸的密碼子引入B鏈的前序列與起始之間的邊界處來替代有關精胺酸的密碼子。依據來自於實例9中的建構策略但是使用質體pINT358d的DNA作為模版用於PCR1而造成質體pINT3701，類似於原來的質體pINT358d，其特徵在於介於C肽與A鏈之間的邊界是藉由胺基酸序列Lys-Arg而被形成。
實例11：依據實例10來建構編碼有關帶有C肽之His(A8),Gly(A21),Lys(B0)-前原胰島素的質體pINT3602
依據實例2中所描述的建構計畫但是使用質體pINT3701的DNA作為模版而造成質體pINT3702。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素的前驅物。該化合物藉由起初透過僅與離胺醯基內肽酶C的反應來製備中間產物Thr(B30)-人類胰島素的Arg(A0),His(A8),Gly(A21)，它的中間產物接著藉由與精胺醯胺的醯胺化而被轉換成所欲的化合物YKL202-8，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物YKL202-8b的前驅物，其特徵在於Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素，並且其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
實例12：建構編碼有關His(A8),Gly(A21),Lys(B0)-前原胰島素以及一在C/A鏈邊界處帶有三肽Lys-Arg-Arg之經修飾的C肽的質體衍生物pINT3703
質體pINT3702的DNA被用作為模版，以及引子pint3580_glya21rev與Tir被使用。兩個引子序列被合成：3702_arg_cjuncf
5' -TGC AGAAGCGCAGA GGCATCGTG GAGCAGTGC-3(序列辨識編號：20)
這個引子像是引子arg_cjunc_rev用於將精胺酸引入胰島素A/C鏈邊界處。
3702_cjunc_rev
5' -TCC ACGATGCCTCTGCGCTTCTG CAGGGACCC-3’(序列辨識編號：21)
有關於要被引入的精胺酸的密碼子在兩個引子中是呈粗體印刷。一個PCR是依據歐洲專利申請案EP-A 1 222 207而使用引子對Tir/3702_cjunc_rev以及3702_arg_cjuncf/pint3580_glya21rev的各者並且使用質體pINT3702的DNA作為模版而被執行。兩個反應的產物的部分被組合並且在一個第三PCR中使用引子對Tir/pint3580_glya21rev而被一起採用。第三個反應的產物在反應混合物藉由凝膠電泳的分離之後被純化並且依據製造商的操作指南在一個以及相同的反應中使用限制酵素Sall/Ncol予以消化，反應混合物藉由凝膠電泳而被分離，並且編碼原胰島素序列的DNA片段被分離。該片段接著藉由一DNA接合酶反應而被插入至Ncol/Sall-打開的pINT91d載體DNA。
接合混合物被用來轉形勝任E. coli細菌細胞。轉形混合物被取出到含有25mg/l安比西林的選擇平盤上。質體DNA從菌落被分離且藉由DNA序列分析而被特徵鑑定。正確的質體被稱為pINT3702。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素的前驅物。該化合物藉由起初透過與離胺醯基內肽酶C的反應來製備中間產物Thr(B30)-人類胰島素的Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21)，並且該中間產物接著藉由與精胺醯胺的醯胺化而被轉換成所欲的化合物。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素的前驅物，其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
對於熟習技藝者而言為清楚的是，天門冬醯胺酸或麩胺酸可以依據實例3-8而被引入A或B鏈的適當位置。這些原胰島素是有關下列化合物的前驅物：
實例13：製備編碼有關His(A8),Gly(A21),Lys(B0)-前原胰島素的質體衍生物pINT3704
這個實例說明質體衍生物pINT3704的製備，該質體衍生物pINT3704編碼有關His(A8),Gly(A21),Lys(B0)-前原胰島素，以及一經修飾之C肽(其在C/A鏈邊界處帶有三肽Lys-Arg-Arg)，並且其中出現在人類胰島素之位置A21的胺基酸甘胺酸被刪除。
依據在實例12中所描述的合成方案並且將引子3702_arg_cjuncf與3702_arg_cjuncfrev置換以引子3703_ΔGalf與3703_ΔGalrev並且使用質體pINT3703的DNA作為模版而造成質體pINT3704，其中在A鏈的位置1的胺基酸甘胺酸在所編碼的前原胰島素中被刪除，並且序列的剩餘順序對應於那個由pINT3703所編碼之序列者。
3703_ΔGalf
5’-TGC AGAAGCGCAGA ATCGTG GAGCAGTGCTGC-3’(序列辨識編號：22)
3703_ΔGalrev
5' -TGCTCC ACGATTCT GCGCTTCTG CAGGGACCC-3' (序列辨識編號：23)
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物Arg(A0),Arg(A1),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素的前驅物。該化合物藉由起初透過與離胺醯基內肽酶C的反應來製備中間產物des Thr(B30)-人類胰島素的Arg(A0),Arg(A1),His(A8),Gly(A21)，並且該中間產物接著藉由與精胺醯胺的醯胺化而被轉換成所欲的化合物。
由該質體所編碼的前原胰島素是有關化合物Arg(A0),Arg(A1),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素的前驅物，其在與離胺醯胺的醯胺化之後產生。
對於習於技藝者來說清楚的是，帶負電的胺基酸可以依據實例12而被引入前原胰島素序列。類似於實例13而從質體pINT3702來製備一個編碼有關允許製備在A鏈的位置1帶有精胺酸作為N-端胺基酸的胰島素衍生物之原胰島素序列亦是可行的。
實例14：原胰島素衍生物的表現
表現是依據歐洲專利申請案EP-A 1 222 207的實例1而被執行。
實例15：原胰島素衍生物的摺疊
摺疊原則上是藉由在EP-A 0 668 282中所描述的方法而發生。
實例16：使用胰蛋白酶來加工處理源自於實例2-8的原胰島素
經摺疊的前原胰島素被酵素地加工處理以給予雙-鏈Arg(A0)-胰島素前驅物，其C端B鏈末端的特徵在於離胺酸或精胺酸。經摺疊的前原胰島素的酵素加工處理有如例如在WO91/03550的實例4中所描述的發生。在這個例子中採用在WO 2007/031187 A1中所描述的胰蛋白酶變異體被證實是特別有利的。
實例17：使用核菌蛋白酶(endoproteinase)Lyx-C來加工處理源自於實例9-13的原胰島素
來自於無色菌(Achromobacter lyticus)。的核菌蛋白酶Lyx-C是商業上可取得的(Merck/Calbiochem)。該反應是在略為修飾的情況下有如Jekel,P. A. et al[Anal. Biochem. 134,347-354,(1983)]所描述的被執行。一為9.5的pH被設定，並且反應溫度為30℃。
在一鍋反應中，前序列被排除並且以Thr(B30)來起始的C肽被切除，以使得B鏈的C端末端是由離胺酸所形成，其有如用於酵素-催化的偶合反應之反應位置而存在。
實例18：藉由與精胺-或離胺醯胺的偶合而從雙-鏈前驅物來製備Arg-NH2 或Lys-NH2 胰島素化合物
不問額外的酸性胺基酸的定位，一個標準反應如下被執行：100mg的Arg(A0),Gly(A21),Arg(B31)-胰島素類似物被溶解於0.95ml的精胺醯胺溶液(446g/L)中，並且0.13mL的M Na醋酸緩衝液(pH 5.8)與2ml的DMF被添加。反應混合物被冷卻至12℃並且藉由添加0.094ml的胰蛋白酶(0.075mg,Roche Diagnostics)而被開始。反應在8小時後藉由添加TFA達至pH 2.5而被停止並且藉由HPLC而被分析。有>60% Arg(A0),Gly(A21),Arg(B31).Arg(B32)-NH2 -人類胰島素的形成。胰蛋白酶抑制劑溶液的添加繼而是類似於US 5,656,722的經醯胺化之類似物的純化。
對應的離胺醯胺化合物的製備類似地發生。然而，在溶液中含有366g/L離胺醯胺的一水性離胺醯胺原液形成起始材料。
實例19：半合成製備Lys(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-胰島素醯胺
在實例11中所描述的化合物YKL202-8(其對應於一種具有結構Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-胰島素醯胺的胰島素衍生物)作為用以製備化合物YKL-11 Lys(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-胰島素醯胺的起始材料。200mg的化合物被溶解於40ml的一100mMNa2 HPO4 /CH3 CN(50:50)混合物並且一為7.7-8.2的pH被設定。作為更多的材料，一Boc-Lys(Boc)-NHS酯是藉由在二氯甲烷中混合0.3mM Boc-Lys(Boc)-OH、0.4mM N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與0.4mM二環己碳二亞胺達40分鐘而被製備。反應混合物在一旋轉真空蒸發器中被濃縮至乾燥。混合物接著被取至5ml的甲醇中並且被添加至被溶解的起始胰島素。反應在室溫下被攪拌達至少60，但至多120分鐘。反應是藉由添加200μl的TFA而被停止。反應產物的質量的特徵是藉由LC-MS光譜法而被鑑定以證明經單醯化的產物(由3個成分所構成)存在。成分是透過HPLC而被分離。在這個期間，雙醯化以及三醯化的副產物亦被移除。源自於HPLC分離的部分是藉由質譜儀而被分析。各自含有單醯化產物的3個部分被進行一胺基酸序列分析，其表現容許鑑定出含有所欲化合物的HPLC部分，來自於該化合物Boc保護基團接著藉由水解而被移除。在更新的HPLC純化之後，所欲的產物被測試有關它的生物特性。
實例20：製備編碼有關His(A8),Gly(A21)原胰島素的質體pINT358_ha8
依據來自於實例2的製備方案並且使用質體pINT358d的DNA作為模版用於PCR1與PCR2而造成質體pINT358_ha8，其編碼有關His(A8),Gly(A21)原胰島素。由該質體所編碼的原胰島素作為有關具有形式His(A8).Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素之化合物的前驅物。在醯胺化之前加工處理該前原胰島素以給予His(A8),Gly(A21),Arg(B31)作為中間產物在這個例子中是有如在WO91/03550中所描述的發生。習知的胰蛋白酶在這個例子中被採用。
實例21：經醯胺化的胰島素衍生物的調配物
爲了要試驗本發明之胰島素衍生物有關它們的生物藥理學以及物理化學特性，化合物的一溶液如下被製備：本發明的胰島素衍生物被溶解於一具有80μg/mL鋅的1mM鹽酸(有如氯化鋅)中而具有一為240±5μM的目標濃度。爲了這個目的，起初一數量的冷凍乾燥材料(其比所需要的高出大約30%)依據分子量以及所欲的濃度而被秤出。目前的濃度接著藉由分析HPLC而被決定並且該溶液隨後被作成要達到具有5mM鹽酸(具有80μg/mL鋅)之目標濃度所需的體積。若需要的話，pH被再調整至3.5±0.1。在藉由HPLC的最後分析以確認目標濃度為240±5μM之後，完成的溶液藉由一具有0.2μm過濾器接頭的注射器被轉移至一無菌管(其被一個隔片以及一捲曲蓋所封閉)中。對於本發明之胰島素衍生物的短期單一試驗而言，沒有調配物的最佳化(例如，關於等張劑、防腐劑或緩衝物質的添加)被執行。
實例22：藉由酵母菌表現來製備His(A8),Gly(A21),Arg(B31)人類胰島素
EP-A 1 364 032描述藉由酵母菌之一具有水蛭素(hirudin)以及小原胰島素(miniproinsulin)的融合蛋白的表現以及分泌。就這點而論被提到是尤為有利的酵母菌宿主生物是啤酒酵母菌、乳酸克魯維斯酵母(K. lactis)、漢森酵母(H. polymorpha)以及巴氏畢赤酵母(P. pastoris)。該專利申請案的實例4描述建構一個允許在巴氏畢赤酵母中製備融合蛋白並且其DNA作為用於製備一小前胰島素(它在A鏈之位置A8、A15、A18與A21中的胺基酸序列的特徵在於胺基酸組胺酸(A8)、麩胺酸(A15)、天門冬醯胺酸(A18)與甘胺酸(A21))的模版的質體。引子pichia_H_if1被使用。下列引子被再次合成並且在合成之後被純化：
pichia_G21-rev
5'-TTTTTTGGCG CCGAATTCAC TATTAGCC AC AGTAGTTTTC CAGCTGGTA -3' (序列辨識編號：24)
藉由粗體而被強調的密碼子標示出A21位置。
pichia_H8_f具有序列
5'-GAACAATGTTGTCAT AGTATCTGTTCTTTGTACCAGCTGGAAAACTACTG -3' (序列辨識編號：25)
藉由粗體而被強調的密碼子標示出A8位置。
pichia_a1-12rev
5'-GAACAGATACTATG ACAACATTGTTCAACGATACC-3'(序列辨識編號：26)
藉由粗體而被強調的密碼子標示出A8位置。相同莫耳數量(1μg)的引子pichia_G21_rev以及引子pichia_H8-f(它們部分地重疊)，在一嗜熱性聚合酶與一聚合酶緩衝液的存在下於95℃被變性，該聚合酶緩衝液含有4種去氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP與dTTP 5’，並且接著於56℃被培育達10-15分鐘。這個反應1的反應體積是25μl。在一個標準聚合酶鏈反應(反應2)中，引子pichia_H_if1與pichia-a1-12rev平行地與所述模版DNA反應。在又一個聚合酶鏈反應中，反應1與2的反應產物作為模版而與引子pichia_H_if1以及pichia_G21rev反應。這個反應的反應產物藉由凝膠電泳而被純化。在使用限制酵素XhoI與SacII的反應之後，涵蓋融合產物的DNA片段類似於實例4地被插入至所欲的載體pPICZαA。結果是質體pPIC_ins202。由該質體所編碼的融合蛋白是使用商業上可獲得的所述表現套組而被表現。製備His(A8),Gly(A21),Arg(B31)-人類胰島素前驅物接而為依據說明來針對精胺酸(B31)的精胺醯胺的偶合。結果是化合物His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -胰島素(YKL203)，其本身代表一種對應於實例20的新穎慢胰島素並且在大鼠實驗中被試驗。與離胺醯胺的偶合類似地造成化合物YKL203b，其特徵在於His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -胰島素。
然而，該化合物可以作為用於製備化合物Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -胰島素的中間產物，其製備是以Kohn等人[Peptides 28(2007)935-948]為基礎。爲了這個目的，200mg的化合物His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素被溶解於40ml的一100mM Na2 HPO4 /CH3 CN(50:50)混合物並且一為7.7-8.2的pH被設定。
作為更多的材料，一Boc-Arg-NHS酯是藉由在二氯甲烷中混合0.3mM Boc-Arg-OH、0.4mM N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與0.4mM二環己碳二亞胺(DCC)達40分鐘而被製備。反應混合物在一旋轉真空蒸發器中被濃縮至乾燥。混合物接著被取至5ml的甲醇中並且被添加至被溶解的起始胰島素。反應在室溫下被攪拌達至少60，但至多120分鐘。反應是藉由添加200μl的TFA而被停止。反應產物的質量的特徵是藉由LC-MS光譜法而被鑑定以證明經單醯化的產物(由3個成分所構成)存在。成分是透過HPLC而被分離。在這個期間，雙醯化以及三醯化的副產物亦被移除。源自於HPLC分離的部分是藉由質譜儀而被分析。各自含有單醯化產物的3個部分被進行一胺基酸序列分析，其表現容許鑑定出含有所欲化合物的HPLC部分，來自於該化合物Boc保護基團接著藉由溫和水解而被移除。在更新的HPLC純化之後，所欲的產物被測試有關它的生物特性。
實例23：評估新穎胰島素類似物在大鼠中的血糖-降低效果
所選定的新穎胰島素類似物的血糖-降低效果在健康的雄性血糖濃度正常韋斯大鼠(healthy male normoglycemic Wistar rats)中被試驗。雄性大鼠接受一劑量為9nmol/kg的一胰島素類似物的皮下注射。血液樣品在胰島素類似物的注射之前立即地並且按規律間隔直到注射之後的8小時從動物被取出，並且其中的血糖含量被決定。實驗明確地顯示(參照第1圖)，本發明的胰島素類似物致使一作用的清楚延遲開始以及一較長的，一致的作用期間。
實例24：評估新穎胰島素類似物在狗中的血糖-降低效果
所選定的新穎胰島素類似物的血糖-降低效果在健康的雄性血糖濃度正常米格魯犬中被試驗。雄性動物接受一劑量為6nmol/kg的一胰島素類似物的皮下注射。血液樣品在胰島素類似物的注射之前立即地並且按規律間隔直到注射之後的48小時從動物被取出，並且其中的血糖含量被決定。實驗明確地顯示，本發明的胰島素類似物致使一作用的清楚延遲之淺的開始以及一較長的，一致的作用期間。
第1圖：本發明的胰島素類似物在大鼠中的血糖-降低效果。
第2圖：甘精胰島素在大鼠中的血糖-降低效果。

Claims (32)

  1. 一種具有式I的胰島素類似物： 其中A-1對應於Lys、Arg或一胺基基團；A0對應於Lys、Arg或一化學鍵；A1對應於Arg或Gly；A5對應於Asp、Glu或Gln；A15對應於Asp、Glu或Gln；A18對應於Asp、Glu或Asn；A21對應於Ala、Ser、Thr或Gly；B-1對應於Asp、Glu或一胺基基團；B0對應於Asp、Glu或一化學鍵；B1對應於Asp、Glu、Phe或一化學鍵；B3對應於Asp、Glu或Asn；B4對應於Asp、Glu或Gln；B29對應於Arg、Lys或一選自於包含有下列胺基酸之群組的胺基酸：Phe、Ala、Thr、Ser、Val、Leu、Glu或 Asp，或一化學鍵；B30對應於Arg、Lys、Thr或一化學鍵；B31對應於Arg、Lys或一化學鍵；B32對應於Arg-醯胺或Lys-醯胺，其中包含有A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3以及B4之群組中沒有超過一個胺基酸殘基同時地或彼此獨立地對應於Asp或Glu。
  2. 如申請專利範圍第1項的胰島素類似物，其中A-1對應於Arg。
  3. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中A0對應於Arg。
  4. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中A5對應於Glu。
  5. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中A15對應於Glu。
  6. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中A18對應於Asp。
  7. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中A21對應於Gly。
  8. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中B0對應於Glu。
  9. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中B3對應於Asp。
  10. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中B4對 應於Glu。
  11. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中B30對應於Arg。
  12. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其中B30對應於Lys。
  13. 如申請專利範圍第1或2項的胰島素類似物，其是一選自於包含有下列的群組：Arg(A-1),Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Asp(A18),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),Asp(A18),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3), Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Lys(B30)-NH2 人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 人類胰島素，Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Asp(A18),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Asp(A18),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Glu(A15),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31), Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Lys(B32)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A-1),Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Arg(A1),His(A8),Gly(A21),Arg(B30)-NH2 -人類胰島素，Arg(A0),Arg(A1),His(A8),Gly(A21),Lys(B30)-NH2 -人類胰島素，His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH2 -人類 胰島素。
  14. 一種用以製備如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物的方法，其中該胰島素類似物的一前驅物被重組地製備，該前驅物被酵素地加工處理成雙-鏈胰島素，以及一個與精胺醯胺的偶合在一具有胰蛋白酶活性的酵素存在下被執行，並且該胰島素類似物被分離。
  15. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物供製造一用以治療糖尿病的一藥劑的用途。
  16. 如申請專利範圍第15項之用途，其用於製造一供治療第I型或第II型糖尿病、供軟骨再生或供治療地促進貝他細胞再生的一藥劑之方法中。
  17. 一種包含有一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物的藥品。
  18. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物的調配物，其中該調配物是呈包含有被溶解的胰島素類似物的水性形式。
  19. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物的調配物，其中該調配物是呈粉末的形式。
  20. 如申請專利範圍第19項的調配物，其中如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物是呈結晶和/或無定形形式而存在。
  21. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物的調配物，其中該調配物是呈一懸浮液的形式。
  22. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似 物的調配物，其中該調配物額外地包含有一化學伴隨蛋白(chaperone)。
  23. 一種編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物的前驅物的DNA。
  24. 一種編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物的A鏈的DNA。
  25. 一種編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項之胰島素類似物的B鏈的DNA。
  26. 如申請專利範圍第18至22項中任一項的調配物，其額外地包含有一類升糖素肽-1(GLP-1)，或艾塞那肽-3(exendin-3)，或艾塞那肽-4或其一類似物或衍生物。
  27. 如申請專利範圍第26項的調配物，其額外地包含艾塞那肽-4。
  28. 如申請專利範圍第26項的調配物，其中艾塞那肽-4的一類似物是選自於一包含有下列的群組：H-desPro36 -艾塞那肽-4-Lys6 -NH2 ，H-des(Pro36,37 )-艾塞那肽-4-Lys4 -NH2 以及H-des(Pro36,37 )-艾塞那肽-4-Lys5 -NH2 ，或其藥理學上可耐受的鹽類。
  29. 如申請專利範圍第26項的調配物，其中艾塞那肽-4的一類似物是選自於一包含下列的群組：desPro36 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)，desPro36 [IsoAsp28 ]艾塞那肽-4(1-39)，desPro36 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)， desPro36 [Met(O)14 ,IsoAsp28 ]艾塞那肽-4(1-39)，desPro36 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-2(1-39)，desPro36 [Trp(O2 )25 ,IsoAsp28 ]艾塞那肽-2(1-39)，desPro36 [Met(O)14 Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)以及desPro36 [Met(O)14 Trp(O2 )25 ,IsoAsp28 ]艾塞那肽-4(1-39)，或其藥理學上可耐受的鹽類。
  30. 如申請專利範圍第26項的調配物，其中該艾塞那肽-4-Lys6 -NH2 被接附至艾塞那肽-4的類似物的C端。
  31. 如申請專利範圍第26項的調配物，其中艾塞那肽-4的一類似物是選自於一包含下列的群組：H-(Lys)6 -des Pro36 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 des Asp28 Pro36 ,Pro37 ,Pro38 艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 ， H-des Asp28 Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 ，des Met(O)14 Asp28 Pro36 ,Pro37 ,Pro38 艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 ， H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-Lys6 -NH2 ，des Asp28 Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36, Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-NH2 ，des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-(Lys)6 -des Pro36, Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，H-Asn-(Glu)5 -des Pro36 ,Pro37 ,Pro38 [Met(O)14 ,Trp(O2 )25 ,Asp28 ]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)6 -NH2 ，或其藥理學上可耐受的鹽類。
  32. 如申請專利範圍第26項的調配物，其額外地包含有Arg34 ,Lys26 (Nε (γ-麩胺醯基(Nα -十六醯基)))GLP-1(7-37)[利拉魯肽(liraglutide)]。
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