SK2432004A3 - Inzulínová zlúčenina s protrahovaným účinkom - Google Patents

Description

Predložený vynález sa vzťahuje k inzulínovým zlúčeninám, ktoré sú užitočné pri liečbe hyperglykémie, ktorá je charakteristická pre diabetes mellitus.

Doterajší stav techniky

Fyziologická potreba inzulínu sa môže rozdeliť do dvoch fáz: (a) fáza absorbcie živín, ktorá vyžaduje dávku inzulínu na odstránenie náporu krvnej glukózy, ktorá je spojená s prísunom jedla a (b) post-absorbčná fáza vyžadujúca neustálu dodávku inzulínu kvôli regulácii pečeňového výydaja glukózy za účelom udržania optimálnej hladiny glukózy v lačnom stave, ktorá je tiež známa ako bazálna sekrécia inzulínu.

Účinná terapia inzulínom u ľudí, ktorí sú postihnutí diabetes, všeobecne zahrňuje kombinované použitie dvoch typov exogénnych formulácií inzulínu: rýchlo účinkujúci inzulín kvôli pokrytiu príjmu potravy, ktorý sa podáva ako injekčný bolus a dlhšie účinkujúci inzulín, podávaný injekciou raz alebo dvakrát denne s cieľom kontrolovať hladiny krvnej glukózy medzi príjmami potravy.

Ideálny exogénny bazálny inzulín by zaisťoval predĺžený a plochý” účinok rozložený v čase, to znamená, že by kontroloval hladinu krvnej glukózy počas aspoň 12 hodín a výhodne počas 24 hodín, bez významného rizika hypoglykémie.

276/B

Komerčne dostupné dlhšie účinkujúce inzulínové zlúčeniny neposkytujú účinok inzulínu počas 24 hodín. V súlade s tým je potrebná inzulínová zlúčenina, ktorá by mala účinok inzulínu počas až 24 hodín.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka inzulínovej zlúčeniny pozostávajúcej z:

(a) reťazca A všeobecného vzorca I,

A-l AO Al A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 All A12 A13 Xaa-Xaa-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-LeuA14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa, kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca I je znázornená v Sekv. ID č. 1, a (b) reťazca B všeobecného vzorca II,

B-l BO BI B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 Bil B12

Xaa-Xaa-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-ValB13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-ThrB28 B29 B30

Xaa-Xaa-Xaa, kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca II je znázornená v Sekv. ID č. 2, kde:

Xaa v polohe A-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginin, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

276/B

Xaa v polohe AO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín alebo alfa metyl arginín,

Xaa v polohe A21 je geneticky kódovatelná aminokyselina,

Xaa v polohe B-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe BO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe B28 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B29 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B30 je Thr, Ala alebo je neprítomný, jeden z Xaa v polohe B28 alebo Xaa v polohe B29 je Lys,

Xaa v polohe B28 a Xaa v polohe B29 nie sú oba Lys, a ε-amino skupina Lys v polohe B28 alebo B29 je kovalentne viazaná k alfa-karboxylovej skupine kladne nabitej aminokyseliny kvôli príprave Lys-N^Eaminokyselinového derivátu.

Predložený vynález sa tiež týka spôsobu liečby diabetes mellitus, pričom spôsob zahrňuje podávanie inzulínovej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu subjektu v množstve, ktoré je dostatočné na reguláciu koncentrácie krvnej hladiny glukózy.

Predložený vynález sa tiež týka mikrokryštálov zahrňujúcich inzulínovú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu, spôsobov prípravy mikrokryštálov a spôsobu liečby diabetes podávaním mikrokryštálov.

276/B

Predložený vynález sa tiež týka prípravku v suspenzii pozostávajúceho z nerozpustnej fázy a fázy roztoku, nerozpustná fáza zahrňuje mikrokryštál podľa predloženého vynálezu a fáza roztoku zahrňuje vodu. Predložený vynález sa tiež týka spôsobu prípravy prípravku v suspenzii.

Predložený vynález sa tiež týka spôsobu liečby diabetes mellitus, pričom spôsob pozostáva z podávania prípravku v suspenzii subjektu v množstve, ktoré je dostatočné na reguláciu koncentrácie krvnej hladiny glukózy u subjektu.

Predložený vynález sa tiež týka spôsobu prípravy prípravku v suspenzii. Predložený vynález sa tiež týka spôsobu liečby diabetes mellitus, pričom spôsob zahrňuje podávanie prípravku v suspenzii subjektu v množstve, ktoré je postačuje regulovať koncentráciu krvnej hladiny glukózy u subjektu.

Predložený vynález sa tiež týka spôsobu prípravy inzulínovej zlúčeniny, pozostávajúceho z: (a) acylácie každej voľnej amino skupiny templátu inzulínu chránenou aminokyselinou alebo derivátom chránenej aminokyseliny za účelom prípravy acylovanej inzulínovej zlúčeniny; (b) čistenia acylovanej inzulínovej zlúčeniny; (c) odstránenia ochrannej skupiny z každej chránenej aminokyseliny alebo derivátu chránenej aminokyseliny kvôli príprave nechránenej acylovanej inzulínovej zlúčeniny; a (d) čistenia nechránenej acylovanej inzulínovej zlúčeniny. V jednom výhodnom uskutočnení je chránenou aminokyselinou chránený Arg a aminokyselina je Arg. V inom výhodnom uskutočnení je chránenou aminokyselinou chránený Lys a aminokyselinou je Lys.

Stručný opis všeobecného vzorca

Všeobecný vzorec I znázorňuje Lys-N^e-Arg derivát, ktorý sa získa tvorbou kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou Lys a alfa-karboxylovou skupinou Arg.

276/B

Opis predloženého vynálezu

V jednom výhodnom uskutočnení sa predložený vynález týka inzulínovej zlúčeniny zahrňujúcej modifikáciu na jednom alebo viacerých miestach Nterminálneho konca inzulínového reťazca A, C-terminálneho konca inzulínového reťazca A, N-terminálneho konca inzulínového reťazca B a lyzínu reťazca B.

V inom výhodnom uskutočnení inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu zahrňuje modifikáciu N-terminálneho konca reťazca A, modifikáciu Nterminálneho konca reťazca B, modifikáciu lyzínu reťazca B a prípadne modifikáciu C-terminálneho konca reťazca A. Takouto zlúčeninou je napríklad taká inzulínová zlúčenina, v ktorej sa Arg kovalentne viazal k N-terminálnemu koncu reťazca A, Arg sa kovalentne viazal k N-terminálnemu koncu reťazca B, Lys reťazca B sa modifikoval a prípadne C-koncová aminokyselina reťazca A bola substituovaná inou aminokyselinou ako je Gly.

V inom výhodnom uskutočnení inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu zahrňuje modifikáciu N-terminálneho konca reťazca A, modifikáciu lyzínu reťazca B a prípadne modifikáciu C-terminálneho konca reťazca A. Takouto inzulínovou zlúčeninou je taká, kde sa Arg kovalentne viazal k Nterminálnemu koncu reťazca A, Lys reťazca B sa modifikoval a pripadne Ckoncová aminokyselina reťazca A sa substituovala inou aminokyselinou ako je Gly.

V inom výhodnom uskutočnení sa predložený vynález týka inzulínovej zlúčeniny, ktorá pozostáva z:

(a) reťazca A všeobecného vzorca I,

A-l Ά0 Al A2 A3 A4 Ά5 A6 ΑΊ A8 Ά9 A10 All A12 A13 Xaa-Xaa-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-LeuA14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa,

276/B kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca I je znázornená v Sekv. ID č. 1, a (b) reťazca B všeobecného vzorca II,

B-l BO BI B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 Bil B12 Xaa-Xaa-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-ValB13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-ThrB28 B29 B30

Xaa-Xaa-Xaa, kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca II je znázornená v Sekv. ID č. 2, kde:

Xaa v polohe A-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe AO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín alebo alfa metyl arginín,

Xaa v polohe A21 je geneticky kódovatelná aminokyselina,

Xaa v polohe B-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe BO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

276/B

Xaa v polohe B28 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B29 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B30 je Thr, Ala alebo je neprítomný, jeden z Xaa v polohe B28 alebo Xaa v polohe B29 je Lys,

Xaa v polohe B28 a Xaa v polohe B29 nie sú oba Lys, a ε-amino skupina Lys v polohe B28 alebo B29 je kovalentne viazaná k alfa-karboxylovej skupine kladne nabitej aminokyseliny.

Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je Xaa v polohe A-1 neprítomný, Xaa v polohe AO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, alfa guanidino homoarginín alebo alfa metyl arginín, Xaa v polohe B-1 je neprítomný a Xaa v polohe BO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný.

Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je Xaa v polohe A-1 neprítomný, Xaa v polohe AO predstavuje Arg, v polohe B-1 je neprítomný a Xaa v polohe BO je neprítomný.

Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je Xaa v polohe A-1 neprítomný, Xaa v polohe AO je derivatizovaný Lys, Xaa v polohe B-1 je neprítomný a Xaa v polohe BO je neprítomný.

Všeobecný vzorec I je:

A-1 AO Al A2 A3 A4 A5 Ά6 A7 A8 A9 A10 All A12 Ά13 Xaa-Xaa-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-LeuA14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa, a aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca I je znázornená v

Sekv. ID č. 1. Aminokyseliny v pozíciách A-1 až A21 všeobecného vzorca I zodpovedajú, vzhľadom na poradie, aminokyselinám v pozíciách 1-23 Sekv.

ID č. 1.

276/B

Aminokyseliny v pozíciách A-1 až A20 všeobecného vzorca I a v pozíciách 3 - 22 Sekv. ID č. 1 zodpovedajú aminokyselinám v pozíciách 1 - 20 reťazca A ľudského inzulínu (Sekv. ID č. 3).

Všeobecný vzorec II” je:

B-1 BO BI B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 Bil B12 Xaa-Xaa-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-ValB13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-ThrB28 B29 B30

Xaa-Xaa-Xaa, a aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca II je znázornená v Sekv. ID č. 2. Aminokyseliny v pozíciách B-1 až B30 všeobecného vzorca II zodpovedajú, vzhľadom na poradie, aminokyselinám v pozíciách 1-32 Sekv. ID č. 2.

Aminokyseliny v pozíciách B-1 - B27 všeobecného vzorca a v pozíciách 3-29 Sekv. ID č. 2 zodpovedajú aminokyselinám v pozíciách 1-27 reťazca B ľudského inzulínu (Sekv. ID č. 4).

Polynukleotidové a aminokyselinové sekvencie inzulínovej zlúčeniny od členov rôznych druhov sú dobre známe odborníkovi v odbore. Výhodne predstavuje inzulín” ľudský inzulín. Ľudský inzulín” má 21 aminokyselinový reťazec A, ktorý pozostáva z:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-TyrGln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (Sekv. ID č. 3), a 30-aminokyselinový reťazec B, ktorý pozostáva z:

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-AlaLeu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-ProLys-Thr (Sekv. ID č. 4).

Reťazce A a B ľudského inzulínu sú skrížené viazané disulfidovými väzbami. Jedna medzireťazcová disulfidová väzba je medzi Cys v polohe A7 všeobecného vzorca I a Cys v polohe B7 všeobecného vzorca II a iná

276/B medzireťazcová disulfidová väzba je medzi Cys v polohe A20 všeobecného vzorca I a Cys v polohe B19 všeobecného vzorca II. Medzireťazcová disulfidová väzba je medzi cysteínmi v pozíciách A6 a A11 všeobecného vzorca I.

Výraz hostiteľská bunka” sa vzťahuje k ako jednej hostiteľskej bunke, tak k viac ako k jednej hostiteľskej bunke.

Inzulínová zlúčenina” v tu uvedenom význame zahrňuje inzulíny divokého typu, inzulínové deriváty a inzulínové analógy.

Pozitívne nabitá aminokyselina” je prirodzená alebo v prírode sa nevyskytujúca aminokyselina, ktorá má výsledný kladný náboj pri hodnote pH, ktorá sa rovná 6,0. V jednom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je kladne nabitou aminokyselinou Arg. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je kladne nabitou aminokyselinou Lys.

Inzulínový derivát” v tu používanom zmysle predstavuje inzulínovú zlúčeninu, kde Lys je derivatizovaný za účelom prípravy kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou (-Νε) od Lys a inej skupiny. Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je Lys reťazca A derivatizovaný kvôli príprave kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou a Lys a inou skupinou. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je Lys reťazca B derivatizovaný za účelom prípravy kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou Lys a inou skupinou. Podlá iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu sú oba Lys reťazca A a reťazca B derivatizované za účelom prípravy kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou každého z Lys a inej skupiny.

V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je kovalentná väzba vytvorená acyláciou s kladne nabitou aminokyselinou. V tomto uskutočnení je kovalentná väzba vytvorená medzi ε-amino skupinou Lys a uhlíkom v alfakarboxylovej skupine aminokyseliny, keď atóm vodíka z ε-amino skupiny Lys a hydroxylová časť alfa-karboxylovej skupiny aminokyseliny vytvorí vodu pri kovalentnej väzbe aminokyseliny k Lys kvôli príprave kovalentnej väzby.

276/B

Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je kovalentná väzba vytvorená medzi ε-amino skupinou Lys a uhlíkom v alfa-karboxylovej skupine Arg, za tvorby Lys-hľ-Arg” derivátu. Lys-N^E-Arg derivát je znázornený vo všeobecnom vzorci I. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Lys-N^£-Arg inzulínový derivát vytvorený z Lys v polohe B28 všeobecného vzorca II. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Lys-N^E-Arg inzulínový derivát vytvorený z Lys v polohe B29 všeobecného vzorca II, ktorý zodpovedá Lys v polohe 29 Sekv. ID č. 4.

Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je kovalentná väzba vytvorená medzi ε-amino skupinou Lys a uhlíkom v alfa-karboxylovej skupine Lys, za tvorby Lys-N^E-Lys” derivátu. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Lys-N^E-Lys inzulínový derivát vytvorený z Lys v polohe B28 všeobecného vzorca II. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Lys-N^E-Lys inzulínový derivát vytvorený z Lys v polohe B29 všeobecného vzorca II, ktorý zodpovedá Lys v polohe 29 Sekv. ID č. 4.

Proinzulínový derivát” v tu uvedenom význame predstavuje proinzulínovú zlúčeninu, kde Lys je derivatizovaný za účelom prípravy kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou Lys a inou skupinou. V jednom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu sa kovalentná väzba vytvorí acyláciou s kladne nabitou aminokyselinou. V tomto uskutočnení prihlášky vynálezu je kovalentná väzba vytvorená medzi ε-amino skupinou Lys a uhlíkom v alfa-karboxylovej skupine kladne nabitej aminokyseliny, za tvorby ”Lys-Naminokyselinového” derivátu. Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je kovalentná väzba vytvorená medzi ε-amino skupinou Lys a uhlíkom v alfa-karboxylovej skupine Arg, za tvorby ”Lys-N^E-Arg” derivátu. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Lys-N^E-Arg inzulínový derivát vytvorený z Lys v polohe B28 všeobecného vzorca II. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Lys-N^E-Arg inzulínový derivát vytvorený z Lys v polohe B29 všeobecného vzorca II, ktorý zodpovedá Lys v polohe 29 Sekv. ID č. 4. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je kovalentná

276/B väzba vytvorená medzi ε-amino skupinou Lys a uhlíkom v alfa-karboxylovej skupine Lys, za tvorby ”Lys-N^E-Lys derivátu. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Lys-N^E-Lys inzulínový derivát vytvorený z Lys v polohe B28 všeobecného vzorca II. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Lys-N^E-Lys inzulínový derivát vytvorený z Lys v polohe B29 všeobecného vzorca II, ktorý zodpovedá Lys v polohe 29 Sekv. ID č. 4.

Inzulínový analóg” v tu uvedenom význame má iný význam ako inzulínový derivát” v tu uvedenom význame. Inzulínový derivát” je inzulínová zlúčenina, kde Lys je derivatizovaný za účelom prípravy kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou Lys a inou skupinou. Na rozdiel od výrazu inzulínový derivát” výraz inzulínový analóg” predstavuje inzulínovú zlúčeninu, ktorá je modifikovaná tak, aby sa odlišovala od inzulínu divokého typu, ale Lys nie je derivatizovaný za účelom prípravy kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou Lys a inej polovice. Inzulínový analóg môže takto mať reťazec A a/alebo B, ktoré majú v zásade rovnaké aminokyselinové sekvencie ako reťazec A a reťazec B ľudského inzulínu, vzhľadom na poradie, ale odlišujú sa od reťazca A a reťazca B ľudského inzulínu prítomnosťou jednej alebo viacerých aminokyselinových delécií v reťazcoch A a/alebo B a/alebo jedným alebo viacerými aminokyselinovými náhradami v reťazcoch A a/alebo B a/alebo jednou alebo viacerými aminokyselinami, ktoré sú kovalentne viazané k Na/alebo C-koncom reťazcov A a/alebo B.

Napríklad A0^Ar9B29^Lys-^Ne-^Arg-inzulín, _A0^Lys’^N£-^Ar9-inzulín a A0^Lys-^NE’^Ar9-B29^{Lys NE}'^Arg-inzulín sú takto inzulínové deriváty, pretože u každej z týchto inzulínových zlúčenín je Lys derivatizovaný kvôli príprave kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou Lys a inou skupinou (Arg). Naproti tomu vzhľadom na inzulínové deriváty je A0^Ar9-inzulín inzulínový analóg, pretože v A0^Ar9-inzulíne nie je Lys derivatizovaný za účelom prípravy kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou Lys a inou skupinou.

276/B

Proinzulínový analóg” v tu uvedenom význame sa odlišuje od proinzulínového derivátu” v tu uvedenom význame. Proinzulínový derivát je proinzulínová zlúčenina, kde Lys je derivatizovaný za účelom prípravy kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou Lys a inou skupinou. V porovnaní s výrazom proinzulínový derivát” predstavuje výraz proinzulínový analóg” proinzulínová zlúčeninu, ktorá je modifikovaná, aby sa odlišovala od proinzulínu divokého typu, ale Lys nie je derivatizovaný za účelom prípravy kovalentnej väzby medzi ε-amino skupinou Lys a inej polovice.

Analóg proinzulínu takto môže mať reťazec A, reťazec B a/alebo Cpeptid, ktoré majú v zásade rovnaké aminokysellnové sekvencie ako reťazce A, reťazce B a C-peptidu ľudského proinzulínu, vzhľadom na poradie, ale sa odlišujú od reťazca A, reťazca B a C-peptidu ľudského proinzulínu prítomnosťou jednej alebo viacerých aminokyselinových delécií v reťazci A, reťazci B alebo C-peptidu a/alebo jedným alebo viacerými aminokyselinovými nahradeniami v reťazci A, reťazci B alebo C-peptidu a/alebo jednou alebo viacerými kovalentne viazanými aminokyselinami k N- a/alebo C-koncom reťazca A, reťazca B alebo C-peptidu. Napríklad A0^ArgB29^Lys'^N£:'^Ar9-proinzulín je inzulínový derivát, ale B28^LysB29^Pr0-proinzulín je proinzulínový analóg.

Aminokyselina na Xaa v polohe A-1 všeobecného vzorca I môže byť prítomná alebo neprítomná.

Pokiaľ je prítomná, je výhodne Arg, derivatizovaný Arg, homoarginin, desamino homoarginin, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginin alebo alfa metyl arginín.

Aminokyselina na Xaa v polohe AO musí byť prítomná. Vo výhodnom uskutočnení Xaa v polohe AO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginin, desamino homoarginin, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginin alebo alfa metyl arginín. Vo výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Xaa v polohe AO Lys derivatizovaný s kladne nabitou aminokyselinou. V inom výhodnom uskutočnení

276/B prihlášky vynálezu je Xaa v polohe AO Lys-N^E-Arg. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je Xaa v polohe AO Lys-N^E-Lys.

Aminokyselina na Xaa v polohe A21 je geneticky kódovatelná aminokyselina zvolená zo súboru, zahrňujúceho alanín (Ala), arginin (Arg), asparagin (Asn), kyselinu asparágovú (Asp), cysteín (Cys), kyselinu glutámovú (Glu), glutamín (Gin), glycín (Gly), histidín (His), izoleucin (lle), leucín (Leu), lyzín (Lys), metionín (Met), fenylalanín (Phe), prolín (Pro), serín (Ser), treonín (Thr), tryptofán (Trp), tyrozín (Tyr) a valín (Val). Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je aminokyselina na Xaa v polohe A21 glycín. V inom výhodnom uskutočnení je aminokyselinou na Xaa v polohe A21 serín. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je aminokyselinou na Xaa v polohe A21 treonín. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je aminokyselinou na Xaa v polohe A21 alanín.

Aminokyselina na Xaa v polohe B-1 všeobecného vzorca II môže byť prítomná alebo neprítomná.

Pokiaľ je prítomná, je výhodne Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín alebo alfa metyl arginin. Aminokyselina na Xaa v polohe BO môže byť prítomná alebo neprítomná. Pokiaľ je prítomná, je výhodne Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín alebo alfa metyl arginin. Pokiaľ aminokyselina na Xaa v polohe BO je neprítomná, potom je tiež aminokyselina na Xaa v polohe B-1 neprítomná.

Aminokyselina na Xaa v polohe B28 je Lys alebo Pro.

Aminokyselina na Xaa v polohe B29 je Lys alebo Pro.

Aminokyselina na Xaa v polohe B30 je Thr, Ala alebo je neprítomná.

Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je buď Xaa v polohe B28 alebo Xaa v polohe B29 Lys, ale Xaa v polohe B28 a Xaa v polohe

B29 nie sú oba Lys a ε-amino skupina Lys v polohe B28 alebo B29 je

276/B kovalentne viazaná k ε-karboxylovej skupine kladne nabitej aminokyseliny za účelom prípravy Lys-bT-aminokyselinového derivátu. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je ε-amino skupina Lys v polohe B28 alebo B29 kovalentne viazaná k ε-karboxylovej skupine Arg za účelom prípravy derivátu Lys-hľ-Arg. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je ε-amino skupina Lys v polohe B28 alebo B29 kovalentne viazaná k ε-karboxylovej skupine Lys za účelom prípravy derivátu Lys-N^E-Lys.

Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je aminokyselina v inzulínovej zlúčenine ďalej derivatizovaná. Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je aminokyselina derivatizovaná acyláciou.

Výhodnejšie je Lys v polohe B29 všeobecného vzorca II acylovaný aminokyselinou.

Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je aminokyselina derivatizovaná karbamyláciou.

Výhodne je Lys derivatizovaný kvôli príprave homoarginínu. Výhodnejšie je homoarginín vytvorený z Lys v polohe B29 všeobecného vzorca II.

Polypeptidový reťazec” predstavuje dve alebo viacero aminokyselín, ktoré sú spojené spolu prostredníctvom peptidových väzieb.

Vo výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je reťazec A inzulínovej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu skrížené viazaný k reťazcu B prostredníctvom dvoch disulfidových väzieb a reťazec obsahuje vnútroreťazcové disulfidové väzbové skrížené viazanie. Viac špecificky, patrične viazaný” predstavuje (1) disulfidovú väzbu medzi Cys v polohe A6 všeobecného vzorca I a Cys v polohe A1 1, (2) disulfidovú väzbu medzi Cys v polohe A7 všeobecného vzorca I a Cys v polohe B7 všeobecného vzorca II a (3) disulfidovú väzbu medzi Cys v polohe A20 všeobecného vzorca I a Cys v polohe B 19 všeobecného vzorca II.

276/B

Na znázornenie inzulínu a proinzulínovej zlúčeniny sa tu používa jednoduché zapísanie skrátenou notáciou a so znázornením v referencii k reťazcu A všeobecného vzorca I (Sekv. ID č. 1) a k reťazcu B všeobecného vzorca II (Sekv. ID č. 2). V tomto zápise, pokiaľ je aminokyselina na Xaa v polohe A-1, B-1 alebo BO nie je uvedená v skrátenom zápise inzulínovej zlúčeniny, potom je Xaa v tejto pozícii neprítomný. Pokiaľ aminokyselina na Xaa v polohe A21 nie je uvedená v skrátenom zápise inzulínovej zlúčeniny, potom je aminokyselinou Asn, ktorý je aminokyselinou v polohe A21 v inzulíne divokého typu reťazca A (Sekv. ID č. 3). Pokiaľ nie je aminokyselina na Xaa v polohe B28 uvedená v skrátenom zápise inzulínovej zlúčeniny, potom je aminokyselinou Pro, ktorý je aminokyselinou v polohe B28 v inzulíne divokého typu reťazca B (Sekv. ID č. 4). Pokiaľ aminokyselina na Xaa v polohe B29 nie je uvedená v skrátenom zápise inzulínovej zlúčeniny, potom je aminokyselinou Lys, ktorý je aminokyselinou v polohe B29 v inzulíne divokého typu reťazca B. Pokiaľ aminokyselina na Xaa v polohe B30 nie je uvedená v skrátenom zápise inzulínovej zlúčeniny, potom je aminokyselinou Thr, ktorý je aminokyselinou v polohe B30 v inzulíne divokého typu reťazca B. des (B30) znamená, že Xaa v polohe B30 je neprítomný. Pokiaľ aminokyselina v proinzulíne nie je uvedená v skrátenom zápise proinzulínovej zlúčeniny, aminokyselina v tejto pozícii je aminokyselinou v tejto pozícii divokého typu ľudskej proinzulínovej zlúčeniny.

Neobmedzujúcim príkladom v skrátenom zápise je ”A0^Ar9A21^XaaB0^Aľ9B29^Lys‘^NE'^Aľ9-inzulín”, ktorý znázorňuje, že Xaa v polohe A-1 všeobecného vzorca I je neprítomný, Xaa v polohe AO predstavuje Arg, Xaa v polohe A21 je geneticky kódovatelná aminokyselina, Xaa v polohe B-1 všeobecného vzorca II je neprítomný, Xaa v polohe BO predstavuje Arg, Xaa v polohe B28 je Pro, Xaa v polohe B29 je Lys-N^E-Arg a Xaa v polohe B30 je Thr.

V inom neobmedzujúcom príklade skráteného zápisu znázorňuje skrátený zápis ”A0^Lys’^NE‘^Ar9-A21^GlyB29^Lys'^NE’^Ar9-inzulín'’, že Xaa v polohe A-1 všeobecného vzorca I je neprítomný, Xaa v polohe AO je Lys-N^E-Arg, Xaa v polohe A21 je Gly, Xaa v polohe B-1 všeobecného vzorca II je neprítomný, Xaa

276/B v polohe BO je neprítomný, Xaa v polohe B28 je Pro, Xaa v polohe B29 je LysN^E-Arg a Xaa v polohe B30 je Thr.

V inom neobmedzujúcom príklade skráteného zápisu znázorňuje skrátený zápis pre A²¹-inzulín, že Xaa v polohe A-1 všeobecného vzorca I je neprítomný, Xaa v pozíciách AO je neprítomný, Xaa v polohe A21 je geneticky kódovatelná aminokyselina, Xaa v polohe B-1 všeobecného vzorca II je neprítomný, Xaa v polohe BO je neprítomný, Xaa v polohe B28 je Pro, Xaa v polohe B29 je Lys a Xaa v polohe B30 je Thr.

”A21^Gly-inzulín” je rovnaký ako A21^Xaa-inzulín, okrem toho, že Xaa v polohe A21 je Gly.

”A21^Ser-inzulín” je rovnaký ako A21^Xaa-inzulín, okrem toho, že Xaa v polohe A21 je Ser.

V inom neobmedzujúcom príklade skráteného zápisu znázorňuje skrátený zápis pre ”B28^LysB29^PľO-inzulín’’, že Xaa v polohe A-1 všeobecného vzorca I je neprítomný, Xaa v pozíciách AO je neprítomný, Xaa v polohe A21 je geneticky kódovatelná aminokyselina, Xaa v polohe B-1 všeobecného vzorca II je neprítomný, Xaa v polohe BO je neprítomný, Xaa v polohe B28 je Lys, Xaa v polohe B29 je Pro a Xaa v polohe B30 je Thr.

V inom neobmedzujúcom príklade skráteného zápisu znázorňuje skrátený zápis ”A0^Aľ9-inzulín”, že Xaa v polohe A-1 všeobecného vzorca I je neprítomný, Xaa v polohe AO predstavuje Arg, Xaa v polohe A21 je Asn, Xaa v polohe B-1 všeobecného vzorca II je neprítomný, Xaa v polohe BO je neprítomný, Xaa v polohe B28 je Pro, Xaa v polohe B29 je Lys a Xaa v polohe B30 je Thr. Pozri U.S. patenty č. 5,506,202 a U.S. č. 5,430,016.

”gHR” predstavuje alfa-guanidyl homoarginín.

Vo výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu zvolená zo súboru, zahrňujúceho:

276/B

A0^Ar9B29^Lys'^NE'^Arg-inzulín,

A0^Ar9A21^XaaB29^Lys'^Ne'^Arg-inzulín, A0^Ar9A21^GlyB29^Lys'^Ne’^Ar9-inzulín, A0^Ar9A21^SerB29^Lys’^Ne’^Arg-inzulín, A0^Ar9 B2 9^Lys'^NE'^Lys-inzu lí n,

A0^ArgA21 ^XaaB29^Lys‘^NE’^Lys-inzulí n, A0^Ar9A21^GlyB29^Lys’^{Ne Lys}-inzulín, A0^ArgA21^SeľB29^Lys'^NE'^Lys-inzulín, A0^LysB29^Lys'^NE'^Arg-inzulín, A0^LysA21^XaaB29^Lys’^Ne'^Arg-inzulín, A0^LysA21^GlyB29^Lys’^NE'^Aľg-inzulín, A0^LysA21^SeľB29^Lys'^NE'^Ar9-inzulín,

A0^LysB29^Lys‘^NE'^Lys-inzulín,

A0^LysA21^Xaa B29^Lys’^Ne'^Lys-inzulí n, A0^LysA21^GlyB29^Lys'^NE'^Lys-inzulín, A0^LysA21^SerB29^Lys’^NE'^Lys-inzulín,

A-1^Aľg A0^Lys A21^Xaa B2 9^Lys’^{NE Arg}-i nzu I í n, A-l^Ar9A0^LysA21^GlyB29^Lys’^NE’^Aľ9-inzulín, A-1^Arg A0^LysA21 ^SerB29^Lys'^NE'^Aľg-inzulí n, A-1^ArgA0^LysA21^XaaB29^Lys'^NE'^Lys-inzulín, A_1^Ar9A0^LysA21^GlyB29^Lys'^NE'^Lys-inzulín, A-1 ^ArgA0^LysA21 ^SerB29^Lys'^NE'^Lys-inzulí n,

276/B

A-1^LysA0^LysA21^XaaB29^Lys'^NE‘^Arg-inzulín, A-1 ^LysA0^LysA21^Gly B2 9^Lys'^Ne’^Arg-i n zu i í n, A-1^LysA0^LysA21^SerB29^LysWArg-inzulín, A-1 ^LysA0^LysA21^Xaa B2 9^Lys'^NE'^Lys-i nzu I í n, A-1 ^LysA0^LysA21 ^GlyB29^Lys‘^Ne'^Lys-i nzu I í n, A-1 ^LysA0^LysA21 ^SeľB29^Lys’^Ne'^Lys-inzulín, A-1 ^AľgA0^AľgA21^Xaa B29^LysWArg-i nzu I í n, A-1^AľgA0^Ar9A21^GlyB29^Lys'^Ne'^Arg-inzulín, A-1^Aľ9A0^ArgA21^SerB29^Lys'^Ne'^Arg-inzulín, A-i^Ar9A0^ArgA21^XaaB29^Lys’^N(:'^Lys-inzulín, A-1 ^ArgA0^ArgA21 ^GlyB29^Lys'^NE'^Lys-inzul í n, A_i^ArgA0^Ar9A21^SerB29^Lys’^NF'^Lys-inzulín, A0Lys-NE-ArgA21 ^XaaB2 nZUl í D, _A0Lys-N_E-Arg_A21Gly_B2gLys-N_e-Arg__{jnzu|ínj A0}Lys-N_E-Arg_A21 Ser^gLys-Ns-Argj _nz(J ] j _{n A0}Lys-N_E-Arg_A2 ^XaaB29^LyS’^NE’^LyS-ÍriZUlí Π, A0Lys-NE-ArgA21 Gly B29^LyS’^N£'^LyS-Í ľlZU lí Π, A0Lys-NE-Arg_A21S_er_B29Lys-N_E-Lys__{inzu|írii A0}Ly_S-N_E-Lys_A21Xa_aB2gLys-N_E-Arg__{jnZ(j(ín) A0}Lys-N_E-Lys_A21Gly_B29Lys-N_E-Arg__{jnzu|jr|| A0}Lys-N_E-Lys_A21Ser_B29Lys-N_E-Arg__{inzulíni A0}Lys-N_E-Lys_A21 ^Xaa _B2 9 ^LyS’^Ne'^{Ly S}-Í ΠΖ UI í Π,

276/B _A0Lys-N_E-Lys_A21Gly_B2gLys-N_E-Lys__{inzu|ínj A0}Lys-N_E-L_ys_A21Ser_B29Lys.N_e-Ly_Sjnz(j|íni A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys-^NE-^Arg-inzulín,

A0^ArgA21^XaaB0^AľgB29^Lys'^NE'^Arg-inzulín,

A0^Ar9A21^GlyB0^Ar9B29^Lys’^NE’^Arg-inzulin,

A0^Ar9A21^SerB0^ArgB29^Lys'^NE’^Arg-inzulín,

A0^Ar9B0^ArgB29^Lys‘^NE’^Lys-inzulin,

A0^ArgA21^XaaB0^ArgB29^Lys'^NE'^Lys-inzulín,

A0^ArgA21 ^GlyB0^Arg B29^Lys'^NE'^Lys-inzulí n,

A0^ArgA21^SerB0^ArgB29^Lys’^NE’^Lys-inzulín,

A0^LysB0^LysB29^Lys'^NE'^Arg-inzulín,

A0^LysA21^XaaB0^LysB29^Lys'^NE'^Arg-inzulín,

A0^LysA21^GlyB0^LysB29^Lys'^NE’^Arg-inzulín,

A0^LysA21^SerB0^LysB29^Lys’^NE’^Arg-inzulín, A0^LysB0^LysB29^Lys’^NE‘^Lys-inzulín,

A0^LysA21 ^XaaB0^LysB29^Lys’^Ne'^Lys-inzulí n,

A0^LysA21^GlyB0^LysB29^Lys’^NE’^Lys-inzulín,

A0^LysA21^SerB0^LysB29^Lys'^NE‘^Lys-inzulín,

A0^ArgB0^LysB29^Lys'^NE’^Arg-inzulín,

A0^ArgA21^XaaB0^LysB29^Lys’^NE’^Ar9-inzulín,

A0^ArgA21^GlyB0^LysB29^Lys’^NE‘^Arg-inzulín,

A0^ArgA21^SerB0^LysB29^Lys’^NE'^Arg-inzulín,

A0^LysB0^ArgB29^Lys'^NE'^Arg-inzulín,

276/B

A0^LysA21 ^XaaB0^ArgB29^Lys'^NE'^Arg-inzulin,

A0^LysA21 ^GlyB0^ArgB29^Lys’^NE'^Arg-inzulín,

A0^LysA21^SerB0^ArgB29^Lys'^NE'^Arg-inzulín,

A0^LysB0^Ar9B29^Lys'^NE'^Lys-inzulín,

A0^LysA21 ^XaaB0^ArgB29^Lys'^NE‘^Lys-inzulín,

A0^LysA21^GlyB0^ArgB29^Lys'^NE’^Lys-inzulín,

A0^LysA21^SerB0^ArgB29^Lys’^NE’^Lys-inzulín,

A0^Ar9B0^LysB29^Lys’^NE'^Lys-inzulin,

A0^Ar9A21^XaaB0^LysB29^Lys'^NE’^Lys-inzulín,

A0^Ar9A21^GlyB0^LysB29^Lys'^Ne’^Lys-inzulín,

Ao^ArgA21 ^SerB0^LysB29^Lys'^NE'^Lys-inzulín,

A0^gHRB0^gHRB29^Lys’^NE’^Arg-inzulín,

A0^gHRA21^XaaB0^gHRB29^Lys’^NE’^Arg-inzulín,

A0^gHRA21^GlyB0^gHRB29^Lys'^NE’^Arg-inzulín,

A0^gHRA21 ^SeľB0^gHRB29^Lys'^NE’^Aľg-inzu!ín,

A0^9HRB0^9HRB29^Lys'^NE’^Lys-inzulín,

A0^gHRA21^XaaB0^gHRB29^Lys‘^NE’^Lys-inzulín,

A0^gHRA21 ^GlyB0^gHRB29^Lys'^Ne‘^Lys-inzulín,

A0^gHRA21^SerB0^gHRB29^Lys’^NE'^Lys-inzulín,

A0^ArgA21 ^XaaB0^Arg B28^Lys'^NE'^ArgB2 9^Pro-i nzu I í n,

A0^ArgA21^XaaB0^LysB28^Lys’^Ne’^ArgB29^Pro-inzulín,

A0^LysA21^Xaa B 0^Arg B2 8^Lys'^NE’^ArgB29^Pro-i nzu I í n,

A0^LysA21^XaaB0^LysB28^Lys_NE'^ArgB29^Pro-inzulín,

A0^ArgA21^XaaB28^Lys'^NE’^ArgB29^Pro-inzulín,

276/B

Α0^Αγ9Α2 1^G,y Β2 8^{Lys NĽ}'^Aľ9 B2 9^Pro-i ηzu I í η, A0^Ar9A21^SeľB28^Lys'^NE'^Aľ9B29^PľO-inzulín, A0^Ar9A21^XaaB28^Lys'^NE'^LysB29^Pro-inzulín, A0^Ar9A21^GlyB28^Lys'^NK‘^LysB29^Pro-inzulín, A0^Ar9A21^SerB28^Lys'^Ne’^LysB29^Pro-inzulín, A0^LysA21^XaaB28^Lys'^NE’^Ar9B29^Pro-inzulín, A0^LysA21^GlyB28^Lys'^Ns’^AľgB29^Pro-inzulín, A0^LysA21^SerB28^Lys'^Ne’^Ar9B29^Pro-inzulín, A0^LysA21 ^XaaB28^Lys'^Ne‘^LysB29^Pro-inzulín, A0^LysA21^GlyB28^Lys’^Ne’^LysB29^Pro-inzulin, a A0^LysA21^SeľB28^Lys'^N£‘^LysB29^Pro-ínzulín, Ao^ArgB29^Lys'^NE'^Aľ9B31^Ar9-inzulín, A0^Ar9A21^XaaB29^Lys‘^NE’^Ar9B31^Ar9-inzulín, Ao^ArgA21^G,yB29^Lys’^Ne'^Ar9B31^Ar9-inzulín, A0^ArgA21^SerB29^Lys'^NE'^Ar9B31^Ar9-inzulín, Ao^ArgB29^{Lys NE}'^LysB31^Ar9-inzulin, A0^ArgA21 ^XaaB29^Lys’^NE’^LysB31 ^Ar9-inzulí n, Ao^ArgA21^GlyB29^Lys'^NE’^LysB31^Ar9-inzulín, A0^Ar9 A21 ^SerB2 9^Lys'^Ne'^Lys B 31 ^Ar9-i nzu I í n, A0^LysB29^Lys‘^NE'^Ar9B31^Lys-inzulín, A0^LysA21^XaaB29^Lys‘^NE'^Ar9B31^Lys-inzulín, A0^LysA21^GlyB29^Lys'^NE’^Aľ9B31^Lys-inzulín, a A0^LysA21 ^SerB29^LysNE'^Ar9B31 ^Lys-inzulí n.

276/B

V inom výhodnom uskutočnení inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu zahrnuje modifikáciu N-terminálneho konca reťazca A a Nterminálneho konca reťazca B. Takouto inzulínovou zlúčeninou je taká, kde sa kovalentne viazal Arg k N-terminálnemu koncu inzulínového reťazca A a kovalentne sa viazal Arg k inzulínu reťazca B. V jednom výhodnom uskutočnení sa predložený vynález týka inzulínovej zlúčeniny, kde:

(a) reťazec A všeobecného vzorca I,

A-l AO Al A2 A3 A4 Ά5 A6 A7 Ά8 A9 A10 Al1 A12 A13 Xaa-Xaa-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-LeuΆ14 A15 Ά16 A17 A18 A19 A20 A21 Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa, kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca I je znázornená v Sekv. ID č. 1, a (b) reťazec B všeobecného vzorca II,

B-l BO BI B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 BIO Bil B12 Xaa-Xaa-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-ValB13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-ThrB28 B29 B30

Xaa-Xaa-Xaa, kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca II je znázornená v Sekv. ID č. 2, kde:

Xaa v polohe A-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe AO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín alebo alfa metyl arginín,

276/B

Xaa v polohe A21 je geneticky kódovatelná aminokyselina,

Xaa v polohe B-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginin alebo je neprítomný,

Xaa v polohe BO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín alebo alfa metyl arginin,

Xaa v polohe B28 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B29 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B30 je Thr, Ala alebo je neprítomný, jeden z Xaa v polohe B28 alebo Xaa v polohe B29 je Lys, a

Xaa v polohe B28 a Xaa v polohe B29 nie sú oba Lys.

Tiež je poskytnutý spôsob prípravy mikrokryštálu zahrňujúceho tento inzulínový analóg a zinok. Vo výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu mikrokryštál zahrňuje inzulínový analóg, zinok a protamín.

Tiež je poskytnutý spôsob prípravy mikrokryštálu, zahrňujúci uvedenie do kontaktu zložiek zahrňujúcich inzulínovú zlúčeninu a divalentný kovový katión vo vodnom rozpúšťadle pri hodnote pH, ktorá umožňuje tvorbu hexamérov inzulínovej zlúčeniny. Uvedenie do kontaktu” v širokom význame zodpovedá umiestneniu zložiek do roztoku. V menej širokom význame znamená uvedenie do kontaktu otáčanie, vírenie, pretrepávanie alebo vibrácie roztoku zložiek. Viac špecificky sa uvedenie do kontaktu týka miešania zložiek.

V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je inzulínový analóg zvolený zo súboru, zahrňujúceho:

A0^Ar9B0^Aľ9-inzulín, A0^Ar9A21^XaaB0^Ar9-inzulín, A0^Ar9A21^GlyB0^Ar9-inzulín,

276/B

A0^ArgA21^SerB0^Arg-inzulín,

AO^LysBO^Lys-inzulín,

A0^LysA21^XaaB0^Lys-inzulín, A0^LysA21^GlyB0^Lys-inzulín, A0^LysA21^SerB0^Lys-inzulín, AO^ArgBO^Lys-inzulín,

A0^Ar9A21^XaaB0^Lys-inzulín, A0^Ar9A21^GlyB0^Lys-inzulín, A0^ArgA21^SerB0^Lys-inzulín, A0^LysB0^Aľ9-inzulín,

A0^LysA21^XaaB0^Arg-inzulín, A0^LysA21^GlyB0^Arg-inzulín, a A0^LysA21^SerB0^Arg-inzulín.

Inzulínový templát” predstavuje inzulínovú zlúčeninu, ktorá je modifikovaná za účelom prípravy inzulínového analógu alebo derivátu predloženého vynálezu. Inzulínové zlúčeniny, ktoré sa môžu použiť ako templáty pre následnú chemickú modifikáciu, zahrňujú, ale neobmedzujú sa iba, na akýkoľvek z prirodzene sa vyskytujúcich inzulínov a výhodne ľudský inzulín; analóg ľudského inzulínu; B28^Lys, B29^PľO-inzulín; AO^Aľg-inzulín; A21^Xaainzulin; A0^ArgA21a^Xaa-inzulín, BO^Arg-inzulín; B28^Asp-inzulín; B3^LysB29^GIU-inzulín a inzulínovú zlúčeninu, kde jedna alebo dve voľné amínové skupiny sa predtým derivatizovali s ochrannou skupinou, výhodne terc-butyloxykarbonylom (Boe) kvôli zvýšeniu reakčnej špecificity následného acylačného kroku. Výhodne je templátom inzulínu rekombinantný inzulín. Výhodnejšie je templátom inzulínu rekombinantný ľudský inzulín alebo jeho analóg. Najvýhodnejšie je templátom inzulínu rekombinantný ľudský inzulín.

276/B

A21 -inzulín sa môže použiť ako templát inzulínu, pokiaľ sa požaduje nahradiť asparagín v polohe 21 divokého typu všeobecného vzorca I (zodpovedajúci pozícii 23 Sekv. č. 2) inou aminokyselinou, za účelom zníženia alebo za účelom zabránenia deamidácie inzulínovej zlúčeniny a/alebo predĺženia účinku inzulínovej zlúčeniny. Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je A21^Asn nahradený A21^Gly kvôli príprave A21^Gly-inzulínu. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je A21^Asn nahradený A21^Thr za účelom prípravy A21^Thr-inzulínu. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky je A21^Asn nahradený A21^Ala za účelom prípravy A21^Ala-inzulínu. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je A21^Asn nahradený A21^Ser za účelom prípravy A21^Ser-inzulínu.

Rekombinantný proteín predstavuje proteín, ktorý sa exprimuje v eukaryotickej alebo prokaryotickej bunke z vektoru expresie obsahujúceho polynukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje proteín. Výhodne je rekombinantný proteín rekombinantnou inzulínovou zlúčeninou.

Rekombinantná inzulínová zlúčenina” je inzulínová zlúčenina, ktorá sa exprimuje v eukaryotickej alebo prokaryotickej bunke z vektoru expresie obsahujúceho polynukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje reťazec A a reťazec B inzulínovej zlúčeniny a prípadne C-peptid proinzulínovej zlúčeniny. V jednom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je rekombinantným proteínom rekombinantný inzulín alebo proinzulínový derivát. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je rekombinantným proteínom rekombinantný inzulín alebo proinzulínový analóg.

Rekombinantný ľudský inzulín” predstavuje rekombinantný inzulín majúci reťazec A inzulínu divokého typu (Sekv. ID č. 3) a reťazca B (Sekv. ID č. 4) aminokyselinových sekvencií.

Geneticky kódovaná aminokyselina” predstavuje aminokyselinu, ktorá je kódovaná genetickým kodónom, ktorý je skupinou troch báz deoxyribonukleovej kyseliny, pozri Biochemistry, L. Stryer, Ed, 3rd ed., W. H. Freeman and Co.,

276/B

New York, s. 99 - 107 (1988). Geneticky kódované aminokyseliny zahrňujú alanín (Ala), arginín (Arg), asparagín (Asn), kyselinu asparágovú (Asp), cysteín (Cys), kyselinu glutámovú (Glu), glutamín (Gin), glycín (Gly), histidín (His), izoleucín (lle), leucín (Leu), lyzín (Lys), metionín (Met), fenylalanín (Phe), prolín (Pro), serín (Ser), treonín (Thr), tryptofán (Trp), tyrozín (Tyr) a valín (Val).

Klinicky normálna hladina plazmatickej glukózy na lačno je 70 - 110 mg/dl. Klinicky normálna hladina plazmatickej glukózy po jedle je menej ako 140 mg/dl. Dostatočný na reguláciu krvnej glukózy u subjektu” znamená, že podávanie inzulínovej zlúčeniny vedie ku klinicky normálnej hladine plazmatickej glukózy na lačno.

Znalcovi v odbore dobre známy účinok inzulínu sa môže kvantifikovať s použitím techniky glucose clamp, kde množstvo exogénnej glukózy, ktoré je v priebehu doby potrebné na udržanie vopred určenej hladiny plazmatickej glukózy, sa používa ako meradlo rozsahu a trvania účinku inzulínu spôsobeného inzulínovou zlúčeninou. Napríklad, pozri Búrke a kol., Diabetes Research, 4, 163 - 167 (1987). Typicky sa pri tomto skúmaní glukóza podáva vo vnútrožilovej infúzii. Pokiaľ inzulínová zlúčenina spôsobuje zníženie hladiny plazmatickej glukózy, zvýši sa miera infúzie glukózy tak, že sa udržiava vopred určená hladina plazmatickej glukózy. Keď poklesne účinok inzulínovej zlúčeniny, miera infúzie glukózy sa zníži tak, že sa udržiava vopred určená hladina plazmatickej glukózy.

Účinok inzulínu” znamená, že skúmanie glucose clamp” vyžaduje podávanie inzulínovej zlúčeniny, aby sa miera intravenózneho podávania glukózy do krvi zvýšila kvôli udržaniu vopred určenej hladiny plazmatickej glukózy u subjektu počas trvania pokusu. V jednom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je vopred určenou hladinou glukózy hladina plazmatickej glukózy na lačno. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je vopred určenou hladinou glukózy hladina plazmatickej glukózy po jedle.

Inzulínová zlúčenina má protrahovanú dobu účinku, pokiaľ inzulínová zlúčenina vedie k účinku inzulínu u hyperglykemických, napríklad diabetických, pacientov, ktorý trval dlhšie ako účinok ľudského inzulínu. Výhodne inzulínová

276/B zlúčenina vedie k účinku inzulínu, ktorý trvá od približne 8 hodín do približne 24 hodín po jednom podávaní inzulínovej zlúčeniny. Výhodnejšie účinok inzulínu trvá od približne 10 hodín do približne 24 hodín. Ešte výhodnejšie účinok trvá od približne 12 hodín do približne 24 hodín. Ďalej ešte výhodnejšie účinok trvá od približne 16 hodin do približne 24 hodín. Najvýhodnejšie účinok trvá od približne 20 hodín do približne 24 hodín.

Inzulínová zlúčenina má bazálny účinok inzulínu”, pokiaľ inzulínová zlúčenina vedie ku glukózu znižujúcemu účinku u subjektov, ktorý trvá približne 24 hodín po jednom podávaní inzulínovej zlúčeniny.

Izolovaný proteín” v tu uvedenom význame znamená, že proteín sa odstráni z prostredia, v ktorom sa pripravil. Prirodzene sa vyskytujúci proteín je izolovaný, keď sa odstráni z bunkového prostredia, kde proteín existuje. Rekombinantný proteín je izolovaný, keď sa odstráni z bunkového prostredia, kde sa proteín exprimuje. Chemicky modifikovaný proteín, buď prirodzene sa vyskytujúci alebo rekombinantný, sa izoluje, keď sa odstráni z reakčnej zmesi, kde sa proteín chemicky modifikuje. Výhodne sa izolovaný proteín odstráni od iných proteínov, polypeptidov alebo peptidov. Postupy izolácie proteínu zahrňujú centrifugáciu, chromatografiu, lyofilizáciu alebo elektroforézu. Takéto a iné spôsoby proteínovej izolácie sú dobre známe odborníkovi v odbore. Výhodne sa inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu izoluje.

Modifikácia” proteínu sa týka adície aminokyseliny alebo derivatizovanej aminokyseliny, na substitúciu jednej aminokyseliny za inú alebo na deléciu aminokyseliny. Modifikácia sa môže uskutočniť prostredníctvom rekombinantnej DNA metodiky. Napríklad pozri U.S. patent č. 5,506,202, 5,430,016 a 5,656,782. Alternatívne, modifikácia sa môže uskutočniť prostredníctvom chemickej modifikácie templátu inzulínu, ako je pridanie jednej alebo viacerých chemických skupín k templátu inzulínu alebo odstránenie jednej alebo viacerých chemických skupín z templátu inzulínu. Chemické modifikácie na templáte inzulínu aminokyselinovej bočnej skupiny zahrňujú karbamyláciu, amidáciu, guanidyláciu, sulfonyláciu, acyláciu jednej alebo viacerých alfa-amino skupín, acyláciu ε-amino skupiny (napríklad lyzínovej ε-amino skupiny), N

276/B alkyláciu arginínu, histidínu alebo lyzínu, alkyláciu glutamátových alebo aspartátových skupín karboxylových kyselín a deamidáciu glutamínu alebo asparaginu. Modifikácie terminálnej amino skupiny (napríklad alfa-amino skupiny) zahrňujú, bez obmedzenia, modifikácie v zmysle des-amino, N-nižší alkyl, N-di-nižší alkyl a N-acyl. Modifikácie koncovej karboxyskupiny zahrňujú, bez obmedzenia, modifikácie v zmysle amid, nižší alkyl amid, dialkyl amid a nižší alkylester modifikáciu. Navyše sa môže jedna alebo viacero bočných skupín alebo terminálnych skupín chrániť ochrannými skupinami, ktoré sú známe odborníkovi v odbore.

Aminokyseliny použité za účelom vytvorenia inzulínového analógu alebo inzulínového derivátu podľa predloženého vynálezu môžu byť buď v D- alebo Lforme a môžu byť buď prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny alebo umelé aminokyseliny.

Odvodený Arg” predstavuje arginín, ktorý sa modifikoval prostredníctvom chemickej syntézy. Výhodne Arg deriváty sú tie, ktoré sa získajú prostredníctvom acylácie a/alebo karbamylácie. Vo výhodnom uskutočnení je Arg derivatizovaný od kladne nabitej aminokyseliny. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je Arg derivatizovaný od Arg na epsilon (-Νε) amino skupine za účelom prípravy Arg-N^E-Arg. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je Arg derivatizovaný od Lys na Νε amino skupine za účelom prípravy Arg-N^E-Lys. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je derivatizovaný Arg dArginín (dArg alebo dR), čo je Arg s obrátenou stereochemickou konfiguráciou na alfa uhlíku.

Odvodený Lys” predstavuje lyzín, ktorý sa modifikoval prostredníctvom chemickej syntézy. Výhodné Lys deriváty sú tie, ktoré sa získajú prostredníctvom acylácie a/alebo karbamylácie. Vo výhodnom uskutočnení je Lys derivatizovaný od kladne nabitej aminokyseliny. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je Lys derivatizovaný od Arg na epsilon (-Νε) amino skupine za účelom prípravy Lys-N^E-Arg. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu je Lys derivatizovaný od Lys na epsilon amino skupine za účelom prípravy Lys-N^E-Lys. V inom výhodnom uskutočnení

276/B prihlášky vynálezu je derivatizovaný Lys homoarginínom (homoArg alebo hR). V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je derivatizovaný Lys dLyzínom (dLys alebo dL), čo je Lys s obrátenou stereochemickou konfiguráciou na alfa uhlíku. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je derivatizovaný Lys alfa guanidino homoarginín (gHR).

Ľudský inzulín obsahuje tri voľné amino skupiny: N-terminálnu alfaamino skupinu reťazca A, N-terminálnu alfa-amino skupinu reťazca B a ε-amino skupinu lyzínu reťazca B bočného reťazca. Všeobecne sa môžu alfa a/alebo εamino skupiny proteínov acylovať aktivovanými karboxylovými kyselinami. V tomto kontexte sa acylácia týka tvorby amidovej väzby medzi amínom a karboxylovou kyselinou.

Acylácia N-terminálnej aminokyseliny inzulínového reťazca A aminokyselinou vedie k tvorbe peptidovej väzby. Podobne acylácia Nterminálnej aminokyseliny inzulínového reťazca B aminokyselinou vedie k tvorbe peptidovej väzby. Acylácia ε-amino skupiny Lys aminokyselinou vedie k Lys-N^e-aminokyselinovému derivátu.

Acylovaný Arg” znamená acylovú skupinu, ktorá je kovalentne viazaná k Arg prostredníctvom kovalentnej väzby vytvorenej medzi kyslou skupinou acylobsahujúcej zlúčeniny a ε-amino skupinou Arg.

Acylovaný Lys” znamená acylovú skupinu, ktorá je kovalentne viazaná k Lys prostredníctvom kovalentnej väzby vytvorenej medzi kyslou skupinou acylobsahujúcej zlúčeniny a Lys.

Karbamylovaný inzulín” predstavuje karbamylovú skupinu, ktorá je kovalentne viazaná k inzulínu prostredníctvom kovalentnej väzby vytvorenej medzi karbonylovým uhlíkom karbamylovej skupiny a karbamyl-obsahujúcej zlúčeniny a amino skupiny inzulínu.

Karbamylovaný Arg” znamená karbamylovú skupinu, ktorá je kovalentne viazaná k Arg prostredníctvom kovalentnej väzby vytvorenej medzi karbonylovým uhlíkom karbamylovej skupiny a karbamyl-obsahujúcej zlúčeniny a alfa-amino skupiny Arg.

276/B

Karbamylovaný Lys” znamená karbamylovú skupinu, ktorá je kovalentne viazaná k Lys prostredníctvom kovalentnej väzby vytvorenej medzi karbonylovým uhlíkom karbamylovej skupiny karbamyl-obsahujúcej zlúčeniny a Lys.

Farmaceutický prijateľný” predstavuje klinicky vhodný na podanie človeku. Farmaceutický prijateľný prípravok neobsahuje toxické prvky, nežiaduce znečistenie a podobne a neinterferuje s účinkom aktívnych zlúčenín.

Farmaceutická kompozícia” predstavuje kompozíciu, ktorá je klinicky prijateľná po podaní ľudskému subjektu. Inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu sa môže formulovať vo farmaceutickej kompozícii tak, že proteín interaguje s jednou alebo viacerými anorganickými bázami a anorganickými a organickými kyselinami, kvôli príprave soli. Kyseliny, ktoré sa bežne používajú za účelom prípravy adičných solí kyselín, sú anorganické kyseliny ako sú kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina jódovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná a podobne a organické kyseliny ako sú kyselina p-toluénsulfónová, kyselina metánsulfónová, kyselina šťaveľová, kyselina p-brómfenylsulfónová, kyselina uhličitá, kyselina jantárová, kyselina citrónová, kyselina benzoová, octová kyselina, trifluóroctová kyselina a podobne. Príklady takýchto soli zahrňujú sulfát, pyrosulfát, bisulfát, sulfit, bisulfit, fosforečnan, hydrogénfosforečnan, dihydrogénfosforečnan, metafosforečnan, pyrofosforečnan, chlorid, bromid, jodid, octan, propionát, dekanoát, kaprylát, akrylát, formiát, izobutyrát, kaproát, heptanoát, propiolát, oxalát, malonát, sukcinát, suberát, sebakát, fumarát, maleát, butín-1,4-dioát, hexín-1,6-dioát, benzoát, chlórbenzoát, metylbenzoát, dinitrobenzoát, hydroxybenzoát, metoxybenzoát, ftalát, sulfonát, xylénsulfonát, fenyloctan, fenylpropionát, fenylbutyrát, citrát, laktát, gama-hydroxybutyrát, glykolát, tartrát, metánsulfonát, propánsulfonát, naftalén-1-sulfonát, naftalén-2-sulfonát, mandelát a podobne.

Bázy adičných solí zahrňujú tie, ktoré sú derivátmi anorganických báz, ako je amoniak alebo alkálie alebo hydroxidy kovov alkalických zemín, uhličitany, hydrogénuhličitany a podobne. Tie bázy, ktoré sú užitočné na

276/B prípravu solí takto podľa predloženého vynálezu, zahrňujú hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid amónny, uhličitan draselný a podobne.

Mikrokryštál” predstavuje pevnú látku, ktorá zahrňuje primárne v kryštalickom stave a s mikroskopickou veľkosťou, typicky s najdlhším rozmerom v rozmedzí od 1 gm do 100 pm. Mikrokryštalický” znamená stav mikrokryštálu.

Amorfný precipitát znamená nerozpustný materiál, ktorý nemá kryštalickú štruktúru. Znalec v odbore je schopný rozpoznať kryštály od amorfných precipitátov.

Suspenzia predstavuje zmes tekutej fázy a fázy pevnej látky, ktorá pozostáva z nerozpustných alebo málo rozpustných častíc, ktoré sú dlhšie ako by zodpovedalo veľkosti koloidnej častice. Napríklad zmesi NPH mikrokryštálov a vodného rozpúšťadla tvoria suspenzie.

Suspenzný prípravok” predstavuje farmaceutickú kompozíciu, kde aktívne činidlo prítomné vo fáze pevnej látky, napríklad mikrokryštalická pevná látka, amorfný precipitát alebo oboje, je jemne dispergované do vodného rozpúšťadla. Jemne dispergovaná pevná látka je taká, že sa môže suspendovať celkom jednotným spôsobom vo vodnom rozpúšťadle účinkom mierneho miešania zmesi, čo takto vedie k rozumne jednotnej suspenznej forme, z ktorej sa môže extrahovať dávkovací objem. Príklady komerčne dostupných inzulínových suspenzných formulácií zahrňujú napríklad NPH, PZI a Ultralente. Malá časť pevnej látkovej hmoty v mikrokryštalickej suspenznej formulácii môže byť amorfná. Výhodne je podiel amorfného materiálu menší ako 10 % a najvýhodnejšie menší ako 1 % pevnej látkovej hmoty v mikrokryštalickej suspenzii. Podobne môže byť malá časť pevnej látkovej hmoty v suspenzii amorfného precipitátu mikrokryštalická.

Protamín” predstavuje zmes silne bázických proteínov, ktorá sa získa z rybích spermií. Priemerná molekulová hmotnosť proteínov v protamine je približne 4200 (Hoffmann, J. A. a kol., Protein Expression and Purification, 1, 127 - 133 (1990)). Protamín” sa môže týkať prípravkov proteínov, ktoré sú relatívne bez obsahu soli, často nazývané protamínová báza”.

276/B

Protamín sa tiež týka prípravkov zložených zo solí proteínov, napríklad protamín sulfátu. Komerčné prípravky sa veľmi odlišujú svojím obsahom solí.

Vodné rozpúšťadlo” predstavuje tekuté rozpúšťadlo, ktoré obsahuje vodu. Systém vodného rozpúšťadla sa môže skladať výhradne z vody, môže sa skladať z vody spolu s jedným alebo viacerými miešateľnými rozpúšťadlami alebo môže obsahovať rozpúšťadlá. Bežne používané miešateľné rozpúšťadlá sú organické alkoholy s krátkym reťazcom ako sú metanol, etanol, propanol; ketóny s krátkym reťazcom ako je acetón; a polyalkoholy ako je glycerol.

Činidlo izotonicity predstavuje zlúčeninu, ktorá je fyziologicky tolerovaná a dodáva vhodnú tonicitu prípravku za účelom zabránenia toku vody cez bunkové membrány, ktoré sú v styku s podávaným prípravkom. Glycerol, ktorý je tiež známy ako glycerín, a manitol sa bežne používajú ako činidlá izotonicity. Iné činidlá izotonicity zahrňujú soli, napríklad chlorid sodný a monosacharidy, napríklad dextrózu a laktózu. Výhodne je činidlom izotonicity glycerol.

Hexamér-stabilizujúca zlúčenina” predstavuje zlúčeninu neproteínového charakteru, zlúčeninu s malou molekulovou hmotnosťou, ktorá stabilizuje inzulínovú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu v stave hexamerickej asociácie. Fenolové zlúčeniny, najmä fenolové konzervačné činidlá, sú najlepšie známe stabilizujúce zlúčeniny pre inzulínové zlúčeniny. Výhodne sa vyberie hexamér-stabilizujúca zlúčenina zo skupiny zahrňujúcej fenol, m-krezol, o-krezol, p-krezol, chlórkrezol, metylparabén alebo zmesi dvoch alebo viacerých týchto zlúčenín. Výhodnejšie je hexamér-stabilizujúca zlúčenina fenol alebo m-krezol alebo ich zmes.

Konzervačné činidlo” predstavuje zlúčeninu, ktorá sa pridá k farmaceutickej formulácii, aby účinkovala ako antimikrobiálne činidlo. Konzervačné činidlo, ktoré sa používa vo formuláciách podľa predloženého vynálezu, môže byť fenolové konzervačné činidlo a môže byť rovnaké ako hexamér-stabilizujúca zlúčenina alebo iné ako hexamér-stabilizujúca zlúčenina. Parenterálny prípravok musí spĺňať nároky na účinnosť konzervačného činidla, aby mohol byť z neho komerčne dostupný produkt pre mnohé použitia. Medzi

276/B konzervačné činidlá, ktoré sú známe v odbore a sú účinné a prijateľné pre parenterálny prípravok, sú benzalkonium chlorid, benzetonium, chlórhexidín, fenol, m-krezol, benzylalkohol, metylparabén, chlórbutanol, o-krezol, p-krezol, chlórkrezol, dusičnan fenyl ortuti, timerosal, benzoová kyselina, butylparabén, etylparabén, fenoxyetanol a fenyletylalkohol, propylparabén, benzylchlórkrezol, chlórkrezol a ich rôzne zmesi.

Fenolové konzervačné činidlo” zahrňuje zlúčeniny, ktoré sa vyberú zo skupiny zahrňujúcej fenol, m-krezol, o-krezol, p-krezol, chlórkrezol, metylparabén a ich zmesi. Niektoré fenolové konzervačné činidlá, ako sú fenol a m-krezol, sú známe tým, že sa viažu k inzulínu podobným molekulám a touto cestou vedú k zmenám v konformácii, ktorá zvýši buď fyzikálnu alebo chemickú stabilitu alebo oboje. Výhodne je fenolovým konzervačným činidlom m-krezol alebo fenol. Pufor alebo farmaceutický prijateľný pufor” predstavuje zlúčeninu, ktorá je bezpečná na použitie v inzulínových prípravkoch a ktorá má pH kontrolujúce účinok prípravku pri hodnote pH požadovanej pre formuláciu. Hodnota pH kryštalického prípravku podľa predloženého vynálezu je od približne 6,0 do približne 8,0. Hodnota pH roztoku prípravku podľa predloženého vynálezu je od približne 3,5 do približne 6,0.

Farmaceutický prijateľné pufre na kontrolu hodnoty pH pri mierne kyslých hodnotách pH na mierne bázické hodnoty pH zahrňujú také zlúčeniny ako je laktát; tartrát; fosforečnan a najmä fosforečnan sodný; octan a obzvlášť octan sodný; citrát a najmä citrát sodný; arginín; TRIS; a histidín. TRIS” znamená 2amino-2-hydroxymetyl-1,3-propándiol a akúkoľvek jeho farmakologicky prijateľnú soľ. Voľná báza a hydrochloridová forma sú dve bežné formy TRIS. TRIS je tiež známy v odbore ako trimetylol aminometán, trometamín a tris(hydroxy-metyl)aminometán. Iné farmaceutický prijateľné pufre, ktoré sú vhodné na kontrolu hodnoty pH na požadovanú hodnotu, sú známe odborníkovi v odbore.

Rýchlo účinkujúci inzulínový analóg” vykazuje hypoglykemizujúci účinok, ktorý (a) začína skôr po podkožnom podaní ako ľudský inzulín a/alebo (b) vykazuje kratšiu dobu trvania účinku ako ľudský inzulín po podkožnom podaní.

276/B

B28^LysB29^Pro-inzulín (tiež nazývaný lispro” inzulín) je rýchlo účinkujúci inzulínový analóg, kde sa zamení Pro v polohe 28 inzulínu divokého typu reťazca B (Sekv. ID č. 4) a Lys v polohe 29 inzulínu divokého typu reťazca B (Sekv. ID č. 4). Pozri napríklad U.S. patent č. 5,504,188 a 5,700,662. Iný rýchlo účinkujúci inzulínový analóg je B28^Asp-inzulín, kde sa Pro v polohe 28 reťazca B divokého typu nahradí Asp. Pozri U.S. patent č. 6,221,633. Iný rýchlo účinkujúci inzulínový analóg je B3^LysB29^GIU-inzulín, pozri U.S. patent č. 6,221,633.

Tiež sa tu poskytuje spôsob prípravy mikrokryštálu zahrňujúceho inzulínovú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu. V jednom uskutočnení neobsahuje mikrokryštál protamín. V inom uskutočnení predloženého vynálezu mikrokryštál neobsahuje protamín a neobsahuje divalentný katión, napríklad zinok. Takýto kryštál je obzvlášť vhodný na prípravu kryštálov z roztoku alebo v bezvodej forme na následné formulácie.

V inom uskutočnení obsahuje mikrokryštál protamín.

V inom uskutočnení obsahuje mikrokryštál ako inzulínovú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu, tak i ľudský inzulín. V jednom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu sa mikrokryštál použije za účelom vytvorenia roztoku prípravku. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu sa mikrokryštál použije za účelom vytvorenia suspenzie prípravku.

Tiež sa poskytuje spôsob prípravy suspenzie prípravku zahrňujúci inzulínovú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu. Tiež sa poskytuje spôsob prípravy kompozície zahrňujúcej prípravok v suspenzii. V jednom uskutočnení obsahuje prípravok v suspenzii nerozpustnú fázu a fázu roztoku, nerozpustnú fázu zahrňujúcu mikrokryštál podľa predloženého vynálezu a fázu roztoku zahrňujúcu vodu. Pokiaľ sa požaduje, obsahuje fáza roztoku ľudský inzulín alebo rýchlo účinkujúci inzulínový analóg, ako sú B28^LysB29^PľO-inzulín, B28^Aspinzulín alebo B3^LysB29^Glu.

Formulácia v suspenzii sa môže použiť na prípravu lieku na liečbu diabetes mellitus. Formulácia v suspenzii sa môže tiež použiť za účelom liečby diabetes mellitus, v spôsobe zahrňujúcom podanie prípravku v suspenzii

276/B subjektu v množstve, ktoré je dostatočné na reguláciu koncentrácie krvnej hladiny glukózy u subjektu.

Inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu môže byť v komplexe s vhodným divalentným kovovým katiónom. Divalentný kovový katión predstavuje ión alebo ióny, ktoré sa podieľajú na tvorbe komplexu s množstvom molekúl proteínov. Prechodné kovy, alkalické kovy a kovy alkalických zemín sú príkladmi kovov, ktoré sú známe na prípravu komplexov s inzulínom. Prechodné kovy sú výhodné. Výhodne je divalentný kovový katión s jedným alebo viacerými katiónmi, ktoré sa zvolia zo súboru zahrňujúceho zinok, meď, kobalt, horčík, vápnik, kadmium, nikel a železo. Výhodnejšie je divalentným kovovým katiónom zinok. Výhodne sa zinok poskytuje vo forme solí, ako sú síran zinočnatý, chlorid zinočnatý, oxid zinočnatý alebo octan zinočnatý. Divalentné kovové komplexy inzulínovej zlúčeniny sú všeobecne nerozpustné vo vodnom roztoku v oblasti hodnôt fyziologického pH. Tieto komplexy sa takto môžu podávať podkožné ako suspenzia a vykazujú zníženú mieru uvoľňovania in vivo, čím sa predlžuje čas účinku zlúčeniny.

S cieľom získať komplexy medzi inzulínovou zlúčeninou podľa predloženého vynálezu a divalentným kovovým katiónom sa proteín rozpustí vo vhodnom pufre a za prítomnosti soli kovu. Zmes sa nechá inkubovať pri teplote okolia, čím sa umožní precipitácia komplexu. Vhodnými puframi sú tie, ktoré udržiavajú zmes pri hodnote pH v oblasti od približne 3,0 do približne 9,0 a neinterferujú s reakciou tvorby komplexov. Príklady zahrňujú fosforečnanové pufre, octanové pufre, citrátové pufre a Goodeove pufre, napríklad HEPES, Tris a Tris acetát. Vhodné kovové soli sú tie, kde je kov dostupný pre tvorbu komplexov. Príklady vhodných solí zinku zahrňujú chlorid zinočnatý, octan zinočnatý, oxid zinočnatý a síran zinočnatý.

Chránená aminokyselina” je aminokyselina, ktorá má všetky z reaktívnych funkčných skupín až na jednu reverzibilne derivatizované tak, že iba jedna funkčná skupina je reaktívna. Napríklad v prípade chránenej aktivovanej karboxylovej kyseliny je alfa-karboxylátová skupina reaktívna, ale všetky iné funkčné skupiny na aktivovanej karboxylovej kyseline sú nereaktívne.

276/B

Chránená aminokyselina je nechránená”, keď sa odstráni funkčná skupina. Výhodne je chránenou aminokyselinou chránený arginín.

Konzervatívna substitúcia” je nahradenie aminokyseliny inou aminokyselinou, ktorá má rovnaký celkový elektrický náboj a približne rovnakú veľkosť a rovnaký tvar. Aminokyseliny s alifatickými alebo substituovanými alifatickými aminokyselinovými bočnými reťazcami majú približne rovnakú veľkosť, keď sa celkový počet uhlíkov a heteroatómov na ich bočných reťazcoch odlišuje o nie viac ako približne štyri. Majú približne rovnaký tvar, keď sa počet vetiev na ich bočných reťazcoch odlišuje o nie viac ako jeden. O aminokyselinách s fenylovou alebo substituovanou fenylovou skupinou na ich bočných reťazcoch sa predpokladá, že majú približne rovnakú veľkosť a tvar. Nižšie je uvedených päť skupín aminokyselín. Náhrada aminokyseliny inzulínu inou aminokyselinou z rovnakej skupiny vedie ku konzervatívnej substitúcii.

Skupina I: glycín, alanin, valín, leucín, izoleucín, serín, treonín, cysteín a v prírode sa nevyskytujúce aminokyseliny s C1-C4 alifatickými alebo C1-C4 hydroxyl substituovanými alifatickými bočnými reťazcami (priamy reťazec alebo s jedným vetvením).

Skupina II: kyselina glutámová, kyselina asparágová a v prírode sa nevyskytujúce aminokyseliny s karboxylovou kyselinou substituovanou C1-C4 alifatickými bočnými reťazcami (bez vetvenia alebo jeden vetviaci bod).

Skupina III: lyzín, ornitín, arginín, homoarginín a v prírode sa nevyskytujúce aminokyseliny s amín alebo guanidino substituovanými C1-C4 alifatickými bočnými reťazcami (bez vetvenia alebo jeden vetviaci bod).

Skupina IV: glutamín, asparagín a v prírode sa nevyskytujúce aminokyseliny s amidovo substituovanými C1-C4 alifatickými bočnými reťazcami (bez vetvenia alebo jeden vetviaci bod).

Skupina V: fenylalanín, fenylglycín, tyrozín a tryptofán.

Konzervatívne substitúcie sú výhodne uskutočnené prirodzene sa vyskytujúcimi aminokyselinami, okrem tu inak špecificky uvedených.

276/B

Vysoko konzervatívna substitúcia je nahradenie aminokyseliny inou aminokyselinou, ktorá má rovnakú funkčnú skupinu na bočnom reťazci a skoro rovnakú veľkosť a tvar. Aminokyseliny s alifatickými alebo substituovanými alifatickými aminokyselinovými bočnými reťazcami majú skoro rovnakú veľkosť, keď sa celkový počet uhlíkov a heteroatómov na ich bočných reťazcoch odlišuje nie viac ako dva. Majú skoro rovnaký tvar, keď majú rovnaký počet vetiev v ich bočných reťazcoch. Príklady vysoko konzervatívnych substitúcií zahrňujú valín za leucín, treonín za serín, kyselinu asparágovú za kyselinu glutámovú a fenylglycín za fenylalanín. Príklady substitúcií, ktoré nie sú vysoko konzervatívne, zahrňujú alanín za valín, alanín za serín a kyselinu asparágovú za serín.

V inzulínovej zlúčenine podľa predloženého vynálezu môže mať reťazec A dodatočné 1 až 3 aminokyseliny na reťazci A C-terminálneho konca, čo by boli pozície A22, A23 a A24 všeobecného vzorca I. Výhodne je aminokyselina na každej z pozícií A22, A23 a A24 Xaa, kde Xaa je geneticky kódovatelná aminokyselina.

Reťazec B môže mať ďalších 1 až 6 aminokyselín na reťazci B Cterminálneho konca, čo by boli pozície B31, B32, B33, B34, B35 a B36 všeobecného vzorca II. V jednom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu reťazec B zahrňuje Ala v polohe B31, Arg v polohe B32 a Arg v pozíciách B33. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu reťazec B zahrňuje Ala v polohe B31, Ala v polohe B32, Ala v polohe B33, Ala v polohe B34, Arg v polohe B35 a Arg v polohe B36.

Účinné množstvo” inzulínovej zlúčeniny, mikrokryštálu, suspenzie, roztoku amorfného precipitátu alebo kompozície podľa predloženého vynálezu je množstvo, ktoré vedie k požadovanému účinku inzulínu bez zapríčinenia neprijateľných vedľajších účinkov po podaní subjektu, ktorý potrebuje inzulínovú terapiu. Účinné množstvo” inzulínovej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu podávané subjektu tiež závisí od typu a závažnosti choroby a od charakteristík subjektu, ako sú celkový zdravotný stav, vek, pohlavie, telesná hmotnosť a tolerancia liekov. Znalec v odbore je schopný určiť približné dávkovanie v

276/B závislosti od týchto a iných faktorov. Typicky môže byť terapeuticky účinné množstvo inzulínovej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu v rozmedzí od približne 0,01 mg za deň do približne 1 000 mg za deň pre dospelú osobu. Výhodne sa dávkovanie nachádza v rozmedzí od približne 0,1 mg za deň do približne 100 mg za deň, výhodnejšie od približne 1,0 mg denne do približne 10 mg denne.

Požadovaný terapeutický účinok” zahrňuje jedno alebo viacero z nasledujúceho: 1) zlepšenie symptómu (ov) spojených s diabetes mellitus, 2) oneskorenie nástupu symptómov spojených s diabetes mellitus, 3) predĺženie dĺžky života v porovnaní s neprítomnosťou liečenia a 4) väčšia kvalita života v porovnaní s neprítomnosťou liečenia. Účinné množstvo” inzulínovej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu na liečbu diabetes je napríklad množstvo, ktoré by viedlo k väčšej kontrole koncentrácie krvnej glukózy ako v neprítomnosti liečenia, čím sa dosiahne oneskorenie v začiatku diabetických komplikácií ako sú diabetická retinopatia, diabetická neuropatia alebo choroby obličiek.

Dávku, cestu podávania a počet dávok za deň určí lekár, ktorý berie do úvahy také faktory, ako sú terapeutické ciele, charakter a príčina pacientovej choroby, pohlavie a telesná hmotnosť, fyzická zdatnosť, stravné návyky, spôsob podávania a iné faktory, ktoré sú známe lekárovi poznajúcemu danú problematiku. V širokom rozmedzí by denná dávka bola v rozmedzí od približne 1 nmol/kg telesnej hmotnosti do približne 6 nmol/kg telesnej hmotnosti (6 nmol sa pokladá za ekvivalent približne 1 jednotky účinku inzulínu). Dávka medzi približne 2 a približne 3 nmol/kg je typicky prítomná v inzulínovej terapii.

Lekár, ktorý sa vyzná v liečbe diabetes, je schopný vybrať terapeuticky najvýhodnejšie prostriedky na podanie prípravku podľa predloženého vynálezu. Parenterálne cesty podávania sú výhodné. Typické cesty parenterálneho podávania roztoku a suspenzie formuláciou inzulínu sú podkožné podanie a podanie do svalu. Kompozície a prípravok podľa predloženého vynálezu sa môžu tiež podávať nosom, cez sliznicu ústnej dutiny, pľúcnou cestou alebo očným podaním.

276/B

Inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu a jej kompozície sa môžu podávať parenterálne. Parenterálne podanie môže zahrňovať napríklad systémové podanie, ako sú intramuskulárne, intravenózne, podkožné alebo intraperitoneálne injekcie. Výhodnou cestou podania je podkožná cesta.

Inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu a jej kompozície sa môžu podávať subjektu v spojení s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými excipientmi, nosičmi alebo riedidlami ako časť farmaceutickej kompozície na liečbu hyperglykémie.

Inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu a jej kompozícia môžu byť roztok. Alternatívne môže byť inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu a jej kompozícia suspenziou inzulínovej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu alebo suspenzia proteínu zlúčeniny v komplexe s divalentným kovovým katiónom.

Tiež sa poskytuje spôsob prípravy kompozície zahrňujúcej inzulínovú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu a aspoň jednu zložku zvolenú zo súboru zahrňujúceho činidlo izotonicity, divalentný katión, hexamér-stabilizujúcu zlúčeninu, konzervačné činidlo a pufor.

Vhodné farmaceutické nosiče môžu obsahovať inertné zložky, ktoré neinteragujú s inzulínovou zlúčeninou podľa predloženého vynálezu. Môžu sa použiť štandardné farmaceutické techniky formulácie, ako je opísané v Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Vhodné farmaceutické nosiče na parenterálne podanie zahrňujú napríklad destilovanú vodu, fyziologický roztok, bakteriostatický soľný roztok (soľný roztok obsahujúci približne 0,9 % mg/ml benzylalkoholu), fosforečnanom-pufrovaný soľný roztok, Hankov roztok, Ringer-laktát a podobne. Niektoré príklady vhodných excipientov zahrňujú glycerol, laktózu, dextrózu, sacharózu, trehalózu, sorbitol a manitol.

276/B

Subjektom” je cicavec, výhodne človek, ale môže ním tiež byť zviera, napríklad domáce zvieratá (napríklad psy, mačky a podobne), hospodárske zvieratá (napríklad krava, ovca, prasa, kôň a podobne) a laboratórne zvieratá (napríklad krysa, myš, škrečok a podobne).

Templát inzulínu a analóg inzulínu sa môžu získať s použitím metód rekombinácie. Napríklad sa môže použiť rekombinantný proinzulín alebo analóg proinzulínu. Alternatívne sa môžu rekombinantné inzulínové A- a B-reťazce exprimovať v hostiteľských bunkách a potom rekombinovať. Alternatívne sa môže použiť inzulínový prekurzor. Každá z týchto metodológií je dobre známa odborníkovi v odbore. Napríklad, pozri U.S. patent č. 4,421,685, U.S. patent č. 4,569,791, U.S. patent č. 4,569,792, U.S. patent č. 4,581,165, U.S. patent č. 4,654,324, U.S. patent č. 5,304,473, U.S. patent č. 5,457,066, U.S. patent č. 5,559,094, európsky patent predloženej prihlášky vynálezu EP 741188 A1. Pozri tiež Chance a kol., Diabetes Čare 16 (Suppl. 3), 133 - 142 (1993); Chance a koľ, Peptides: Synthesis-Structure-Function”, v Proceedings of the 7th Američan Peptide Symposium, Rich, D. H. a kol., edit., Pierce Chemical Company, Rockford, ÍL, s. 721 - 738 (1981); a Frank a kol., Munch. med. Wsch., 125 (Suppl. 1), S14 - 20 (1983).

Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu sa A0^Lys'^NE' ^Aľ9-A21^GlyB29^Lys'^NE‘^Ar9-inzulín selektívne pripraví acyláciou ε-amino skupiny A0^LysA21^GlyB29^Lys-inzulinu. Selektívnu acyláciu ε-amino skupiny môže uskutočniť znalec v odbore. Napríklad pozri U.S. patent č. 5,646,242. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu A0^Lys’^NE~^Ar9A21^GlyB29^Lys~^NE~^Ar9inzulín sa selektívne pripraví acyláciou ε-amino skupiny A21^GlyC64^Aľ9C65^Lysľudského proinzulínu a natrávením acylovaného proinzulínového derivátu s proteázami za účelom odstránenia nechcených aminokyselín, za súčasného ponechania intaktného C65^Lys'^NE'^Ar9 a B29^Lys_NE‘^Ar9 za účelom prípravy A0^Lys‘^NE‘ ^Arg-A21^GlyB29^Lys'^NE‘^Ar9-inzulínového derivátu.

276/B

Rekombinantné inzulínové zlúčeniny sa môžu pripraviť spôsobom, ktorý pozostáva z kultivácie hostiteľskej bunky obsahujúcej DNA sekvenciu kódujúcu inzulínovú zlúčeninu alebo jej prekurzor a schopný expresie polypeptidu vo vhodnom živnom médiu za podmienok, umožňujúcich expresiu peptidu, za čím nasleduje získanie výsledného peptidu z hostiteľských buniek a/alebo z média kultúry.

Médium, ktoré sa použije na prípravu kultúry buniek, môže byť akékoľvek konvenčné médium vhodné na rast hostiteľských buniek, ako sú minimálne alebo komplexné médiá, ktoré sú vhodne obohatené. Vhodné médiá sú dostupné od komerčných dodávateľov alebo sa môžu pripraviť na základe spôsobov, ktoré sa získajú z publikácií (napríklad v katalógoch Američan Type Culture Collection). Peptid vytvorený bunkami sa potom získa z média kultúry konvenčnými spôsobmi, ktoré zahrňujú oddelenie hostiteľských buniek od média centrifugáciou alebo filtráciou, precipitáciou zložiek proteínového charakteru supernatantu alebo filtráciou s použitím soli, napríklad síranu amónneho, purifikáciou množstvom chromatografických spôsobov, napríklad iónomeničovou chromatografiou, gólovou filtračnou chromatografiou, afinitnou chromatografiou a podobne, v závislosti od daného peptidu.

V súlade s tým je tu uvedený spôsob expresie inzulínovej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, zahrňujúci kultiváciu hostiteľskej bunky obsahujúcej inzulínovú zlúčeninu za podmienok vhodných na propagáciu hostiteľskej bunky a na expresiu inzulínovej zlúčeniny. Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu spôsob ďalej zahrňuje čistenie inzulínovej zlúčeniny z hostiteľskej bunky. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu spôsob ďalej zahrňuje čistenie inzulínovej zlúčeniny z média kultúry. V doteraz inom výhodnom uskutočnení spôsob ďalej zahrňuje čistenie inzulínovej zlúčeniny ako z hostiteľskej bunky, tak z média kultúry.

276/B

Vo výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je hostiteľská bunka eukaryotickou bunkou. Výhodne je eukaryotickou bunkou bunka huby, bunka kvasinky, bunka cicavca alebo nesmrteľnej cicavčej bunkovej línie. V inom výhodnom uskutočnení prihlášky vynálezu je hostiteľská bunka prokaryotickou bunkou. Výhodne je prokaryotickou bunkou bakteriálna bunka a výhodnejšie je ňou bunka E. coli.

Sekvencia nukleovej kyseliny kódujúcej inzulínovú zlúčeninu alebo jej prekurzor sa môže vložiť do akéhokoľvek vektoru, ktorý sa môže pohodlne podrobiť spôsobom rekombinantnej DNA a výber vektoru často záleží na hostiteľskej bunke, do ktorej sa vnesie. Vektor takto môže byť autonómne sa replikujúcim vektorom, napríklad vektorom, ktorý existuje ako extrachromozomálna entita, ktorej replikácia je nezávislá od chromozomálnej replikácie, napríklad plazmid. Alternatívne môže byť vektorom ten, ktorý sa po vnesení do hostiteľskej bunky integruje do genómu hostiteľskej bunky a replikuje sa spoločne s chromozómom alebo chromozómami, do ktorých sa integruje.

Vektor je výhodne vektorom expresie, kde sa DNA sekvencia kódujúca peptid operabilne viaže na dodatočné segmenty, ktoré sú potrebné na transkripciu DNA, ako je promótor. Promótorom môže byť akákoľvek DNA sekvencia, ktorá vykazuje transkripčnú aktivitu vo vybranej hostiteľskej bunke a môže byť derivatizovaná od génov kódujúcich proteíny, ktoré sú buď homológne alebo heterológne s hostiteľskou bunkou. Príklady vhodných promótorov na vedenie transkripcie DNA kódujúcej peptid podľa predloženého vynálezu v množstve hostiteľských buniek sú dobre známe v odbore.

DNA sekvencia kódujúca peptid sa môže tiež, pokiaľ je to potrebné, operabilne spojiť s vhodným terminátorom, polyadenylačnými signálmi, sekvenciami, ktoré zosilňujú transkripciu a sekvenciami, ktoré zosilňujú transláciu. Rekombinantný vektor podľa predloženého vynálezu môže ďalej obsahovať DNA sekvencie, ktoré umožňujú vektoru replikáciu v danej hostiteľskej bunke.

276/B

Vektor môže tiež obsahovať markér selekcie, napríklad gén produktu, ktorý nahradzuje v hostiteľskej bunke defekt alebo gén, ktorý bunku vybaví rezistenciou voči lieku, napríklad ampicilínu, kanamycínu, tetracyklínu, chloramfenikolu, neomycínu, hygromycínu alebo metotrexatu.

Sekrečná signálna sekvencia (tiež známa ako vedúca sekvencia, prepro sekvencia alebo pre sekvencia) sa môže vniesť v rekombinantnom vektore, kvôli nasmerovaniu peptidu podľa predloženého vynálezu na sekrečnú cestu hostiteľských buniek. Sekrečné signálne sekvencie sa spoja s DNA sekvenciou kódujúcou peptid v správnom čítacom rámci. Sekrečné signálne sekvencie sú bežne umiestnené na 5' konci vzhľadom na DNA sekvenciu kódujúcej peptid. Sekrečná signálna sekvencia môže byť normálne spojená s peptidom alebo môže byť vo forme génu, ktorý kóduje iný secernovaný proteín.

Inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu sa môže pripraviť s použitím štandardných spôsobov techník syntézy peptidov v pevnej fáze. Syntetizátory peptidov sú komerčne dostupné napríklad u Applied Biosystems v Foster City CA. Reakčné činidlá na syntézu peptidov fázy pevnej látky sú komerčne dostupné napríklad od Midwest Biotech (Fishers, IN). Syntetizátory peptidov fázy pevnej látky sa môžu použiť v súlade s inštrukciami od výrobcu na blokovanie interferujúcich skupín, ochranu aminokyseliny, ktorá má reagovať, kopuláciu, dekopuláciu a opatrenie nezreagovaných aminokyselín uzáverom.

Typicky sa alfa-N-karbamylom chránená aminokyselina a N-terminálna aminokyselina rastúceho peptidového reťazca na živici kopuluje pri teplote okolia v inertnom rozpúšťadle ako je dimetylformamid, N-metylpyrolidón alebo metylchlorid za prítomnosti kopulačných činidiel ako sú dicyklohexylkarbodiimid a 1-hydroxybenzotriazol a bázy ako je diizopropyletylamín. Alfa-N-karbamylová ochranná skupina sa odstráni z výslednej peptidovej živice s použitím reakčného činidla ako sú kyselina trifluóroctová (TFA) alebo piperidín a kopulačná reakcia sa opakuje s ďalšou požadovanou N-chránenou aminokyselinou, ktorá sa pridá k peptidovému reťazcu. Vhodné amínové ochranné skupiny sú dobre známe v odbore a sú napríklad opísané v Green a

276/B

Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis”, John Wiley and Sons, 1991, ktorá je zahrnutá ako referencia. Príklady zahrňujú t-butyloxykarbonyl (tBoc) a fluorenylmetoxykarbonyl (Fmoc).

Peptidy sa môžu syntetizovať s použitím štandardných protokolov automatizovanej syntézy v pevnej fáze s použitím t-butoxykarbonyl- alebo fluorenylmetoxykarbonyl-alfa-aminokyseliny s patričnou ochranou bočného reťazca. Po skončení syntézy sa peptidy oddelia od pevného nosiča so súčasným zbavením ochrany bočných reťazcov s použitím štandardného fluorovodíkového alebo TFA spôsobu. Surové peptidy sa potom ďalej čistia s použitím chromatografie s obrátenými fázami na kolónach Vydac C18 s použitím lineárnych gradientov voda - acetonitril, kde všetky rozpúšťadlá obsahujú 0,1 % TFA. Za účelom odstránenia acetonitrilu a vody sa peptidy lyofilizujú z roztoku obsahujúceho 0,1 % TFA, acetonitril a vodu. Čistota sa môže skontrolovať analytickou chromatografiou s obrátenými fázami. Totožnosť peptidov sa môže skontrolovať hmotnostnou spektrometriou. Peptidy sa môžu rozpustiť vo vodných pufroch pri neutrálnej hodnote pH.

Inzulínová zlúčenina podľa predloženého vynálezu sa môže pripraviť chemickou modifikáciou rekombinantného templátu inzulínu. V jednom uskutočnení sa rekombinantný templát inzulínu acyluje s jednou alebo viacerými chránenými aminokyselinami s použitím aktivovanej skupiny karboxylovej kyseliny. Výhodne sa použije aktivovaný ester alebo amid. Výhodnejšie sa použije aktivovaný ester. Ešte výhodnejšie sa použije Nhydroxysukcínimid (NHS) ester.

V spôsobe podľa predloženého vynálezu sa inzulínová zlúčenina pripraví chemickou modifikáciou templátu inzulínu tak, že sa templát inzulínu acyluje chránenou aminokyselinou s použitím aktivovanej skupiny karboxylovej kyseliny. Výhodne sa použije aktivovaný ester alebo amid. Výhodnejšie sa použije aktivovaný ester. Ešte výhodnejšie sa použije N-hydroxysukcinimid (NHS) ester. Techniky acylácie N-terminálneho konca reťazca A a/alebo Lys reťazca B inzulínu sú dobre známe odborníkovi v odbore.

Podľa jedného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu sa takto

276/B rekombinantný A21^Xaa-inzulín acyluje v polohách A1 a B29 za účelom prípravy A0^ArgA21^XaaB29^Lys'^NE'^Ar9-inzulínu. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu sa A21^Gly-inzulín acyluje v polohách A1 a B29 za účelom prípravy A0^Ar9A21^GlyB29^Lys’^NE‘^Arg-inzulínu.

Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu sa rekombinantný A0^ArgA21^Xaa-inzulín acyluje v polohe B29, za účelom prípravy A0^ArgA21^XaaB29^Lys'^NE'^Lys-inzulínu. Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu sa A0^ArgA21^Gly-inzulín acyluje v polohe B29, za účelom prípravy A0^ArgA21^GlyB29^Lys’^NE’^Lys-inzulínu.

Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu sa rekombinantný A0^LysA21^Xaa-inzulín acyluje v polohách AO a B29, za účelom prípravy A0^Lys'^N£'^Ar9-A21^XaaB29^Lys’^NE'^Arg-inzulínu. Výhodne sa A0^LysA21^Gly-inzulín acyluje v polohách AO a B29, za účelom prípravy A0^Lys'^NE’^Aľg-A21^Gly-B29^Lys-^N£'^Arginzulínu.

Podľa iného výhodného uskutočnenia prihlášky vynálezu sa použije analóg proinzulínu kvôli vytvoreniu inzulínovej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu. V ľudskom proinzulíne divokého typu je Lys aminokyselina v polohe 64 a Arg je aminokyselina v polohe 65. Môže sa použiť analóg proinzulínu, ktorý má Arg v polohe 64 a Lys v polohe 65, za účelom vytvorenia A0^LysA21^Xaainzulínu, ktorý sa potom acyluje v pozíciách AO a B29, za účelom prípravy A0^Lys’ ^NE'^Arg-A21^XaaB29^Lys'^NE'^Arg-inzulínu. Výhodne sa A0^LysA21^Gly-inzulín acyluje v polohe B29, za účelom prípravy A0^Lys'^NE'^Arg-A21^GlyB29^Lys'^NE'^Arg-inzulínu.

Reakcie proteínovej acylácie sa výhodne vykonajú v zmesiach vody a organických rozpúšťadiel, ale môžu sa tiež vykonať v čisto organických alebo čisto vodných podmienkach, v závislosti od rozpustnosti reakčných činidiel. V nasledujúcich príkladoch sa reakcie vykonajú v zmesiach obsahujúcich medzi 40 a 60 % organickej zložky s MeOH, DMF alebo CH3CN ako organickými látkami. Aktivované skupiny karboxylovej kyseliny zahrňujú aminokyseliny, dipeptidy alebo krátke polypeptidy, kde ε-amino skupina a všetky bočné reťazce funkčných skupín sa odvodzujú od vhodných ochranných skupín, ktoré sa

276/B výhodne odstránia po skončení kroku derivatizácie proteínú. Výhodne je karboxylát aktivačná skupina N-hydroxy-sukcínimid (NHS), vďaka svojej vhodnej rozpustnosti vo vodných zmesiach a reaktivite výsledných NHS-esterov s proteínovými amino skupinami. Pomer NHS-esteru k templátu inzulínu sa môže meniť medzi 2 a 20, ale výhodne je medzi 3 a 5. Pomer sa upraví v závislosti od požadovaného množstva mono-, di- a triacylovaného produktu (ov) rovnako tak ako od relatívnej reaktivity vstupujúceho NHS-esteru reakčného činidla.

Reakcie sa vykonajú pri teplote okolia (20 - 25 °C), všeobecne pri miešaní magnetickým tyčovým miešadlom alebo miešaním na grile. Reakcie sa výhodne nechajú pôsobiť od pol hodiny do 6 hodín.

Reakcia sa zastaví po dosiahnutí požadovaného stupňa acylácie (ako sa určí s pomocou LC-MS monitoringu) okyslením kyselinou octovou alebo kyselinou trifluóroctovou. Ďalej sa analýza/čistenie môže vykonať: (1) priamym čistením reakčnej zmesi s pomocou HPLC s obráteným fázami, za čím nasleduje odstránenie ochrannej skupiny a opätovné čistenie výsledného izolovaného nechráneného produktu(ov) s pomocou HPLC s obrátenými fázami alebo (2) riedením reakčnej zmesi vodou na organický obsah pod 25 % a lyofilizáciou, za čím nasleduje odstránenie ochrannej skupiny, čistenie katiónmeničovou chromatografiou a konečné čistenie/zbavenie sa solí HPLC s obrátenými fázami alebo gélovou filtráciou.

Ochranné skupiny môžu zahrňovať skupiny, pre ktoré sa zbavenie ochrany môže vykonať za podmienok, ktoré sú porovnateľné s proteínmi a peptidmi (napríklad podmienok, ktoré nie sú tak drsné, aby narušili proteín/peptid). Za účelom ochrany amino funkčných skupín sa napríklad môžu použiť terc-butyloxykarbonylové (Boe) alebo trifluóracetylové (TFA) skupiny. Ochranné skupiny sa môžu odstrániť napríklad kyselinou trifluóroctovou (TFA) a vodným hydroxidom amónnym (NH₄OH). Ochrana guanidínovej skupiny sa vykoná prostredníctvom Boe, Pmc (2,2,5,7,8-pentametylchróman-6-sulfonyl) alebo Pbf (2,2,4,6,7-pentametylbenzofurán-5-sulfonyl) skupín. Pmc a Pbf skupiny sa tiež odstránia s pomocou TFA, ale za prítomnosti vychytávačov, ako

276<’B je opísané ďalej v príkladoch.

Pretože amino skupiny musia byť v neutrálnej (deprotonizovanej) forme, aby zjavne reagovali v acylácii, hodnota pH, pri ktorej sa reakcia vykonáva, výrazne ovplyvňuje mieru reakcie. Všeobecne je vo vodných zmesiach miera reakcie danej amino skupiny nepriamo úmerná svojej hodnote pKa, okrem veľmi vysokých hodnôt pH. Miera reakcie sa môže tiež ovplyvniť stérickým účinkom a účinkom dvoch zvyškov, ktoré sú blízko vedľa seba a stupňom dostupnosti bočného reťazca k rozpúšťadlu. V prípade inzulínu majú tri amíny charakteristické hodnoty pKa a rôzny účinok okolitého prostredia na reaktivitu, ktorý umožňuje dosiahnutie určitej špecificity (pozri Lindsey a kol., v Biochem. J., 121, 737 - 745 (1971)). Obzvlášť ε-amino skupina B29 lyzínu bočného reťazca dominuje acylačnej reakcii pri hodnote pH, ktorá je vyššia ako 10 (pozri Baker a kol., U.S. patent č. 5,646,242).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Reakcie nasledujúcich príkladov sa vykonali pri hodnotách pH, ktoré sú od približne 6 do 11, čo umožní jemné vytvorenie reakčnej špecificity, v závislosti od daného produktu, ktorý sa požaduje.

V nasledujúcich príkladoch je totožnosť konečných produktov overená kombináciou techník, ktoré zahrňujú LC-MS (overenie molekulovej hmotnosti), N-terminálne sekvenovanie proteínu a LC-MS analýza S. aureus V8 proteázovým natrávením, ktoré vedie k charakteristickým inzulínovým fragmentom vďaka špecifickému štiepeniu týmto enzýmom peptidových väzieb na karboxylovej strane Glu zvyšku (pozri Nakagawa, S. H. a Tager, H. S. v J. Biol. Chem., 266, 11502 - 11509 (1991)).

Príklad 1

Acylácia B28^LysB29^Pro-inzulínu s Boc-Arg(Boc)₂-NHS esterom vo vode/CH₃CN za účelom prípravy A0^Aľ9B0^Aľ9B28^Lys'^Ní:’^Ar9B29^PľO

276/B

Kryštály B28^LysB29^Pro-inzulín-Zn (320 mg, 0,055 mmol) sa rozpustia v 30 ml 1 : 1 CH₃CN : PBS-pufra. Za účelom rozpustenia kryštálov pri hodnote pH rovnajúcej sa 10 sa pridá (50 μΙ) 5 M roztoku KOH. Hodnota pH sa potom upraví na približne 7,5 s použitím 5 M kyseliny fosforečnej. Boc-Arg(Boc)₂-NHS ester sa pripraví z 1 mmol každého z Boc-Arg(Boc)₂-OH, NHS a dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) spolu zmiešaných v dichlórmetáne počas 30 minút. Zmes sa potom filtruje a koncentruje sa až do sucha na rotačnej odparke. Boc-Arg(Boc)₂-NHS ester sa potom rozpustí v 4 ml MeOH. 2 ml roztoku Boc-Arg(Boc)₂-NHS esteru sa pridá k roztoku inzulínu a roztok sa mieša pri teplote okolia počas 2 hodín. Hodnota pH v tejto chvíli klesne na hodnotu pH, ktorá sa približne rovná 6,4. Pridanie 40 μΙ roztoku 5 M KOH zvýšilo hodnotu pH späť na hodnotu, ktorá sa rovná 7,1. Zvyšný Boc-Arg(Boc)₂NHS ester sa pridá k zmesi inzulínu a v reakcii sa pokračuje počas ďalších 2,5 hodiny. Zmes sa potom okyslí so 100 μΙ kyseliny trifluóroctovej (TFA), riedenej s 30 ml vody a lyofilizuje sa cez noc. Kvôli získaniu nechráneného produktu sa lyofilizovaný celkový materiál s hmotnosťou približne 900 mg, vďaka prítomnosti prebytku acylačného reakčného činidla a soli z PBS pufra, rozpustí v 20 ml TFA a nechá sa sadnúť pri teplote okolia počas 1 hodiny. Zmes sa potom odparí skoro do sucha na rotačnej odparke a znova sa rozpustí v 20 ml 1 : 9 CH3CN : voda.

Vzorka sa analyzuje analytickou HPLC s obrátenými fázami na Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6 mm i.d. x 15 cm kolóna s lineárnym acidobázickým gradientom, ktorý je od 10 do 100 % B počas 15 minút, kde A = 0,05 % TFA/H₂O a B = 0,05 % TFA v 60 : 40 CH₃CN : H₂O a miera toku bola 1 ml/minúta. Za týchto podmienok vzorka vykázala hlavné maximum, ktoré sa overilo s pomocou LC-MS s tým, že zodpovedá molekulovej hmotnosti triacylovaného inzulínu, s menším množstvom tetra-acylovaného a diacylovaného inzulínu vymytého krátko pred a krátko po hlavnom maxime. Relatívne množstvo produktov nemožno určiť, pretože sa úplne nerozpustí za týchto chromatografických podmienok, ale približne 70 % materiálu sa zdá byť

276/B tri-acylovanými druhmi.

Polovica surového acylovaného materiálu sa čistí katiónmeničovou chromatografiou na skle 2 cm i.d. x 30 cm kolóna naplnená SP-Sepharose materiálom. Lineárny AB gradient s veľkosťou 0 až 40 % bázy vytvoril za dobu 100 minút tok, ktorý sa rovná 3 ml/minúta. Zložky rozpúšťadla sú A: 70 mmol octan sodný v H2O : CH3CN 70 : 30, pH 4,0 a B: 70 mmol octan sodný, 1 M chlorid sodný v H₂O : CH₃CN 70 : 30, pH 4,0. Frakcie obsahujúce produkt triacylovaného inzulínu sa dajú spolu a roztok sa koncentruje z približne 96 ml na 75 ml, riedia sa späť na 100 ml s pomocou H₂O a naložia sa na Vydac C18 2,0 cm i.d. x 25 cm prípravnej kolóny pri 20 ml/minúta. Vzorka sa vymyje prietokom, ktorý sa rovná 10 ml/min s použitím dvojstupňového lineárneho AB gradientu s veľkosťou 0 až 15 % B počas 15 minút, za čím nasleduje 15 až 65 % B počas 100 min, kde A = 0,05 % TFA/H₂O a B = 0,05 % TFA/CH3CN. Kombinovaný čistený materiál sa lyofilizuje za účelom získania 52 mg, čo zodpovedá celkovému výťažku, ktorý sa rovná približne 34 %.

Príklad 2

Acylácia A0^Ar9-inzulínu Boc-Arg-(Boc)₂-NHS esterom vo vode/CH₃CN za účelom prípravy A0^Ar9B29^Lys'^Ní:’^Ar9-inzulínu

Boc-Arg(Boc)₂-NHS ester (0,5 mmol) sa pripraví a rozpustí v 5 ml MeOH. 104 mg A0^Ar9-inzulínu (0,017 mmol) sa rozpustí v 10 m) 1 : 1 PBS pufor/CHsCN, pH sa upravilo na hodnotu 11 s pomocou 5 M roztoku KOH, roztok 0,52 ml Boc-Arg-(Boc)₂-NHS esteru (0,052 mmol) sa pridá k roztoku inzulínu. Hodnota pH klesne približne na 9 a ihneď sa upraví späť na hodnotu 11 s pomocou 5 M roztoku KOH.

Reakcia sa nechá pôsobiť počas 30 minút pri teplote okolia s následným okyslením s pomocou 200 μΙ kyseliny octovej. Hlavný vrchol je prítomný na analytickej HPLC (vykonanej ako v príklade 1, ktorý je uvedený vyššie) so správnou molekulovou hmotnosťou pre mono-acylovaný produkt, ako sa určí s pomocou LC-MS. Vzorka sa čistí priamo s pomocou HPLC s obrátenými fázami

276/B na Vydac C18 prep. kolóne, ako je opísané vyššie dvojstupňovým lineárnym AB gradientom s veľkosťou 0 až 18 % B počas 15 minút, za čím nasleduje 18 až 100 % B počas 160 minút. Zjednotené frakcie obsahujúce produkt sa lyofilizujú a vznikne celok s hmotnosťou približne 61 mg. Lyofilizovaná vzorka sa rozpustí v 10 ml TFA a nechá sa sadnúť počas 30 minút, potom sa koncentruje skoro do sucha a znova sa rozpustí v 20 ml 10 : 90 CH₃CN : H₂O. Vzorka sa potom podrobí konečnému čisteniu reverznou fázou, ako je opísané v príklade 1, ktorý je uvedený vyššie. Konečná lyofilizovaná hmota váži 31 mg s celkovým výťažkom, ktorý sa rovná približne 30 %.

Príklad 3

Acylácia rekombinantného ľudského inzulínu Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS esterom vo vode/DMF za účelom prípravy A-1^Aľ9A0^Arg- inzulínu

Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS ester (0,2 mmol) sa pripraví z 0,2 mmol každého z Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-OH, NHS a dicyklohexylkarbodiimid (DCC) sa miešajú v dichlórmetáne počas 60 minút. Vzorka sa potom filtruje, odparí až do sucha a znova sa rozpustí v 4 ml DMF. Rekombinantné kryštály ľudského inzulínu-Zn (320 mg, 0,055 mmol) sa rozpustia v 20 ml 1 : 1 DMF: PBS-pufra. Pridá sa 5 M roztok KOH (50 μΙ) za účelom rozpustenia kryštálov pri hodnote pH 10. Hodnota pH sa upraví na 8,2 s pomocou 5 M kyseliny fosforečnej a pridajú sa 3 ml roztoku Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS esteru (0,15 mmol).

Po miešaní počas približne 1 hodinu ukázala analytická HPLC (vykonaná ako v príklade 1, ktorý je uvedený vyššie) dve maximá vďaka monoacylovaným produktom, čo sa overí s pomocou LC-MS. Maximá sú prítomné v približne 70 : 30 pomere.

Následná LC-MS analýza natrávenín proteázy S. aureus dokázala, že väčšie maximum zodpovedalo acylácii N-terminálneho konca reťazca A a menšie maximum zodpovedalo zmesi druhov, ktoré boli acylované buď na Nterminálnom konci reťazca B alebo na bočnom reťazci amínu B29: Lys. Čistenie na Vydac C18 kolóne ako v príklade 1 vedie k 49 mg acylovaného

276 B produktu s chráneným reťazcom A. Tento materiál sa zbaví ochrany zmesou 10 ml 94 : 2 : 2 : 2 TFA : anizol: MeOH : triizopropylsilán (TIPS) počas 1 hodiny pri teplote okolia.

Zmes sa potom koncentruje skoro do sucha a znova sa rozpustí v 6 ml 20 : 80 CH3CN : H₂O, ktorý sa dvakrát extrahuje 10 ml dietyléteru. Konečné čistenie HPLC s obrátenými fázami (ako v príklade 1) vedie k 34 mg produktu A-l^Ar9A0^Arg-inzulínu s celkovým výťažkom, ktorý sa rovná približne 10 %.

Príklad 4

Acylácia rekombinantného ľudského inzulínu s Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS esterom vo vode/DMF za účelom prípravy B-1^Ar9B0^Ar9-inzulínu

Vďaka spoločnému vymytiu monoacylovaných produktov buď na Nterminálnom konci reťazca B alebo bočnom reťazci amínu B29^Lys (pozri príklad 3 vyššie) sa najprv rekombinantný ľudský inzulín chráni s pomocou tercbutyloxykarbonylových (Boe) skupín na N-terminálnom konci reťazca A a B29^Lys amínu bočného reťazca. Rekombinantný ľudský inzulín (320 mg) sa rozpustí v 20 ml 1 : 1 CH₃CN : PBS pufra a upraví sa hodnota pH na 10,6. Pridá sa diterc-butyl dihydrogénuhličitan (2,5 ekvivalentov) ((Boc)₂O) (55 mg v 270 μΙ CH₃CN). Po uplynutí 30 minút hodnota pH klesne približne na 8,7. Hodnota pH sa upraví späť na približne 11 s pomocou 5 M KOH a reakcia sa potom nechá prebiehať počas ďalších 2,5 hodiny. V tejto chvíli LC-MS analýza preukáže prítomnosť troch hlavných produktov s hmotnosťou mono-, di- a tri-Boc derivatizovaných druhov.

Udávané plochy HPLC maxím udávajú, že mono-, di- a tri-Boc deriváty boli prítomné v približne 15 : 60 : 25 relatívnych pomeroch. Čistenie materiálu sa vykoná na C18 g preparatívnej kolóne ako v príklade 1 s pomocou trojstupňového lineárneho AB gradientu s veľkosťou: (1) 0 až 20 % B s časovým rozsahom idúcim od 0 do 20 minút; (2) od 20 do 25 % B s časovým rozsahom idúcim od 20 do 30 minút; a (3) 25 až 75 % B s časovým rozsahom idúcim od 30 do 230 minút. Di-Boc derivatizovaný produkt (Boc₂-inzulín) sa

276/B získa po lyofilizácii s výťažkom s veľkosťou 82 mg. LC-MS analýza natrávenia proteázou V8 S. aureus viedla k záveru, že produkt obsahoval Boe skupiny na reťazci A N-terminálneho konca a B29: Lys bočnom reťazci.

mg Boc₂-inzulínu (0,014 mmol) sa rozpustí v 10 ml 1 : 1 DMF : PBS pufra a hodnota pH sa upraví na približne 8. Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS ester sa pripraví ako v príklade 3, ktorý je uvedený vyššie a rozpustí sa na koncentráciu s hodnotou 0,05 mmol/ml v DMF. 1,4 ml roztoku NHS esteru (0,07 mmol) sa pridá k Boc₂-inzulínu a nechá sa reagovať počas 1 hodiny. Pridá sa ďalších 0,6 ml Boc-Arg (roztok PbArg (Pb-NHS) esteru (0,03 mmol) a v reakcii sa pokračuje počas ďalšej hodiny. Produkt sa analyzuje analytickou HPLC ako v príklade 1, ale s použitím lineárneho AB gradientu s veľkosťou od 25 do 100 % B počas 25 minút, kde A = 0,05 % TFA/H₂O a B = 0,05 % TFA/CH₃CN a miera toku bola 1 ml/min Zistilo sa, že sa objavilo jedno maximum so správnou molekulovou hmotnosťou zodpovedajúcou Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-Boc₂inzulínovému produktu.

Čistenie sa vykoná s pomocou kolóny ako v príklade 1 s trojstupňovým lineárnym AB gradientom s veľkosťou: (1) 0 až 25 % B s časovým rozsahom idúcim od 0 až do 20 minút; (2) od 25 do 40 % B s časovým rozsahom idúcim od 20 do 40 minút; a (3) od 40 do 100 % B s časovým rozsahom idúcim od 40 do 100 minút. Čistený plne chránený produkt vedie po lyofilizácii k 36 mg. Na materiál sa pôsobí počas 1 hodiny pri teplote okolia s pomocou 10 ml 94 : 2 : 2 : 2 TFA : anizol : MeOH : TIPS za účelom získania plne nechráneného produktu. Zmes sa potom koncentruje skoro do sucha a znova sa rozpustí v 10 ml 10 : 90 CH₃CN : H₂O, čo sa dvakrát extrahuje 15 ml dietyléteru. Konečné čistenie HPLC s obrátenými fázami (ako v príklade 1) vedie k 24 mg konečného B-1^Aľ9B0^Aľ9-inzulínového produktu s celkovým výťažkom, ktorý sa rovná približne 8 %.

276/B

Príklad 5

Acylácia A0^Aľ9-inzulínu Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS esterom v H₂O/CH₃CN za účelom prípravy AO^Aľ9B-1^Aľ9BO^Arg-inzulinu

Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS ester (0,5 mmol) sa pripraví ako v príklade 3 a rozpustí sa v 4 ml MeOH. A0^Ar9-inzulin (320 mg, 0,054 mmol) sa rozpustí v 40 ml 1 : 1 CH3CN : PBS pufra pri hodnote pH 10. Hodnota pH sa zníži na približne 7. Roztok začína byť kalný vďaka proteínu, ktorý začína byť blízko svojho pH s veľkosťou približne 6,3. Pridá sa polovica roztoku BocArg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS esteru (0,25 mmol; približne 4,7 ekvivalentu) a roztok sa sonikuje počas 15 minút, potom sa mieša na grile počas 75 minút. HPLC analýza preukázala dve maximá, ktoré sa ukázali ako LC-MS monoacylované produkty, prítomné v pomere s veľkosťou približne 85 : 15. Vzorka sa okyslí s pomocou 100 I TFA, potom sa riedi 20 ml H2O. Vykoná sa čistenie s obrátenými fázami ako v príklade 2 a vedie po lyofilizácii k 55 mg hlavného mono-acylovaného produktu. Peptid sa zbaví ochrany 20 ml TFA koktejlom opísaným v príklade 3 počas 2 hodín, odparí skoro do sucha, znova sa rozpustí v 20 ml 10 : 90 CH3CN : H2O a extrahuje sa s 20 ml hexánu. Konečné čistenie HPLC s obrátenými fázami ako v príklade 1 vedie k 38 mg produktu (výťažok s veľkosťou 12 %). Tento materiál sa následne potvrdí ako požadovaný A0^Ar9B1^Ar9BOAr9-i_nzulí_n.

Príklad 6

Acylácia rekombinantného ľudského inzulínu s Boc-Arg(Boc)₂-NHS esterom vo vode/CH₃CN za účelom prípravy A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys’^NE’^Ar9-inzulínu

Kryštály rekombinantného ľudského inzulínu - zinku (307 mg, 0,053 mmol) sa rozpustia v 30 ml 1 : 1 CH3CN : PBS-pufra. Pridá sa 5 M roztok KOH (50 μΙ) za účelom rozpustenia kryštálov pri hodnote pH 10. Hodnota pH sa potom zníži na približne 7,5 s použitím 5 M kyseliny fosforečnej. Boc-Arg(Boc)₂NHS ester (1 mmol) sa pripraví ako v príklade 1 a rozpustí sa v 4 ml MeOH.

276/B

Roztok 2 ml Boc-Arg(Boc)₂-NHS esteru (0,5 mmol) sa pridá k roztoku inzulínu a výsledná zmes sa mieša pri teplote okolia počas 2 hodín. Hodnota pH v tejto chvíli klesne na približne 6,6. Pridanie 50 μΙ roztoku 5 M KOH zvýši hodnotu pH späť na hodnotu, ktorá sa rovná 7,2.

Potom sa zvyšný Boc-Arg(Boc)₂-NHS ester pridá k zmesi inzulínu a v reakcii sa pokračuje počas ďalších 3 hodín. Zmes sa potom okyslí so 100 μΙ TFA, riedi sa s 30 ml vody a lyofilizuje sa cez noc. Lyofilizovaný celkový materiál vážiaci približne 1,07 g vďaka prítomnosti prebytku acylačného reakčného činidla a soli z PBS pufra sa rozpustí v 20 ml TFA a nech sa sadnúť pri teplote okolia počas 1,5 hodiny kvôli získaniu nechráneného produktu. Zmes sa potom odparí skoro do sucha na rotačnej odparke a znova sa rozpustí v 20 ml 1 : 9 CH₃CN : H₂O.

Vzorka sa analyzuje analytickou HPLC s obrátenými fázami ako v príklade 1 a vykáže podobný chromatografický profil hlavného maxima vďaka tri-acylovanému produktu a menšie množstvo tetra-acylovaného a diacylovaného inzulínu vymytého krátko pred a krátko po hlavnom maxime. Relatívne množstvo produktov nemožno určiť, pretože sa úplne nerozpustí za týchto podmienok, ale približne 70 % materiálu sa zdajú byť tri-acylované druhy (ako sa už pozorovalo v príklade 1).

Surový acylovaný materiál sa čisti katiónmeničovou chromatografiou ako v príklade 1. Kombinovaný čistený tri-acylovaný inzulín sa koncentruje z približne 96 ml na 75 ml, riedi sa späť na 100 ml s H₂O a naloží sa na Vydac C18 prípravnú kolónu a čistí sa ako v príklade 1. Kombinovaný čistený materiál sa lyofilizuje za účelom získania 96 mg (celkový výťažok bol približne 31 %).

Príklad 7

Acylácia A21^Gly-inzulínu s Boc-Arg(Boc)₂-NHS esterom v H₂O/CH₃CN za účelom prípravy A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys'^Ne'^Arg-A21^Gly-inzulínu

276/B

Lyofilizovaný A21^G,y-inzulín (65 mg, 0,11 mmol) sa rozpustí v 8 ml 1 : 1 CH3CN : PBS pufra. Hodnota pH sa upraví na 7,5 s pomocou 5 M roztoku KOH. Boc-Arg(Boc)2-NHS ester (0,4 mmol) sa pripraví ako v príklade 1 a rozpustí sa v roztoku 2 ml MeOH. Boc-Arg(Boc)2-NHS ester (1 ml, 0,2 mmol, 17 ekvivalentov) sa pridá k roztoku A21^Gly-inzulínu a výsledná zmes sa mieša pri teplote okolia počas 3 hodín, hodnota pH v tejto chvíli klesne na približne 6,4. Pridaním 20 μΙ roztoku 5 M KOH sa zvýši hodnota pH späť na hodnotu, ktorá sa rovná 7,5. Potom sa zvyšný 0,2 mmol Boc-Arg(Boc)2-NHS ester pridá k zmesi inzulínu a v reakcii sa pokračuje počas ďalších 3 hodín. Zmes sa potom okyslí 50 μΙ TFA, riedi sa 10 ml vody a lyofilizuje sa cez noc. Lyofilizovaný materiál obsahujúci peptid, prebytok acylačného reakčného činidla a soli z PBS pufra sa rozpustí v 20 ml TFA a nechá sa sadnúť pri teplote okolia počas 1 hodiny za účelom získania nechráneného produktu. Zmes sa odparí skoro do sucha na rotačnej odparke a znova sa rozpustí v 20 ml 1 : 9 CH₃CN : H₂O, potom sa extrahuje 20 ml hexánu. Vzorka sa analyzuje analytickou HPLC s obrátenými fázami ako v príklade 1 a vykáže podobný chromatografický profil hlavného vrcholu vďaka tri-acylovanému produktu a menšiemu množstvu tetraacylovaného a di-acylovaného inzulínu vymytého krátko pred a krátko po hlavnom maxime. Relatívne množstvo produktov sa neurčuje, pretože sa úplne nerozpustí za týchto chromatografických podmienok, ale približne 60 - 70 % materiálu sa zdá byť žiadanými tri-acylovanými druhmi.

Surový acylovaný materiál sa čistí katiónmeničovou chromatografiou ako v príklade 1. Kombinovaný čistený tri-acylovaný inzulín sa koncentruje z približne 96 ml na 75 ml, riedi sa späť na 100 ml s H₂O a naloží sa na Vydac C18 polo-prípravnú kolónu (10 mm i.d. x 250 mm). Vzorka sa vymyje prietokom, ktorý sa rovná 4 ml/min s použitím dvojstupňového lineárneho AB gradientu s veľkosťou 0 až 25 % B počas 15 minút, za čím nasleduje od 25 do 75 % B počas 100 minút, kde A = 0,05 % TFA/H₂O a B = 0,05 % TFA/CH₃CN. Čistený materiál sa lyofilizuje za účelom získania 21 mg (celkový výťažok bol približne 32 %).

276/B

Príklad 8

Acylácia inzulínu Boc-l_ys(Boc)-NHS esterom vo vode/CH₃CN za účelom prípravy A0^LysB0^LysB29^Lys’^NE’^Lys-inzulínu a guanidylácia N,N'-bis-Boc-1-guanylpyrazolom (Boc₂-guanylpyrazol) na A0^9HRB0^9HR-B29^Lys'^Ne'^gHR-inzulín ”gHR” predstavuje alfa-guanidinyl homoarginín. Rekombinantné kryštály ľudského inzulínu-Zn (300 mg, 0,052 mmol) sa rozpustia v 20 ml CH₃CN : PBS pufra 1 : 1 pri hodnote pH 10 a hodnota pH sa potom upraví na približne 7. Pridá sa desať ekvivalentov Boc-Lys(Boc)-NHS-ester (230 mg v 2 ml CH₃CN) a roztok sa mieša pri teplote okolia počas 2 hodín. V tejto chvíli sa pridá ďalších 230 mg Boc-Lys(Boc)-NHS esteru a v reakcii sa pokračuje počas 2,5 hodiny. LC-MS analýza preukázala veľké množstvo prítomných tri-acylovaných druhov a menšie množstvo di-acylovaných druhov. Zmes sa riedi na 50 ml s H₂O a lyofilizuje sa. Zbavenie ochrany v 20 ml TFA počas 1 hodiny, za čim nasleduje LC-MS ukazuje, že to bolo opäť približne 70 % inzulínu v tri-acylovanej forme, spolu s približne 10 % tetra-acylovaného produktu vymytého o niečo skôr a 20 % di-acylovaného produktu vymytého o niečo neskôr ako je hlavný produkt. Vzorka sa odparí skoro do sucha, znova sa rozpustí v 30 ml 30 : 70 CH₃CN : H2O, rozdelí sa na dve rovnaké časti a lyofilizuje sa. Jedna z lyofilizovaných časti (0,026 mmol) sa rozpustí v 10 ml MeOH : Η₂Ο 9:1a pridá sa 0,5 ml trietylamínu. Hodnota pH je 9,3. Boc₂-guanylpyrazol (160 mg, 0,52 mmol) sa pridá a reakcia sa nechá prebiehať počas 1 hodiny. Ďalších 160 mg Boc₂guanylpyrazolu sa pridá a v reakcii sa pokračuje počas ďalšej hodiny. V tejto chvíli LC-MS analýza preukázala prítomnosť produktov s jednou až štyrmi pridanými Boc₂-gaunylovými skupinami.

Ďalších 800 mg Boc₂-guanylpyrazolu (2,6 mmol) sa pridá a v reakcii sa pokračuje počas ďalších 4 hodín. Celkové množstvo pridaných 3,6 mmol Boc₂guanylpyrazolu mínus množstvo, u ktorého sa očakáva reakcia s amino skupinami prebytku lyzínu, ktorý sa pridá v úvodnom kroku acylácie (1 mmol), vedie k 2,6 mmolom, ktoré sú dostupné na reakciu s tri Lys-inzulínom (prebytok približne 15 ekviv. reakčného činidla na amino skupinu).

276/B

Na konci 6-hodinovej reakčnej periódy sa vzorka koncentruje na rotačnej odparke skoro do sucha, znova sa rozpustí v 10 ml CH₃CN : H₂O 60 : 40 a lyofilizuje sa. Na lyofilizovanú vzorku sa pôsobí 20 ml TFA počas 2 hodín za účelom získania nechráneného produktu, koncentruje sa až do sucha a znova sa rozpustí v 20 ml 15 : 85 CH₃CN : H₂O. LC-MS analýza v tejto chvíli ukazuje hlavný vrchol (približne 60 % materiálu) s očakávanou hmotou hexaguanidylovaného produktu a tiež menšie množstvo spolu vymytého pentaguanidylovaného produktu.

Čistenie katiónmeničovou chromatografiou sa vykoná ako v príklade 1, ale s použitím iného lineárneho AB gradientu s veľkosťou od 25 do 70 % B počas 100 minút prietokom, ktorý sa rovná 4 ml/min a 8 ml frakciami. Spojené frakcie (88 ml celkový objem) sa koncentrujú na rotačnej odparke na objem približne 65 ml, potom sa riedia späť na 90 ml s H₂O. Vzorka sa podrobí konečnému RP-HPĽC čisteniu ako v príklade 1, s výťažkom 43 mg konečného produktu (celkový výťažok približne 29 %).

Príklad 9

Acylácia rekombinantného ľudského inzulínu Boc-Lys(tfa)-NHS esterom vo vode/CH₃CN za účelom prípravy A0^LysB0^LysB29^Lys'^Ne'^Lys-inzulínu

Rekombinantné kryštály ľudského inzulínu-Zn (200 mg, 0,034 mmol) sa rozpustia v 10 ml 1 : 1 CH₃CN : H₂O pri hodnote pH 10, potom sa hodnota pH upraví na hodnotu približne 7 so 6 mmolmi kyseliny fosforečnej. Boc-Lys(tfa)NHS ester (1 mmol) sa pripraví z Boc-Lys(tfa)-OH, NHS a DCC ako v príklade 1 a rozpustí sa v 10 ml MeOH. K roztoku inzulínu sa pridá 1,7 ml roztoku BocLys(tfa)-NHS esteru (0,17 mmol, 5 ekvivalentov). Zmes sa nechá reagovať počas 75 minút, potom sa okyslí s 0,5 ml TFA a riedi sa na objem 30 ml. Analytická HPĽC a ĽC-MS potvrdia prítomnosť troch monoacylovaných vrcholov, dvoch diacylovaných produktov a jedného triacylovaného produktu.

276/B

Čistenie HPLC s obrátenými fázami ako v príklade 2, za ktorým nasleduje lyofilizácia oddelených druhov, vedie k nasledujúcim chráneným produktom: 33 mg A0^LysB0^LysB29^Lys-inzulín; 36 mg A0^LysB0^Lys-inzulín, 23 mg B0^LysB29^Lys'^N£’^Lys-inzulín, 12 mg AO^Lys-inzulín a 31 mg BO^Lys-inzulín.

Zbavenie ochrany sa vykoná v dvoch krokoch. Prvým je odstránenie Boe skupiny z lyzínu alfa-amino skupiny, ktoré sa dosiahne pôsobením na každú z piatich vzoriek s 5 ml TFA počas 30 minút. Roztok sa potom odparí skoro do sucha a zvyšný TFA sa odstráni fúkaním dusíka na skúmavku vzorky. Potom sa TFA skupiny odstránia z amino skupín lyzínu pridaním 6 ml 15 % NH4OH/H2O (objemovo) a vzorka sa nechá stáť pri teplote okolia počas 3-4 hodín. Vzorky sa potom riedia na objem 40 ml s H₂O a okyslia kyselinou octovou (1,5 ml) na hodnotu pH 4. Vzorky sa podrobia konečnému čisteniu ako v príklade 1, čo vedie k nasledujúcim konečným množstvám: 14 mg A0^LysB0^LysB29^Lys’^NE’^Lysinzulín; 17 mg A0^LysB0^Lys-inzulin, 8 mg B0^LysB29^Lys'^Ne'^Lys-inzulín, 5 mg A0^Lysinzulín a 16 mg B0^Lys-inzulín.

Príklad 10

Acylácia A21^Gly-inzulínu Boc-Arg(Pbf)-NHS-esterom vo vode/CH₃CN za účelom prípravy A0^ArsA21^GlyB29^Lys’^N£'^Aľ9-inzulínu

A21 ^Gly-inzulín (230 mg, 0,040 mmol) sa rozpustí v 24 ml 1 : 1 CH₃CN : voda. Pridá sa 200 mg NaH₂PO₄.H₂O. Roztok 5 M KOH sa pridá (približne 50 I) kvôli upraveniu hodnoty pH na 10,5. Pripraví sa Boc-Arg(Pbf)-NHS-ester z 0,4 mmol každého z Boc-Arg(Pbf)-OH, N-hydroxysukcínimidu (NHS) a dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) spolu zmiešaných v dichlórmetáne (DCM) počas 30 minút. Zmes sa potom filtruje a koncentruje sa až do sucha na rotačnej odparke. Výsledných 0,4 mmol Boc-Arg(Pbf)-NHS esteru sa rozpustí v 4 ml MeOH. Roztok 1 ml Boc-Arg(Pbf)-NHS esteru (0,1 mmol, 2,5 ekvivalentov) sa pridá k roztoku inzulínu a zmes sa mieša pri teplote okolia počas 1 hodiny, hodnota pH v tejto chvíli klesne na približne 9,8. Hodnota pH sa ďalej zníži na 9,0 so 6 M H₃PO₄. Pridá sa ďalší 1 ml roztoku Boc-Arg(Pbf)-NHS-esteru (0,1

276/B mmol, 2,5 ekvivalentov) k roztoku inzulínu a zmes sa mieša pri teplote okolia počas ďalšej 1 hodiny. V tejto chvíli zmes ukáže s pomocou HPLC s obráteným fázami (vykonané na Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6 mm i.d. x 15 cm kolóna s lineárnym acidobázickým gradientom od 10 do 100 % B počas 15 minút, kde A = 0,05 % TFA/H2O a B = 0,05 % TFA v 60 : 40 CH3CN : H2O s mierou toku s veľkosťou 1 ml/min), že zahrňuje primárne monoacylovaný a diacylovaný produkt v približne 57 : 43 pomere. Pridá sa ďalších 0,5 ml roztoku BocArg(Pbf)-NHS esteru (0,05 mmol, 1,25 ekvivalentov) k roztoku inzulínu a zmes sa mieša počas 5 minút. Vykoná sa druhé pridanie 0,5 ml roztoku BocArg(Pbf)-NHS esteru a zmes sa mieša počas 10 minút, potom sa okyslí kyselinou trifluóroctovou (TFA) na hodnotu pH 3. Roztok sa riedi s 20 ml 50 : 50 CH₃CN : vody a filtruje sa. Konečná reakčná zmes obsahuje hlavné monoacylované a diacylované produkty v 30 : 70 pomere, ak HPLC určí plochu maxima UV detekciou pri vlnovej dĺžke 220 nm.

Surový acylovaný materiál sa čistí s pomocou HPLC s obrátenými fázami na Vydac C18 2,2 cm i.d. x 25 cm prípravnej kolóny. Vzorka sa vymyje prietokom, ktorý sa rovná 12 ml/min s použitím dvojstupňového lineárneho AB gradientu s veľkosťou: (a) 0 až 18 % B počas 15 minút, za čim nasleduje (b) od 18 do 68 % B počas 100 minút, kde A = 0,05 % TFA/H₂O a B = 0,05 % TFA/CH3CN. Frakcie obsahujúce diacylovaný inzulín sa dajú dohromady a lyofilizujú sa s výťažkom 134 mg chráneného produktu. Tento materiál zbaví ochrany zmes 20 ml 91 : 3 : 3 : 3. TFA : anizol : MeOH : triizopropylsilán (TIPS) počas 1,5 hodiny pri teplote okolia, potom sa koncentruje skoro do sucha na rotačnej odparke a znova sa rozpusti v 25 ml 10 : 90 CH₃CN : H₂O, dvakrát sa extrahuje 20 ml dietyléterom. Konečné čistenie HPLC s obrátenými fázami sa vykoná na rovnakej Vydac C18 kolóne, ako je opísané vyššie pri 12 ml/min s dvojstupňovým lineárnym AB gradientom s veľkosťou: (a) 0 až 15 % B počas 15 minút, za čím nasleduje (b) od 15 do 55 % B počas 100 minút, kde A = 0,05 % TFA/H2O a B = 0,05 % TFA/CH3CN. Toto vedie k 77 mg A0^Ar9A21^GlyB29^Lys‘ ^Ne'^Ar9-inzulínového produktu s celkovým výťažkom, ktorý sa rovná je približne 33 %.

276/B

Príklad 11

Acylácia A21^Gly-inzulínu (1) Boc-Arg(Pbf)-NHS esterom a (2) Boc-Lys(Boc-Arg (Pbf))-NHS esterom vo vode/CH3CN za účelom prípravy A0^Lys-Ns-ArgB29Lys-Ne-Arg_ A21^Gly-inzulínu

Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf))-OH sa syntetizuje na CI-(2'-chlór)tritylpolystyrén polyméri. Polymér sa nanesie v dvojnásobnom prebytku Boc-Lys(Fmoc)-OH v zmesi 90 : 10 dimetylformamid (DMF) : diizopropyletylamín (DIEA). Fmoc skupina sa následne odstráni z ε-amino skupiny lyzínu 20 % roztokom piperidínu v DMF. α-karboxylát Fmoc-Arg(Pbf)-OH (štvornásobný prebytok) sa potom kopuluje s voľnou amino skupinu prostredníctvom aktivácie s Obenzotriazol-N,N,N',N'-tetrametylurónium-hexafluór-fosforečnanom (HBTU) a DIEA v pomere aminokyselina : HBTU : DIEA s veľkosťou 1 : 0,95 : 3 v DMF roztoku. Fmoc skupina sa odstráni z ε-amino skupiny Arg 20 % roztokom piperidínu v DMF, za čím nasleduje opatrenie uzáverom voľného amínu päťnásobným nadbytkom di-terc-butyl-diuhličitanu (Boc-anhydrid) a DIEA v pomere s veľkosťou 1 : 2 v DMF roztoku. Zlúčenina sa oddelí od polyméru dvojnásobným pôsobením 30 ml 1 : 2 hexafluórizopropanol (HFIP) : dichlórmetán (DCM) počas 40 minút každý. Kombinovaný roztok sa filtruje a odparí sa na rotačnej odparke. Boc-Arg(Pbf)-NHS ester a Boc-Lys(BocArg(Pbf))-NHS ester sa pripravia ako je opísané v príklade 1, miešajú sa rovnaké diely NHS a DCC so zodpovedajúcou kyselinou v DCM.

A21^Gly-inzulín (230 mg, 0,040 mmol) sa rozpustí v 24 ml 1 : 1 CH₃CN : voda. Pridá sa 200 mg NaH₂PO₄ H₂O. Pridá sa 5 M KOH roztok (približne 50 μΙ) kvôli upraveniu hodnoty pH na 10,5. Boc-Arg(Pbf)-NHS ester (0,4 mmol) sa rozpustí v 4 ml MeOH. 1 ml roztok Boc-Arg(Pbf)-NHS esteru (0,1 mmol, 2,5 ekvivalentov) sa pridá k roztoku inzulínu a zmes sa mieša pri teplote okolia počas 40 minút. V tejto chvíli zmes s pomocou HPLC s obrátenými fázami ukáže (vykonané na Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6 mm i.d. x 15 cm kolóna s lineárnym acidobázickým gradientom s veľkosťou od 10 do 100 % B počas 15

276/B minút, kde A = 0,05 % TFA/H2O a B= 0,05 % TFA v 60 : 40 CH3CN : H₂O miera toku s veľkosťou 1 ml/min), že ukazuje primárne úvodný materiál a monoacylovaný produkt v 40 : 60 pomere. Ďalších 0,6 ml roztoku Boc-Arg(Pbf)NHS esteru (0,06 mmol, 1,5 ekvivalentov) sa pridá k roztoku inzulínu a zmes sa mieša pri teplote okolia počas ďalších 15 minút, v tejto chvíli sa inzulín primárne premení na monoacylované druhy. Hodnota pH sa v tejto chvíli zníži z 10,2 na 9,0 pridaním 6 M H3PO4. Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf))-NHS ester (0,12 mmol) sa rozpustí v 2 ml MeOH a pridá sa k roztoku inzulínu. Zmes sa mieša pri teplote okolia počas 30 minút, potom sa riedi 20 ml 50 : 50 CH₃CN : voda, okyslí sa 300 μΙ TFA a filtruje sa. Hlavné maximum, ktoré sa pozoruje s pomocou HPLC s obrátenými fázami, zodpovedá produktu, ktorý sa odvodí od jedného z BocArg(Pbf) a Boc-Lys (Boc-Arg (Pbf)), ako sa overí s pomocou HPLC-hmotnostnej spektrálnej analýzy.

Surový acylovaný materiál sa čistí s pomocou HPLC s obrátenými fázami na Vydac C18 2,2 cm i.d. x 25 cm na prípravnej kolóne. Vzorka sa vymyje prietokom, ktorý sa rovná 13 ml/min, s použitím dvojstupňového lineárneho AB gradientu s veľkosťou: (a) 0 až 30 % B počas 20 minút, za čím nasleduje (b) 30 až 80 % B počas 100 minút, kde A = 0,05 % TFA/H₂O a B = 0,05 % TFA/CH3CN. Frakcie obsahujúce diacylovaný inzulín sa dajú spolu a lyofilizujú sa s výťažkom s veľkosťou 105 mg chráneného produktu. Tento materiál sa zbaví ochrany zmesou 20 ml 91 : 3 : 3 : 3 TFA : anizol: MeOH : triizopropylsilán (TIPS) počas 2 hodín pri teplote okolia, potom sa koncentruje skoro do sucha a znova sa rozpustí v 25 ml 10 : 90 CH3CN : H₂O, extrahuje sa trikrát s 20 ml dietyléterom. Konečné čistenie HPLC s obrátenými fázami sa vykoná na rovnakej Vydac C18 kolóne, ktorá je opísaná vyššie pri 12 ml/min s dvojstupňovým lineárnym AB gradientom s veľkosťou: (a) 0 až 15 % B počas 15 minút, za čím nasleduje (b) od 15 do 55 % B počas 100 minút, kde A = 0,05 % TFA/H₂O a B = 0,05 % TFA/CH3CN. Toto vedie k 60 mg A0^Lys'^N£’ ^ArsA21^GlyB29^Lys‘^NE’^Ar9-inzulínovému produktu s celkovým výťažkom, ktorý sa rovná približne 25 %.

276/B

Príklad 12

Príprava A0^Lys’^Ne'^Ar9-A21^Gly B29^Lys’^Ne’^Aľg-inzulínu

Plazmid obsahujúci sekvenciu kódujúcu ľudský analóg proinzulínu A21^GlyC64^Ar9-C65^Lys-ľudský proinzulín sa exprimuje v E. coli. Analóg proinzulínu sa čistí, zloží sa a potom sa nasledujúcim spôsobom acyluje. Boc-Arg(Boc)₂NHS ester sa pripraví z 0,4 mmol každého z Boc-Arg(Boc)₂-OH, Nhydroxysukcínimidu (NHS) a dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) spolu zmiešaných v 3 ml dichlórmetánu (DCM) počas 40 minút. Zmes sa potom filtruje a koncentruje sa až do sucha na rotačnej odparke. Výsledných 0,4 mmol BocArg(Boc)₂-NHS esteru sa potom rozpustí v 4 ml MeOH.

Približne 108 mg A21^GlyC64^Ar9-C65^Lys-ľudského proinzulínu v 180 ml 10 mmol HCI roztoku sa rozdelí na dve rovnaké dávky a lyofilizuje sa. Jedna z proinzulínových porcii sa znova rozpustí s 12 ml 50/50 voda/CH₃CN. Pridá sa NaH₂PO₄ (80 mg) za účelom získania PO₄ koncentrácie rovnajúcej sa približne 50 mmolom. Hodnota pH sa upraví na 8,2 s pomocou 5 M roztoku KOH. Pridá sa jeden ml Boc-Arg(Boc)₂-NHS ester (0,1 mmol, približne 20 ekvivalentov) a zmes sa mieša pri teplote okolia počas 2,5 hodiny, po tomto čase hodnota pH klesne na 7,4. Hodnota pH sa upraví naspäť na 8,2 a pridá sa ďalší roztok 1 ml Boc-Arg(Boc)₂-NHS esteru. Roztok sa mieša počas ďalších 3 hodín, potom sa riedi na 50 ml vodou, okyslí sa 200 μΙ kyseliny trifluóroctovej (TFA) a lyofilizuje sa. Lyofilizovaná reakčná zmes sa znova rozpustí v 20 ml 95 : 5 TFA : voda a nechá sa pri teplote okolia počas 1,5 hodiny. TFA zmes sa odparí skoro do sucha na rotačnej odparke, potom sa riedi s 25 ml 10 % CH₃CN/voda a extrahuje sa dvakrát s 20 ml dietyléterom. Nechránená zmes sa analyzuje s pomocou HPLC s obrátenými fázami na Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6 mm i.d. x 15 cm kolónou s lineárnym acidobázickým gradientom s veľkosťou od 10 do 100 % B počas 15 minút, kde A = 0,05 % TFA/H₂O a B = 0,05 % TFA v 60 : 40 CH₃CN : H₂O s mierou toku s veľkosťou 0,9 ml/min a hmotnostne špecifickou detekciou a ukáže, že obsahuje malé množstvo preacylovaného” produktu, kde sa viažu viac ako tri očakávané dodatočné Arg zvyšky (každý na Nterminálnom amíne a amínoch bočného reťazca lyzínu B29 : Lys a C65 : Lys).

276/B

Toto je pravdepodobne vďaka väzbe zvyšku Arg bočný reťazec fenolovej skupiny Tyr, imidazolovej skupiny His bočného reťazca alebo iných reaktívnych bočných skupín reťazcov. Hodnota pH roztoku proinzulínu sa zvýši na pH 10,5 počas 30 minút so zámerom znížiť množstvo preacylácie produktov týchto väzieb hydrolýzou katalyzovanou bázou. Množstvo preacylovaných druhov sa v zásade zníži týmto spôsobom zmeny hodnoty. Po 30 minútach pôsobenia vysokým pH sa hodnota pH zníži späť na hodnotu približne 3 s TFA a roztok sa uchováva pri teplote -20 °C.

Chemická modifikácia, zbavenie ochrany a spôsob zmeny hodnoty pH sa opakuje pre druhú dávku A21^GlyC64^Arg-C65^Lys-ľudského proinzulínu. Výsledné roztoky A21^GlyB29^Lys’^Ne’^Ar9C64^Ar9-C65^Lys-N^E-Arg-ľudského derivátu proinzulínu sa kombinujú a lyofilizujú. Čistota surového nechráneného materiálu je približne 65 %, ako sa určí s pomocou plochy maxima určenej vďaka HPLC s obrátenými fázami.

Acylovaný proinzulínový derivát sa natrávi trypsínom a karboxypeptidázou B za účelom odstránenia vedúcej sekvencie a C peptidu zo zvyšku C31^Arg až C64^Aľg za súčasného ponechania intaktných polovíc C65^Lys’^NE'^Arg a B29^Lys’^Ne’^Aľ9, za účelom prípravy A0^Lys’^NE‘^Ar9-A21^GlyB29^Lys’^N,;'^Ar9inzulínového derivátu. Tvorba Des-30 inzulínového produktu sa účinne blokuje modifikáciou na B29^Lys. Čistený A0^Lys‘^N£'^Ar9-A21^GlyB29^Lys‘^NE’^Ar9-inzulín sa použije v in vitro a in vivo pokusoch, ako je nasledovne uvedené.

Príklad 13

In vitro receptorová afinita

Afinita inzulínovej zlúčeniny pre receptor ľudského inzulínu (IR) sa meria pokusom kompetitívnej väzby s použitím rádioaktívne označeného ligandu, [¹²⁵l]inzulínu. Membrány receptoru ľudského inzulínu sa pripravia ako P1 membránový prípravok stabilne transfekovaných 293EBNA buniek exprimujúcich receptor vo zvýšenej miere. Pokus sa vyvinul a potvrdil ako filtráciou, tak SPA (scintillation proximity assay) spôsobom porovnateľným s

276/B výsledkami, ale vykoná sa SPA spôsobom s použitím PVT PEI, na ktorý sa pôsobí guľôčkami SPA, kopulovanými s aglutinom zo pšeničných klíčkov, guľôčky Typ A (WGA PVT PEI SPA) od firmy Amersham Pharmacia Biotech.

OA

Rádioaktívne označený ligand ([ I] rekombinantný ľudský inzulín) sa pripraví v laboratóriu alebo sa zakúpi od firmy Amersham Pharmacia Biotech, so špecifickou aktivitou 2000 Ci/mmol v deň referenčného dátumu. SPA pokusným pufrom je 50 mmol Tris-HCl, pH 7,8, 150 mmol NaCl, 0,1 % BSA. Pokus sa navrhol pre vysoký výkon v 96-jamkových mikrodoštičkách (Costar, #3632) a automatizuje sa s rádioligandom, membrány a SPA guľôčky sa pridajú pomocou Titertec/Plus (ICN Pharmaceuticals).

Reakčné činidlá sa pridajú do jamiek doštičky v nasledujúcom poradí.

Reakčné činidlo	Konečná koncentrácia
Kontrola alebo riedenie inzulínovej zlúčeniny	Min. signál (BHI) = 0,1 pmol, všetky iné zlúčeniny [Hi] = 0,1 pmol
[ I] rekombinantný ľudský inzulín	50 pmol
HIR membrány	1,25 pg
WGA PVT PEI SPA guľôčky	0,25 mg/jamka

Doštičky sa zakryli adhezívnym uzáverom doštičiek a trepali sa počas 1 minúty na LabLine Instruments trepačke radu doštičiek. Doštičky sa inkubovali pri teplote okolia (22 °C) počas 12 hodín ich umiestnením do Wallac Mikrobeta scintilačného počítadla a nastavením časového zariadenia počas 12 hodín. Počíta sa doba 1 minúta na jamku s použitím normalizovaného protokolu pre [¹²⁵lj.

IC₅₀ pre každú inzulínovú zlúčeninu sa určí s pomocou 4-parametrovej logistickej nelineárnej regresnej analýzy. Dáta sa uvedú ako priemer ± stredná odchýlka. Relatívna afinita sa určí porovnaním každej inzulínovej zlúčeniny s kontrolou tvorenou rekombinantným ľudským inzulínom v každom pokuse a

276/B potom sa vykoná priemerná relatívna afinita počtu pokusov. Preto porovnanie priemernej hodnoty IC₅₀ pre inzulínovú zlúčeninu s priemerom IC₅₀ pre inzulín negeneruje rovnaké hodnoty.

Afinita každej inzulínovej zlúčeniny a rekombinantného ľudského inzulínu pre receptor inzulínového rastového faktoru (IGF1-R) sa meria v pokuse kompetitivnej väzby za použitia [¹²⁵I]IGF-1 rádioaktívne označeného ligandu. Membrány ľudského IGF-1 receptoru sa pripravia ako membránový prípravok P1 stabilne transfekovaných buniek 293EBNA exprimujúcich vo zvýšenej miere receptor. Pokus sa vyvinul a potvrdil v móde filtrácie a SPA (pokusu proximitnej scintilácie) s porovnateľnými výsledkami, ale bežne sa vykonával v SPA móde s použitím SPA guľôčok kopulovaných s aglutínom zo pšeničných klíčkov ošetrených pomocou PVT PEI, Typ A (WGA PVT PEI SPA) od spoločnosti Amersham Pharmacia Biotech. [¹²⁵I]IGF-1 rádioaktívne označený ligand sa pripraví v laboratóriu alebo sa zakúpi od Amersham Pharmacia Biotech, so špecifickou aktivitou 2000 Ci/mmol v referenčný deň. SPA testový pufor bol 50 mmol Tris-HCl, pH 7,8, 150 mmol NaCI, 0,1 % BSA. Pokus sa navrhol pre vysoký výkon v 96-jamkových mikrodoštičkách (Costar, #3632) a automatizoval s rádioligandom, membránami a SPA guľôčkami pridanými s pomocou Titertec/Plus (ICN Pharmaceuticals).

Reakčné činidlá sa pridali do jamiek doštičky v nasledujúcom poradí:

Reakčné činidlo	Konečná koncentrácia
Riedenie kontroly alebo inzulínovej zlúčeniny	Min. signál (IGF-1) = 1 μΜ, všetky iné zlúčeniny [Hi] = 10 μΜ
[12ÔI] IGF-1	50 pM
IGF-1 R membrány	1,25 pg
WGA PVT PEI SPA guľôčky	0,25 mg/jamka

276/B

Doštičky sa zakryli adhezívnym krytom doštičky a trepali 1 minútu na trepačke LabLine Instruments radu doštičiek. Doštičky sa inkubovali pri teplote okolia (22 °C) 12 hodín ich umiestnením v scintilačnom počítači Wallac Mikrobeta a nastavením časového zariadenia na 12 hodín. Počítanie sa vykonávalo 1 minútu na jamku s použitím normalizovaného protokolu pre [ I],

IC₅₀ pre každú inzulínovú zlúčeninu sa určí s pomocou 4-parametrovej logistickej nelineárnej regresnej analýzy. Dáta sa uvedú ako priemer ± SEM. Relatívna afinita sa určí porovnaním každej inzulínovej zlúčeniny s kontrolou rekombinantného inzulínu v každom pokuse a potom sa vykoná priemerná relatívna afinita počtu pokusov. Preto nevedie porovnanie priemernej hodnoty IC₅o pre každú inzulínovú zlúčeninu s priemerom IC₅₀ pre inzulín k rovnakej hodnote.

Index selektivity sa vypočíta ako pomer IR relatívnej afinity k IGF-1 R relatívnej afinite. Index selektivity > 1 ukazuje väčšiu relatívnu selektivitu pre HIR. Index selektivity < 1 ukazuje väčšiu relatívnu selektivitu pre IGF-1R.

Tabuľka 1 znázorňuje afinitu k inzulínovému receptoru (IR), receptorovú afinitu k inzulínu podobnému rastovému faktoru 1 (IGF1-R) a index receptorovej selektivity (IR/IGF1-R) pre každú inzulínovú zlúčeninu a rekombinantný ľudský inzulín.

276/B

Tabuľka 1

Inzulínová zlúčenina	Relatívna Afinita	IR	Relatívne IGF1-R Afinita	Index
	Stred	SEM	n	Stred	SEM	n
rekombinantný ľudský inzulín	1,00	0,00	63	1,00	0,00	63	1,00
A0Ar9B0Ar9B29Lys’NE‘Ar9- inzulín	0,60	0,06	10	0,84	0,03	9	0,71
A0Ar9A21 ΰ^Β29^5*ΝεΑΓ9- inzulín	0,34	0,02	8	0,39	0,03	8	0,87
AoLys'Ns'Ar9 A21 GlyB29Lys NE‘Arg’inzulin	0,41	0,04	8	0,4	0,04	8	1,01

Príklad 14

In vitro metabolický účinok

Metabolický účinok (odber glukózy) každej inzulínovej zlúčeniny a rekombinantného ľudského inzulínu sa určí v pokuse odberu glukózy s použitím diferencovaných myších 3T3-L1 adipocytov. Nediferencované myšie 3T3 bunky sa vysadia s hustotou 25 000 buniek/jamka v 100 μΙ rastového média (DMEM, vysoký obsah glukózy, bez Ľ-glutamínu, 10 % teľacieho séra, 2 mmoly Lglutamínu, 1 % antibiotický/antimykotický roztok).

Diferenciácia začne 3 dni po vysadení pridaním diferenciačného média: DMEM, vysoká glukóza, bez L-glutamínu, 10 % FBS, 2 mmoly L-glutamín, 1 % antibiotický/antimykotický roztok, 10 mmol HEPES, 0,25 mmol dexametazon, 0,5 mmol 3-izobutyl-1-metylxantín (IBMX), 5 mg/ml inzulín. Po 48 hodinách (3. deň) sa diferenciačné médium zamení za médium s inzulínom, ale bez IBMX alebo dexametazonu a v 6. deň sa bunkám zmení médium na diferenciačné médium neobsahujúce inzulín, IBMX alebo dexametazon. Bunky sa udržiavajú v FBS médiu, s každodennou výmenou.

276/B

Experiment s transportom glukózy sa vykoná s použitím Cytostar T 96 jamkových doštičiek. 24 hodín pred pokusom sa k bunkám pridá 100 μΙ média bez séra obsahujúceho 0,1 % BSA. V deň pokusu sa médium odstráni a pridá sa 50 μΙ pokusného pufra: tzv. KRBH alebo Krebs-Ringerov pufor obsahujúci HEPES, pH 7,4 (118 mmol NaCl, 4,8 mmol KCI, 1,2 mmol MgSO₄ x 7 H₂O, 1,3 mmol CaCI₂ . H₂O, 1,2 mmol KH₂PO₄, 15 mmol HEPES). Riedením inzulínu sa pripraví rovnaký pufor s 0,1 % BSA a pridá sa 2x. Kontrola obsahovala KRBH, 0,1 % BSA a 20 mmol 2x 2-deoxy-D-glukózy, 0,2 pCi/jamka 2-deoxy-D-(U-¹⁴C) glukózy a 2x 10'⁷ inzulínu. Bunky sa inkubujú pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Po tejto perióde sa pridá 10 μΙ cytochalazínu B na konečnú koncentráciu s veľkosťou 200 μίτιοΙ v KRBH a doštičky sa čítajú na Mikrobeta čítacím zariadením doštičiek. Relatívna afinita sa určí porovnaním každej inzulínovej zlúčeniny vzhľadom k rekombinantnej ľudskej inzulínovej kontrole v každom pokuse a potom sa vykoná priemerná relatívna afinita počtu pokusov. Preto nevedie porovnanie priemernej hodnoty EC₅₀ pre každú inzulínovú zlúčeninu s priemerom EC50 pre inzulín k rovnakej hodnote.

Tabuľka 2 znázorňuje in vitro metabolický účinok pre každú inzulínovú zlúčeninu a rekombinantný ľudský inzulín.

Tabuľka 2

Inzulínová zlúčenina	Metabolický účinok
	Stred	N
rekombinantný ľudský inzulín	1,00	48
A0Ar9B0Aľ9B29LysNí:'Ar9-inzulín	0,85	4
A0Ar9A21GlyB29Lys‘NE’Ar9-inzulín	0,48	2
A0Lys-NE-ArgA21GlyB29Lys-NE-Arg jnzu|ín	0,4	2

276/B

Príklad 15

In vitro mitogenicita

Mitogénny účinok každej inzulínovej zlúčeniny sa určí meraním proliferácie ľudských epiteliálnych buniek prsníka (HMEC) v kultúre. HMEC sa získa od firmy Clonetics Corporation (San Diego, CA) pri pasáži číslo 7, expandujú sa a zmrazia pri pasáži číslo 8. Zakaždým sa použije čistá ampula tak, aby sa všetky pokusy vykonali pri rovnakej pasáži číslo 10 HMEC. Bunky sa udržiavajú v kultúre v súlade s Bio Whittaker inštrukciami. Za účelom udržania bunkovej kultúry sa rastové médium mení každý deň a kultúry sa každý deň prezerajú.

Dva produkty od firmy BioWhittaker sa použili ako rastové médium:

1. Plne obohatené MEGM (CC-3051) zahrňujúce: (množstvá ukazujú konečné koncentrácie, okrem BPE) ng/ml hEGF (ľudský rekombinantný Epidermálny Rastový Faktor) pg/ml inzulínu

0,5 μg/ml hydrokortizonu μg/ml Gentamycínu ng/ml Amfotericínu-B mg/ml BPE (hovädzí extrakt z hypofýzy) 2 ml (priložené); a

2. Bazálne médium (MEBM, CC-3151) s vyššie uvedeným obohatením (SingleQuots, CC-3150) mg/ml BPE (hovädzí extrakt z hypofýzy (CC-4009) 2 ml pg/ml hEGF (CC-4017) 0,5 ml pg/ml inzulínu (CC-4031) 0,5 ml

0,5 mg/ml hydrokortizonu (CC-4031) 0,5 ml mg/ml Gentamycínu,

276/B mg/ml Amfotericínu-B (CC-4081) 0,5 ml.

Pre pokus rastu sa použilo ako pokusné médium rastové médium bez 5 pg/ml inzulínu a s 0,1 % BSA. Pokus sa vykoná v 96-jamkových Cytostart scintilačných mikrodoštičkách (Amersham Pharmacia Biotech, RPNQ0162). Rekombinantný ľudský inzulín a IGF-1 sa použili ako kontrola v každom pokuse a rekombinantný ľudský inzulín bol na každej pokusnej doštičke.

Pokusy sa vykonajú v súlade s nasledujúcim protokolom. V deň jedna sa HMEC vysadí s hustotou 4 000 buniek/jamka v 100 μΙ pokusného média. Inzulín v rastovom médiu sa nahradí stupňovanými dávkami rekombinantného ľudského inzulínu alebo inou inzulínovou zlúčeninou od 0 do 1 000 nmol konečnej koncentrácie. Po 4-hodinovej inkubácii sa pridá do každej jamky 0,1 μθί 4C-tymidínu v 10 μΙ pokusného média a doštičky sa čítajú 48 hodín a/alebo 72 hodín na Triluxe.

Maximálna rastová odozva sa typicky nachádza medzi 3 - 4-násobkom stimulácie vzhľadom k základu. Dáta odozvy sa normalizujú na 0 až 100 % odozva rovná sa 100X (odozva pri koncentrácii X - odozva pri koncentrácii nula) delené (odozva pri maximálnej koncentrácii - odozva pri nulovej koncentrácii). Dáta koncentrácia-odozva sa vyhodnotia nelineárnou regresiou s použitím software JMP.

Relatívny mitogénny účinok sa určí porovnaním každej inzulínovej zlúčeniny k inzulínovej kontrole v každom pokuse a potom spriemerovanim relatívneho účinku vzhľadom k počtu vykonaných pokusov. Preto porovnanie priemernej hodnoty nevedie k rovnakej hodnote EC50 pre každú inzulínovú zlúčeninu s priemerom EC₅₀ pre inzulín.

Tabuľka 3 znázorňuje in vitro mitogenicitu, ktorá sa meria ako bunková proliferácia pre každú inzulínovú zlúčeninu. Dáta v tabuľke 3 ukazujú, že každá z inzulínových zlúčenín je menej mitogénna ako rekombinantný ľudský inzulín.

276/B

Tabuľka 3

Inzulínová zlúčenina	Mitogénny účinok
	Stred	SEM	N
rekombinantný ľudský inzulín	1,00	0,00	250
A0Aľ9B0ArgB29Lys'Ne’Aľ9-inzulín	0,76	0,10	4
A0Ar9A21GlyB29Lys'Ne'Aľ9-inzulín	0,35	0,04	7
A0Lys-NE-Arg A21GlyB29Lys-NE-Arg inzuljn	0,36	0,03	7

Príklad 16

Rozpustnosť v soľnom roztoku fosforečnanového pufra

Pokus in vitro zrážania ukazujúci náchylnosť k predĺženému účinku v čase in vivo sa vykoná spôsobom, ktorý je uvedený nasledovne. pH vodného roztoku sa upravilo na hodnotu 4 a obsiahnutá farmakologická dávka (100 medzinárodných jednotiek) inzulínovej zlúčeniny a 30 pg/ml ZN²⁺, 2,7 mg/ml mkrezolu a 17 mg/ml glycerolu % sa neutralizuje s fosforečnanovým soľným roztokom pufra (PBS) na 2 medzinárodné jednotky a centrifuguje sa počas 5 minút pri zrýchlení s hodnotou 14 000 otáčok za minútu a pri teplote okolia. Supernatant sa odstráni a približne desatina supernatantu sa injikuje do analytického Symmetry Shield RP8 RP-HPLC systému (Waters, Inc.). Plocha pod vymytým vrcholom sa integruje a porovnáva s plochou pod vrcholom referenčného štandardu, ktorým bol rekombinantný ľudský inzulín v 0,1 M HCI. Pomer plôch sa násobí 100, aby sa získala hodnota % rozpustnosti v PBS.

PBS rozpustnosť pre prípravky rekombinantného ľudského inzulínu a pre každú inzulínovú zlúčeninu je ukázaná v tabuľke 4.

276/B

Tabuľka 4

Inzulínová zlúčenina	PBS rozpustnosť
rekombinantný ľudský inzulín	89,5
A0Aľ9B0AľgB29Lys'Ne'Arg-inzulín	22,4
A0Ar9A21GlyB29Lys'NE’Arg-inzulín	19,1
A0Lys-NE-ArgA21GlyB29Lys-NE-Arg inzuljn	12,9

Príklad 17

Izoelektrický bod

Izoelektrická fokusácia je elektroforetická technika, ktorá oddeľuje proteiny na základe ich izoelektrických bodov (pl). Hodnota pl je hodnotou pH, pri ktorej sa celkový náboj proteínu rovná nule a nepohybuje sa v elektrickom poli. IEF gély účinne vytvárajú gradient pH, takže sa proteiny separujú na základe ich jedinečnej hodnoty pl. Detekcia proteínových pruhov sa môže uskutočniť označením citlivým farbivom ako je Novex Collodial Coomassie Staining Git. Alternatívne sa detekcia môže dosiahnuť prenosom gélu na polyvinylidéndifluoridovú (PVDF) membránu a jej označenie farbivom Ponceau Red. pl proteínu sa určí jeho porovnaním s pl známeho štandardu. IEF proteínové štandardy sú kombinácie proteínov s dobre charakterizovanými hodnotami pl, ktoré sa zmiešajú kvôli získaniu rovnomerného zafarbenia. Ďalším spôsobom určovania pl je IEF kapilárnou elektroforézou (cIEF). pl sa určí porovnaním so známymi markérmi.

Izoelektrický bod (pl) rekombinantného ľudského inzulínu a každej inzulínovej zlúčeniny sa určí gélovou elektroforézou s izoelektrickou fokusáciou s použitím gélov Novex IEF s pH 3 - 10, ktoré prinášajú rozmedzie pl medzi 3,5 - 8,5. Izoelektrické body sú v tabuľke 5.

276/B

Tabuľka 5

Inzulínová zlúčenina	Izoelektrický bod
rekombinantný ľudský inzulín	5,62
A0Ar9B0ArgB29Lys’N£'Ar3-inzulín	7,15
/\0Ar9A21GlyB29Lys'NE’Ar9-inzulín	6,80
A0Lys-NE-ArgA21GlyB2gLys-NE-Arg jnzu|jn	7,10

Príklad 18

In vivo štúdie so psami

Pokusy sa vykonávali na psoch a sučkách beagle (Marshall Farms, North Rose, NY) v bdelom stave, ktoré sa nechali cez noc bez potravy a trvalo kanylovali (femorálna artéria a cieva). V deň pokusu sa aktivovali vaskulárne prístupové porty (Access Technologies, Norfolk Medical, Skokie, IL) a zvieratá sa umiestnili do klietok s rozmermi 3' x 3'. Psi sa nechali aspoň 15 minút aklimatizovať na prostredie klietky, kým sa im odobrala arteriálna krvná vzorka na určenie koncentrácie inzulínu a glukózy v bdelom stave (čas = - 30 minút). V tento okamih začne kontinuálna cievna infúzia (0,65 pg/kg/min) cyklického somatostatínu (BACHEM, Torrence, CA) a pokračuje ďalších 24,5 hodín. Tridsať minút po štarte infúzie (čas = 0) sa odoberie arteriálna vzorka a injektuje sa podkožný bolus soľného roztoku alebo inzulínového prípravku (2 nmol/kg) do dorzálnej oblasti chrbta. Od tejto doby sa odoberali periodicky arteriálne krvné vzorky kvôli určeniu koncentrácií glukózy a inzulínu v plazme.

Koncentrácia glukózy v plazme sa určila v deň štúdie s použitím spôsobu oxidáza glukózy, používajúceho prístroj Beckman Glucose Analyzer II (Beckman Instruments Inc., Brea, CA). Vzorky plazmy sa uchovávali pri teplote -80 °C až do okamihu analýzy inzulínu. Koncentrácie inzulínu sa určili s použitím komerčne dostupnej súpravy pre rádioimunologické pokusy, ktoré boli citlivé na ľudský inzulín a inzulínové zlúčeniny.

276/B

A0^Ar9B0^Aľ9B29^Lys’^NE'^Ar9-inzulín a NPH inzulín každý vykazovali časové pôsobenie, ktoré bolo lepšie ako u kontrolného soľného roztoku. A0^Ar9B0^Aľ9B29^Lys‘^NE‘^Ar9-inzulínový roztok vykazoval časové pôsobenie porovnateľné s NPH inzulínom.

A0^Ar9A21^GlyB29^Lys'^NE‘^Aľ9-inzulín a A0^Lys-^Nf;’^Ar9A21^GlyB29^Lys’^NÍ;-^Ar9-inzulín sa porovnávali so soľným roztokom a inzulínovým glargínom (A21^GlyB31^Aľ9B32^Aľ9inzulín). U každej z dvoch štúdií A0^Ar9A21^GlyB29^Lys'^NE'^Ars-inzulín, A0^Lys'^NE’ ^Ar9A21^GlyB29^Lys'^NE'^Aľg-inzulín a glargín vykazovali časové pôsobenie, ktoré bolo dlhšie ako u kontrolného soľného roztoku. V prvej štúdii A0^A^\21^GlyB29^Lys’^NE‘^Arginzulín a A0^Lys'^NE'^ArgA21^GlyB29^Lys'^NE'^Arg-inzulin vykazovali časové pôsobenie porovnateľné s glargínom. V druhej štúdii Ä0^ArgA21^GlyB29^Lys’^NE'^Arg-inzulín a A0^Lys‘^NE'^ArgA21^GlyB29^Lys'^NE’^Arg-inzulín vykazovali časové pôsobenie, ktoré bolo kratšie ako u glargínu.

Príklad 19

In vivo štúdia u krýs

Pokusy sa vykonávali u trvalo kanylovaných (femorálna artéria a cieva) samcov krýs Sprague Dawley po hladovaní cez noc. Ráno v deň pokusu sa odsal obsah katétrov; konce katétrov sa pripojili k predlžovacím vedeniam a zvieratá sa umiestnili do pokusných klietok s rozmermi 12” x 12. Po uplynutí 30-minútovej aklimatizačnej periódy sa odobrala arteriálna krvná vzorka a podal sa bolus vehikula (soľný roztok obsahujúci 0,3 % krysieho albumínu) alebo inzulínovej zlúčeniny (prípravok inzulínovej zlúčeniny riedený v soľnom roztoku obsahujúcom 0,3 % krysieho albumínu; 0,1, 0,2, 0,4, 0,8 alebo 1,2 nmol/kg; n = 5/dávka). Krv sa odoberala 10, 20, 30, 45 a 60 minút po intravenóznej injekcii.

Všetky krvné vzorky sa odoberali do skúmaviek obsahujúcich sodný

EDTA a uložili na ľade. Vzorky sa centrifugovali; plazma sa odobrala a koncentrácie glukózy v plazme sa určili v deň štúdie s použitím pristroja

Monarch Clinical Chemistry Analyzer.

276/B

Integrál kriviek glukózy (O - 30 minút) sa vypočítal s použitím lichobežníkového pravidla. Výsledné hodnoty pre rôzne dávky sa graficky vyjadrili s použitím GraphPad Prism. Určila sa dávka, ktorá zodpovedala integrálu krivky glukózy s hodnotou 2,45 g.min/μΙ a hodnota sa použila na priame porovnanie relatívnej sily inzulínových prípravkov.

V jednom pokuse sa odhadovaný účinok pre rekombinantný ľudský inzulín rovnal 0,160 nmol/kg a bol 0,158 nmol/kg pre A0^Ar9B0^Ar3B29^LysNE‘^Arginzulín.

V inom pokuse sa odhadovaný účinok pre rekombinantný ľudský inzulín rovnal 0,162 nmol/kg a bol 0,200 nmol/kg pre A0^ArgA21^GlyB0^ArgB29^Lys'^Ne’^Arginzulín.

V inom pokuse sa odhadovaný účinok pre rekombinantný ľudský inzulín rovnal 0,207 nmol/kg, odhadovaný účinok pre A0^ArgA21^SerB0^Ar9B29^Lys’^Ne’^Arginzulín bol 0,226 nmol/kg a odhadovaný účinok pre A0^ArgA21^GlyB29^Lys’^NE’^Arginzulín bol 0,268 nmol/kg.

V inom pokuse odhadovaný účinok pre rekombinantný ľudský inzulín bol 0,317 nmol/kg a odhadovaný účinok pre A0^Lys'^NE’^Ar9A21^GlyB29^Lys_Nt‘^Arg-inzulín bol 0,320 nmol/kg.

V inom pokuse bol odhadovaný účinok pre rekombinantný ľudský inzulín 0,217 nmol/kg, odhadovaný účinok pre A0^LysWAr9A21^GlyB29^Lys‘^NE’^Aľg-inzulín bol 0,275 nmol/kg a odhadovaný účinok pre A0^ArgA21^GlyB29^Lys'^NK'^Arg-inzulín bol 0,258 nmol/kg.

Príklad 20

Kryštál zinok-A0^ArgB0^Arg-inzulín a zinok-protamín

Zásobný roztok A sa pripraví rozpustením 16,1 g syntetického glycerínu,

0,73 g fenolu a 1,6 m-krezolu v približne 350 ml destilovanej vody. Po rozpustení sa pridá destilovaná voda na konečnú hmotnosť roztoku 503 g.

Zásobný roztok protamín sulfátu sa pripraví rozpustením 0,0366 g protamín

276/B sulfátu v 10 ml destilovanej vody. Zásobný roztok A0^Ar3B0^Ar9-inzulínu sa pripraví rozpustením 0,0121 g A0^Aľ9B0^Ar9-inzulínu v 1,28 ml zásobného roztoku A. Zásobný roztok oxidu zinočnatého sa pripraví riedením 1 ml 25 mg/ml roztoku oxidu zinočnatého, konečný objem 25 ml kvôli dosiahnutiu konečnej koncentrácie oxidu zinočnatého 1 mg/ml. Zásobný roztok fosforečnanu sodného sa pripraví rozpustením 0,0577 g dihydrogénfosforečnanu sodného v 15 ml destilovanej vody. Zásobný roztok chloridu sodného sa pripraví rozpustením 1,1607 g chloridu sodného v 10 ml destilovanej vody.

Na pokus s kryštálmi zinok-A0^Aľ9B0^Ar9-inzulínu sa zmiešajú A0^ArgB0^Ar9inzulín, oxid zinočnatý a zásobný roztok A za kyslého pH. K niektorým vzorkám sa tiež pridá chlorid sodný. Všetky vzorky sa kombinujú na konečný objem 0,1 ml. Pridá sa 0,1 ml zásobného roztoku fosforečnanu sodného a vznikne precipitát. Konečné pH sa upraví na hodnotu medzi 7,4 a 9,3. Kryštál zinokA0^Ar9B0^Aľ9-inzulín protamínu sa pripraví rovnakým spôsobom s výnimkou, že s A0^Ar9B0^Ar9-inzulinom, oxidom zinočnatým, chloridom sodným a zásobným roztokom A sa tiež skombinoval protamín sulfát.

Každá vzorka sa potom rozdelila na dve polovice. Jedna vzorka sa inkubovala pri teplote 30 °C a iná vzorka sa nechala pri teplote okolia. Podmienky testu sú ukázané v tabuľke 6 a kryštály sa pozorovali pre každý súbor testovaných podmienok. Všetky koncentrácie sú nominálne.

276/B η

Tabuľka 6

A0ArgB0Arginzulín (mg/ml)	Protamín sulfát (mg/ml)	Zinok (pg/ml)	NaCl (mM)	pH	Teplota
3,5	0	0,25	0	7,4	okolia
3,5	0	0,25	100	7,5	okolia
3,5	0	0,25	0	8,5	okolia
3,5	0	0,25	100	8,5	okolia
3,5	0	0,25	0	9,3	okolia
3,5	0	0,25	100	9,2	okolia
3,5	0,37	0,25	100	7,4	okolia
3,5	0,37	0,25	100	8,5	okolia
3,5	0,37	0,25	100	9,2	okolia
3,5	0	0,25	0	7,4	30 °C
3,5	0	0,25	100	7,5	30 °C
3,5	0	0,25	0	8,5	30 °C
3,5	0	0,25	100	8,5	30 °C
3,5	0	0,25	0	9,3	30 °C
3,5	0	0,25	100	9,2	30 °C
3,5	0,37	0,25	100	7,4	30 °C
3,5	0,37	0,25	100	8,5	30 °C
3,5	0,37	0,25	100	9,2	30 °C

Príklad 21

Kryštály zinok-A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys'^Ne'^Ar9-inzulín a kryštály zinok-protamín

Zásobný roztok A a zásobné roztoky oxidu zinočnatého, fosforečnanu sodného a chloridu sodného sa pripravia ako v príklade 20.

Zásobný roztok protamín sulfátu sa pripraví rozpustením 0,0332 g protamín sulfátu v 10 ml zásobného roztoku A. Zásobný roztok

A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys'^Ns’^Ar9-inzulinu sa pripraví rozpustením 0,0112 g

276/B

A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys'^NE'^Ar9-inzulínu v 1,25 ml zásobného roztoku A.

Pre pokus s kryštálmi zinok-A0^Aľ9B0^Ar9B29^Lys’^NE’^Aľ9-inzulínu sa A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys'^NE'^Aľ9-inzulín, oxid zinočnatý a zásobný roztok A zmiešajú za kyslého pH. Chlorid sodný sa tiež pridal k niektorým vzorkám. Všetky vzorky sa kombinujú na konečný objem 0,1 ml dosiahnutia rôznych podmienok. Pridalo sa 0,1 ml zásobného roztoku fosforečnanu sodného a vytvoril sa precipitát. Konečné pH sa upravilo na hodnotu medzi 7,4 a 9,3.

Kryštály zinok-A0^Aľ9B0^Ar9B29^Lys'^NE‘^Aľ9-inzulín protamínu sa pripravia rovnakým spôsobom, okrem toho, že s A0^ArsB0^Ar9B29^Lys'^NE'^Ar9-inzulínom, oxidom zinočnatým, chloridom sodným a zásobným roztokom A sa tiež skombinoval protamín sulfát.

Každá vzorka sa potom rozdelila do dvoch častí. Jedna vzorka sa inkubovala pri teplote 30 °C a iná vzorka sa nechala pri teplote okolia. Testované podmienky sú ukázané v tabuľke 7 a kryštály sa pozorovali pre každý súbor testovaných podmienok. Všetky koncentrácie sú nominálne.

Ďalej sa vykonali pokusy na optimalizáciu koncentrácie chloridu sodného a pH. Zásobný roztok A sa pripraví rozpustením 12,8 g syntetického glycerínu, 0,59 g fenolu a 1,28 g m-krezolu v približne 300 g destilovanej vody. Po rozpustení sa pridá destilovaná voda na konečnú celkovú hmotnosť roztoku 403 g. Zásobný roztok protamín sulfátu sa pripraví rozpustením 0,033 g protamín sulfátu v 10 ml zásobného roztoku. Zásobný roztok A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys' ^Ns’^Ar9-inzulínu sa pripraví rozpustením 0,0042 g A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys’^Ne'^Ar9-inzulínu v 0,3 ml zásobného roztoku A. Zásobný roztok oxidu zinočnatého sa pripraví rozpustením 0,0308 g oxidu zinočnatého v 1 ml 5 N kyseliny chlorovodíkovej a destilovaná voda sa pridá na konečný objem 25 ml. Zásobný roztok fosforečnanu sodného sa pripraví rozpustením 0,1893 g dihydrogénfosforečnanu sodného v destilovanej vode na konečný objem roztoku 50 ml. Zásobný roztok chloridu sodného sa pripraví rozpustením 1,173 g chloridu sodného v 10 ml destilovanej vody.

A0^Ar9B0^Ar9B29^Lys'^NE‘^Ar9-inzulín, protamín sulfát, oxid zinočnatý, chlorid

276/B sodný a zásobný roztok A sa kombinujú na konečný objem 0,1 ml. Pridá sa zásobný roztok fosforečnanu sodného a vytvorí sa precipitát. Konečné pH sa upravilo na hodnotu medzi 7,4 a 9,3.

Každá vzorka sa potom rozdelila do dvoch časti. Jedna vzorka sa inkubovala pri teplote 30 °C a iná vzorka sa nechala pri teplote okolia. Testované podmienky sú ukázané v tabuľke 8 a kryštály sa pozorovali pre každý súbor testovaných podmienok. Všetky koncentrácie sú nominálne.

Tabuľka 7

A0Ar9B0ArgB29 Lys-NE-Arg_jnzulín (mg/ml)	Protamín sulfát (mg/ml)	Zinok (pg/ml)	NaCI (mM)	pH	Teplota
3,4	0	0,25	0	7,4	okolia
3,4	0	0,25	100	7,4	okolia
3,4	0	0,25	0	8,5	okolia
3,4	0	0,25	100	8,5	okolia
3,4	0	0,25	0	9,2	okolia
3,4	0	0,25	100	9,2	okolia
3,4	0,33	0,25	100	7,4	okolia
3,4	0,33	0,25	100	8,6	okolia
3,4	0,3	0,25	100	9,2	okolia
3,4	0	0,25	0	7,4	30 °C
3,4	0	0,25	100	7,4	30 °C
3,4	0	0,25	0	8,5	30 °C
3,4	0	0,25	100	8,5	30 °C
3,4	0	0,25	0	9,2	30 °C
3,4	0	0,25	100	9,2	30 °C
3,4	0,33	0,25	100	7,4	30 °C
3,4	0,33	0,25	100	8,6	30 °C
3,4	0,33	0,25	100	9,2	30 °C

276/B

Tabuľka 8

A0Ar9B0ArgB29 Lys-Na-Arg_jnzu|ín (mg/ml)	Protamín sulfát (mg/ml)	Zinok (pg/ml)	NaCl (mM)	pH	Teplota
3,5	0,33	0,25	200	7,4	okolia
3,5	0,33	0,25	50	8,5	okolia
3,5	0,33	0,25	100	8,4	okolia
3,5	0,33	0,25	200	8,5	okolia
3,5	0,33	0,25	50	8,4	okolia
3,5	0,33	0,25	200	9,2	okolia
3,5	0,33	0,25	200	7,4	30 °C
3,5	0,33	0,25	50	8,5	30 °C
3,5	0,33	0,25	100	8,4	30 °C
3,5	0,33	0,25	200	8,5	30 °C
3,5	0,33	0,25	50	8,4	30 °C
3,5	0,33	0,25	200	9,2	30 °C

Príklad 22

Kryštály zinok-A0^Lys-^Ne-^Ar9-A21^GlyB29^Lys-^NE-^Aľ9-inzulín

Na nasledujúce pokusy sa pripraví zásobný roztok A a zásobné roztoky chloridu sodného, fosforečnanu sodného, oxidu zinočnatého a citrátu sodného, ako je následne uvedené.

Zásobný roztok A sa pripraví rozpustením 128,2 g syntetického glycerínu, 5,9 g fenolu, 12,9 g m-krezolu a 30,3 g dihydrogénfosforečnanu sodného v približne 3500 ml mili-Q vody. Po rozpustení sa pridá mili-Q voda na konečnú hmotnosť roztoku 4 000 g.

Zásobný roztok chloridu sodného sa pripraví rozpustením 1,1614 g chloridu sodného v 10 ml destilovanej vody.

276/B

Zásobný roztok fosforečnanu sodného sa pripraví rozpustením 0,7538 g dihydrogénfosforečnanu sodného v 10 ml destilovanej vody. 0,5 ml tohto fosforečnanového roztoku sa riedilo do 9,5 ml destilovanej vody.

Zásobný roztok oxidu zinočnatého sa pripraví rozpustením 0,4 ml zásobného roztoku oxidu zinočnatého s koncentráciou 25 mg/ml a 9,6 ml destilovanej vody kvôli získaniu konečnej koncentrácie oxidu zinočnatého 1 mg/ml.

Zásobný roztok citrátu sodného sa pripraví rozpustením 2,9597 g citrátu sodného v 10 ml destilovanej vody.

V jednom pokuse sa pripraví zásobný roztok A0^Lys’^NE‘^Ar9-A21^GlyB29^Lys’^N£· ^Ar9-inzulínu rozpustením 0,00335 g A0^{Lys NE}’^Ar9-A21^GlyB29^Lys'^Ní:'^Ar9-inzulínu v 0,65 ml zásobného roztoku A. Roztok bol kalný a hodnota pH bola približne 7,1. pH sa upravilo na približne 3,7 kvôli dosiahnutiu číreho roztoku.

Kryštalizácia sa iniciovala najprv spojením A0^Lys‘^NE‘^Ar9-A21^GlyB29^Lys’^NE‘^Aľ9inzulínu s oxidom zinočnatým, pridaním zásobného roztoku A a zásobného roztoku chloridu sodného. Hodnota pH roztoku sa udržiavala pod 4. Potom sa pridal zásobný roztok fosforečnanu sodného a vytvoril sa precipitát. Konečné pH sa upravilo na hodnotu medzi 6,5 a 9,5. Každá vzorka sa potom rozdelila do troch častí. Jedna vzorka sa inkubovala pri teplote 5 °C, jedna pri teplote 30 °C a iná vzorka sa nechala pri teplote okolia. Testovacie podmienky a výsledky pokusov sú ukázané v tabuľke 9. Všetky koncentrácie sú nominálne.

276/B

Tabuľka 9

AQLys-Ne-Arg A21 G|yB29Lys'NE'Ars- inzulín (mg/ml)	Zinok (pg/ml)	NaCl (mM)	Na2PO4 (mM)	pH	Teplota	Pozorované kryštály
2,6	25	0	21	6,6	5 °C	nie
2,6	25	0	21	7,3	5 °C	nie
2,6	25	0	21	8,0	5 °C	nie
2,6	100	0	21	6,4	5 °C	nie
2,6	100	0	21	7,3	5 °C	nie
2,6	100	0	21	8,2	5 °C	nie
2,6	25	100	21	6,5	5 °C	nie
2,6	25	100	21	7.2	5 °C	nie
2,6	25	100	21	8,5	5 °C	áno
2,6	100	100	21	6,4	5 °C	nie
2,6	100	100	21	7,2	5 °C	nie
2,6	100	100	21	8,4	5 °C	áno
2,6	25	0	21	6,6	okolie	nie
2,6	25	0	21	7,3	okolie	nie
2,6	25	0	21	8,0	okolie	nie
2,6	100	0	21	6,4	okolie	nie
2,6	100	0	21	7,3	okolie	nie
2,6	100	0	21	8,2	okolie	nie
2,6	25	100	21	6,5	okolie	nie
2,6	25	100	21	7,2	okolie	áno
2,6	25	100	21	8,5	okolie	nie
2,6	100	100	21	6,4	okolie	nie
2,6	100	100	21	7,2	okolie	áno
2,6	100	100	21	8,4	okolie	áno

276/B

2,6	25	0	21	6,6	30 °C	nie
2,6	25	0	21	7,3	30 °C	nie
2,6	25	0	21	8,0	30 °C	áno
2,6	100	0	21	6,4	30 °C	nie
2,6	100	0	21	7,3	30 °C	nie
2,6	100	0	21	8,2	30 °C	nie
2,6	25	100	21	6,5	30 °C	áno
2,6	25	100	21	7,2	30 °C	áno
2,6	25	100	21	8,5	30 °C	nie
2,6	100	100	21	6,4	30 °C	nie
2,6	100	100	21	7,2	30 °C	áno
2,6	100	100	21	8,4	30 °C	áno

V inom pokuse sa pripraví zásobný roztok A0^Lys'^N£'^Ar9-A21^G,yB29^Lys'^N>;'^Arginzulínu rozpustením 0,0032 g A0^Lys'^N£'^Ars-A21^GlyB29^Lys'^NE’^Ar9-inzulínu v 0,65 ml zásobného roztoku A. Roztok bol kalný a hodnota pH bola približne 7,1. pH sa upravilo na približne 3,7 kvôli dosiahnutiu číreho roztoku.

Kryštalizácia sa inicializovala najprv skombinovaním A0^Lys'^Ní:‘^ArgA21^GlyB29^Lys'^NE_Ar9-inzulínu s oxidom zinočnatým, pridaním zásobného roztoku A, zásobného roztoku chloridu sodného a/alebo zásobného roztoku citrátu sodného. pH roztoku sa udržiavalo pod 4. Potom sa pridal zásobný roztok fosforečnanu sodného a vytvoril sa precipitát. Konečné pH sa upravilo na hodnotu medzi 6,5 a 9,5. Každá vzorka sa potom rozdelila na tri časti. Jedna vzorka sa inkubovala pri teplote 5 °C, jedna pri teplote 30 °C a iná vzorka sa nechala pri teplote okolia. Podmienky testov a dosiahnuté výsledky sú ukázané v tabuľke 10. Všetky koncentrácie sú nominálne.

276/B

Tabuľka 10

AQLys-NE-Arg_ A21 Gy'B29Lys~N!:'Ar9- inzulín (mg/ml)	Zinok (pg/ml)	NaCI (mM)	Na cit rát (mM)	Na2PO4 (mM)	pH	Teplota	Pozorované kryštály
2,5	25	0	100	21	6,3	5 °C	nie
2,5	25	0	100	21	8,2	5 °C	áno
2,5	25	0	100	21	7,4	5 °C	nie
2,5	100	0	100	21	6,5	5 °C	nie
2,5	100	0	100	21	7,5	5 °C	áno
2,5	100	0	100	21	8,5	5 °C	nie
2,5	25	50	75	21	6,5	5 °C	nie
2,5	25	50	75	21	7,5	5 °C	áno
2,5	25	50	75	21	8,3	5 °C	áno
2,5	100	50	75	21	6,5	5 °C	nie
2,5	100	50	75	21	7,5	5 °C	áno
2,5	100	50	75	21	8,4	5 °C	áno
2,5	25	0	100	21	6,3	okolie	nie
2,5	25	0	100	21	8,2	okolie	áno
2,5	25	0	100	21	7,4	okolie	nie
2,5	100	0	100	21	6,5	okolie	nie
2,5	100	0	100	21	7,5	okolie	áno
2,5	100	0	100	21	8,5	okolie	áno
2,5	25	50	75	21	6,5	okolie	nie
2,5	25	50	75	21	7,5	okolie	áno
2,5	25	50	75	21	8,3	okolie	áno
2,5	100	50	75	21	6,5	okolie	áno
2,5	100	50	75	21	7,5	okolie	áno
2,5	100	50	75	21	8,4	okolie	áno
2,5	25	0	100	21	6,3	30 °C	nie
2,5	25	0	100	21	8,2	30 °C	áno
2,5	25	0	100	21	7,4	30 °C	áno
2,5	100	0	100	21	6,5	30 °C	áno

276/B

2,5	100	0	100	21	7,5	30 °C	áno
2,5	100	0	100	21	8,5	30 °C	áno
2,5	25	50	75	21	6,5	30 °C	nie
2,5	25	50	75	21	7,5	30 °C	áno
2,5	25	50	75	21	8,3	30 °C	áno
2,5	100	50	75	21	6,5	30 °C	áno
2,5	100	50	75	21	7,5	30 °C	áno
2,5	100	50	75	21	8,4	30 °C	áno

V inom pokuse sa zásobný roztok octanu sodného pripraví rozpustením 0,8203 g octanu sodného v 10 ml destilovanej vody. Zásobný roztok A0^{Lys NE}'^ArgA21^GlyB29^Lys'^NE’^Aľ9-inzulínu sa pripraví rozpustením 0,003 g A0^Lys'^Ne’^Ar9A21^GlyB29^Lys'^Ne'^Ar9-inzulínu v 0,63 ml zásobnom roztoku A. Roztok bol kalný a hodnota pH bola približne 7,1. pH sa upravilo na približne 3,7 kvôli dosiahnutiu číreho roztoku.

Kryštalizácia sa inicializovala najprv skombinovaním A0^Lys’^Ne'^Ar9A21^GlyB29^Lys'^Ne'^Ar9-inzulínu s oxidom zinočnatým, pridaním zásobného roztoku A, zásobného roztoku chloridu sodného a/alebo octanu sodného. pH roztoku sa udržiavalo pod 4. Potom sa pridal zásobný roztok fosforečnanu sodného a vytvoril sa precipitát. Konečné pH sa upravilo na hodnotu medzi 6,5 a 9,5. Každá vzorka sa potom rozdelila do troch častí. Jedna vzorka sa inkubovala pri teplote 5 °C, jedna pri teplote 30 °C a iná vzorka sa nechala pri teplote okolia.

Podmienky testov a dosiahnuté výsledky sú ukázané v tabuľke 11. Všetky koncentrácie sú nominálne.

276/B

Tabuľka 11

AQLys-Ne-Arg_ A21 GlyB29Lys 'Νε'ΑΓ9_ inzulín (mg/ml)	Zinok Yg/ml)	NaCI (mM)	NaOAc (mM)	Na2PO4 (mM)	pH	Teplota	Pozorované kryštály
2,4	25	0	100	21	6,5	5 °C	nie
2,4	25	0	0	21	7,5	5 °C	nie
2,4	25	0	100	21	8,4	5 °C	áno
2,4	100	0	100	21	6,3	5 °C	nie
2,4	100	0	100	21	7,4	5 °C	nie
2,4	100	0	100	21	8,6	5 °C	áno
2,4	25	50	75	21	6,6	5 °C	nie
2,4	25	50	75	21	7,4	5 °C	nie
2,4	25	50	75	21	8,4	5 °C	áno
2,4	100	50	75	21	6,5	5 °C	nie
2,4	100	50	75	21	7,5	5 °C	nie
2,4	100	50	75	21	8,3	5 °C	nie
2,4	25	0	100	21	6,5	okolie	nie
2,4	25	0	100	21	7,5	okolie	áno
2,4	25	0	100	21	8,4	okolie	áno
2,4	100	0	100	21	6,3	okolie	nie
2,4	100	0	100	21	7,4	okolie	nie
2,4	100	0	100	21	8,6	okolie	nie
2,4	25	50	75	21	6,6	okolie	nie
2,4	25	50	75	21	7,4	okolie	áno
2,4	25	50	75	21	8,4	okolie	áno
2,4	100	50	75	21	6,5	okolie	nie
2,4	100	50	75	21	7,5	okolie	nie
2,4	100	50	75	21	8,3	okolie	áno
2,4	25	0	100	21	6,5	30 °C	nie
2,4	25	0	100	21	7,5	30 °C	áno
2,4	25	0	100	21	8,4	30 °C	áno
2,4	100	0	100	21	6,3	30 °C	nie

276/B

2,4	100	0	100	21	7,4	30 °C	áno
2,4	100	0	100	21	8,6	30 °C	nie
2,4	25	50	75	21	6,6	30 °C	nie
2,4	25	50	75	21	7,4	30 °C	áno
2,4	25	50	75	21	8,4	30 °C	nie
2,4	100	50	75	21	6,5	30 °C	nie
2,4	100	50	75	21	7,5	30 °C	áno
2,4	100	50	75	21	8,3	30 °C	áno

V inom pokuse sa zásobný roztok oxidu zinočnatého pripravil zriedením 1,0 ml roztoku oxidu zinočnatého s koncentráciou 10 mg/ml 1,0 ml destilovanej vody. Konečná koncentrácia oxidu zinočnatého bola 5 mg/ml.

Zásobný roztok A0^Lys’^Ne'^Ar9-A21^GlyB29^Lys’^Ne’^Aľ9-inzulínu sa pripravil rozpustením 0,00221 g A0^Lys'^Ne'^Ar9-A21^GlyB29^Lys’^NE'^Ar9-inzulínu v 0,43 ml destilovanej vody. Roztok bol takmer číry a hodnota pH sa určila približne 3,7. pH sa upravilo na približne 3,0 kvôli dosiahnutiu číreho roztoku.

Kryštalizácia sa inicializovala najprv skombinovaním /\o^Lys’^Ní:'^Ar9A21^GlyB29^Lys'^NE'^Ar9-inzulínu s oxidom zinočnatým a zásobným roztokom buď chloridu sodného alebo citrátu sodného alebo octanu sodného. pH roztoku sa udržiavalo pod približne 3. Potom sa pridal zásobný roztok fosforečnanu sodného a vytvoril sa precipitát. Konečné pH sa upravilo na hodnotu medzi 6,5 a 8,5. Každá vzorka sa nechala pri teplote okolia. Podmienky testov a dosiahnuté výsledky sú ukázané v tabuľke 12. Všetky koncentrácie sú nominálne.

276/B

Tabuľka 12

AQLys-N£-Arg Α2Ί GiyB29Lys‘N£'Ar9_ inzulín (mg/ml)	Zinok (pg/ml)	NaCl (mM)	Na citrát (mM)	NaOAc (mM)	pH	Pozorované kryštály
2,6	300	0	0	0	6,7	nie
2,6	300	0	0	0	8,4	nie
2,6	300	100	0	0	8,3	nie
2,6	300	100	0	0	6,6	nie
2,6	300	0	100	0	6,6	áno
2,6	300	0	100	0	8,2	nie
2,6	300	0	0	100	6,5	áno
2,6	300	0	0	100	8,6	nie

Príklad 23

Kryštály zinok-A0^Lys‘^Ne'^Ar9-A21^GlyB29^Lys'^Ní:'^Aľ9-inzulín protamínu

Zásobný roztok A sa pripraví rozpustením 16,1 g syntetického glycerínu, 0,73 g fenolu a 1,6 ml m-krezolu v približne 350 ml destilovanej vody. Po rozpustení sa pridá do roztoku destilovaná voda na konečnú hmotnosť roztoku 503 g. Zásobný roztok protamín sulfátu sa pripraví rozpustením 0,0366 g protamín sulfátu v 10 ml destilovanej vody.

Zásobný roztok A0^Lys'^NE’^Ar9-A21^GlyB29^Lys'^Ns’^Ar9-inzulínu sa pripraví rozpustením 0,0121 g A0^Lys’^N£'^Ar9-A21^GlyB29^Lys’^NE'^Ar9-inzulínu v 1,28 ml zásobného roztoku A. Zásobný roztok oxidu zinočnatého sa pripraví riedením 1 ml roztoku oxidu zinočnatého s koncentráciou 25 mg/ml na konečný objem 25 ml, kvôli dosiahnutiu konečnej koncentrácie oxidu zinočnatého 1 mg/ml. Zásobný roztok fosforečnanu sodného sa pripraví rozpustením 0,0577 g dihydrogénfosforečnanu sodného v 15 ml destilovanej vody. Zásobný roztok chloridu sodného sa pripraví rozpustením 1,1607 g chloridu sodného v 10 ml

276/B destilovanej vody.

_A0Ly_S-N_E-Arg__A21Gl_yB29Lys-N_E-Arg__{jnzulín) Z|nočnat}ý p_rotamín SUÍfát, chlorid sodný a zásobný roztok A sa skombinujú na konečný objem 0,1 ml kvôli dosiahnutiu rôznych podmienok. Pridá sa 0,1 ml zásobného roztoku fosforečnanu sodného a vznikne precipitát. Konečné pH sa upraví na hodnotu medzi 7,4 a 9,3.

Každá vzorka sa potom rozdelí do dvoch častí. Jedna vzorka sa inkubuje pri teplote 30 °C a iná vzorka sa nechá pri teplote okolia. Testované podmienky sú ukázané v tabuľke 13, pozorovali sa kryštály.

276/B

Tabuľka 13

ÄQLys-N£-Arg_ A21 G,yg29LysNE'Ar9- inzulín (mg/ml)	Protamín sulfát (mg/ml)	Zinok (pg/ml)	NaCl (mM)	pH	Teplota
3,5	0	25	0	7,4	okolia
3,5	0	25	100	7,5	okolia
3,5	0	25	0	8,5	okolia
3,5	25	100	100	8,5	okolia
3,5	0	25	0	9,3	okolia
3,5	0	25	100	9,2	okolia
3,5	0,37	25	100	7,4	okolia
3,5	0,37	25	100	8,5	okolia
3,5	0,37	25	100	9,2	okolia
3,5	0	25	0	7,4	30 °C
3,5	0	25	100	7,5	30 ’C
3,5	25	0	0	8,5	30 °C
3,5	25	100	100	8,5	30 °C
3,5	0	25	0	9,3	30 ’C
3,5	0	25	100	9,2	30 ’C
3,5	0,37	25	100	7,4	30 ’C
3,5	0,37	25	100	8,5	30 ’C
3,5	0,37	25	100	9,2	30 ’C

Zatiaľ čo predložený vynález bol obzvlášť ukázaný a opísaný s odvolaním na jeho výhodné vyhotovenia, odborníkovi v odbore je zrejmé, že sa môžu vykonať rôzne zmeny vo vyhotovení a detailoch bez toho, aby sa odchýlilo od ducha a rozsahu predloženého vynálezu, ako je definovaný v nasledujúcich patentových nárokoch. Odborníkovi v odbore sú zrejmé alebo môže zistiť rutinným experimentovaním mnohé ekvivalentné špecifické

276/B vyhotovenia predloženého vynálezu, ktorý tu bol opísaný.

Tiež o ekvivalentoch sa predpokladá, že spadajú do rozsahu patentových nárokov.

Všetky patenty, prihlášky vynálezov, články, knihy a iné publikácie, ktoré sú tu citované, sú zahrnuté ako referencie vo svojej celistvosti.

276/B

Zoznam sekvencii

<110> <120> <130> <160> <170>

Eli Lilly and Company Inzulínová zlúčenina s protrahovaným účinkom X-16004M 4 Patentln verzia 3.1

<210> <211> <212> <213>	1 23 PRT Homo sapiens
<220> <221> <222> <223>	MISC FEATURE (D ... (D Xaa = Arg, derivatizovaný Arg, homoarginin, desamino homoarginin, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginin alebo alfa metyl arginín alebo je neprítomný

<220>

<221>	MISC	FEATURE
<222>	(2)	Γ.. (2)
<223>	Xaa	= Arg, derivatizovaný Arg, homoarginin, desamino
	homoarginin, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný
	Lys,	desaminolyzín, alfa guanidino homoarginin alebo
	alfa	metyl arginín
<220>
<221>	MISC	FEATURE
<222>	(23)’	... (23)
<223>	Xaa z	= geneticky kódovatelná aminokyselina
<400>	1
Xaa Xaa	Gly íle	Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr
1		5 10 15
Gin Leu	Glu Asn	Tyr Cys Xaa
	20
<210>	2
<211>	32
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<220>
<22 1>	MISC	FEATURE
<222>	(30)’	... (30)
<223>	Xaa	v polohe 30 je Lys alebo Xaa v polohe 31 je Lys,
	ale nie oboje naraz

<220>
<221>	MISC	FEATURE
<222>	(31)	'... (31

276/B

<223>	Xaa ale	v polohe 30 je Pro nie oboje naraz	alebo Xaa v polohe 31 je Pro,
<220>
<221>	MISC	FEATURE
<222>	(30)	... (30)
<223>	Xaa	= Lys alebo Pro
<220>
<221>	MISC	FEATURE
<222>	(31)	... (31)
<223>	Xaa	= Lys alebo Pro
<220>
<221>	MISC	FEATURE
<222>	(32)	... (32)
<223>	Xaa	= Thr, Ala alebo je	neprítomný
<220>
<221>	MISC	FEATURE
<222>	(D	.. · (D
<223>	Xaa	= Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino

homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný

	Lys, alfa	desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín alebo metyl arginin alebo je neprítomný
<220>
<221>	MISC	FEATURE
<222>	(2)	... (2)
<223>	Xaa	= Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino

homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný

	Lys, alfa	desaminolyzín, metyl arginin a]	alfa .ebo	guanidino homoarginín je neprítomný	alebo
<400>	2
Xaa Xaa	Phe Val	Asn Gin	His Leu	Cys	Gly	Ser His	Leu	Val	Glu	Ala
1		5			10				15
Leu Tyr	Leu Val	Cys Gly	Glu Arg	Gly	Phe	Phe Tyr	Thr	Xaa	Xaa	Xaa
	20			25				30
<210>	3
<211>	21
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	3
Gly íle	Val Glu	Gin Cys	Cys Thr	Ser	íle	Cys Ser	Leu	Tyr	Gin	Leu
1		5			10				15
Glu Asn	Tyr	Cys Asn
		20
<210>	4
<211>	30
<212>	PRT

276/B <213>

Homo sapiens

<400>

Phe Val

Leu Val

Asn Gin His Leu Cys

Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

15

Cys Gly Glu Arg Gly Phe

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

30

276/B

Claims (53)

1. Inzulínová zlúčenina, ktorá má:

(a) reťazec A všeobecného vzorca I,

A-1 AO Al A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 All A12 A13 Xaa-Xaa-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-LeuA14 A15 A16 Ά17 A18 A19 A20 A21 Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa, kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca I je znázornená ako Sekv. ID Č. 1, a (b) reťazec B všeobecného vzorca II,

B-1 BO BI B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 Bil B12 Xaa-Xaa-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Hi s-Leu-ValB13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-ThrB28 B29 B30

Xaa-Xaa-Xaa, kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca II je znázornená ako Sekv. ID č. 2, kde Xaa v polohe A-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe AO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín alebo alfa metyl arginín,

Xaa v polohe A21 je geneticky kódovatelná aminokyselina,

32 276/B y ó

Xaa v polohe B-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe BO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe B28 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B29 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B30 je Thr, Ala alebo je neprítomný, jeden z Xaa v polohe B28 alebo Xaa v polohe B29 je Lys,

Xaa v polohe B28 a Xaa v polohe B29 nie sú oba Lys, a ε-amino skupina Lys v polohe B28 alebo B29 je kovalentne viazaná k α-karboxylovej skupine kladne nabitej aminokyseliny kvôli príprave Lys-N^Eaminokyselinového derivátu.

2. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 1, kde ε-amino skupina Lys v polohe B28 alebo B29 je kovalentne viazaná k α-karboxylovej skupine Arg za účelom prípravy Lys-N^E-Arg.

3. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 1, kde ε-amino skupina Lys v polohe B28 alebo B29 je kovalentne viazaná k α-karboxylovej skupine Lys za účelom prípravy Lys-N^E-Ľys.

32 276/B

4. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 1, kde Xaa v polohe A-1 a Xaa v polohe B-1 sú neprítomné.

5. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 1, kde Xaa v polohe B-1 a Xaa v polohe BO sú neprítomné.

6. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 1, kde Xaa v polohe A-1, Xaa v polohe B-1 a Xaa v polohe BO sú neprítomné.

7. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 4, kde:

Xaa v polohe AO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín alebo alfa metyl arginín, a

Xaa v polohe BO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný.

8. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 7, kde:

Xaa v polohe AO je Arg, a

Xaa v polohe BO je neprítomný.

9. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 7, kde:

Xaa v polohe AO je Arg, a

Xaa v polohe BO je Arg.

32 276/B

9.5 A

10. Použitie inzulínovej zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 na prípravu liečiva na liečbu diabetes mellitus.

11. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje inzulínovú zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.

12. Kompozícia podľa nároku 11, vyznačujúca sa tým, že kompozícia je farmaceutická kompozícia.

13. Kompozícia podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že ďalej zahrňuje jeden alebo viacero farmaceutický prijateľných excipientov.

14. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, vyznačujúca sa tým, že ďalej zahrňuje divalentný kovový katión.

15. Kompozícia podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že divalentný kovový katión je zinok.

16. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14, vyznačujúca sa tým, že ďalej zahrňuje ľudský inzulín.

17. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje rýchlo účinkujúci inzulínový analóg.

18. Použitie kompozície podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 17 na prípravu liečiva na liečbu diabetes mellitus.

32 276/B //

19. Mikrokryštál zahrňujúci inzulínovú zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 a divalentný kovový katión, kde mikrokryštál neobsahuje protamín.

20. Mikrokryštál podľa nároku 19, kde divalentný kovový katión je zinok.

21. Mikrokryštál zahrňujúci inzulínovú zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 4, 6, 7, 8 alebo 9, divalentný kovový katión a protamín.

22. Mikrokryštál podľa nároku 19, kde divalentný kovový katión je zinok.

23. Spôsob prípravy mikrokryštálu podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje uvedenie do kontaktu zložiek zahrňujúcich inzulínovú zlúčeninu a divalentný kovový katión vo vodnom rozpúšťadle pri hodnote pH, ktorá umožňuje tvorbu hexamérov inzulínovej zlúčeniny.

24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že divalentný kovový katión je zinok.

25. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrňuje uvedenie do kontaktu zložiek s hexamér-stabilizujúcou zlúčeninou, pričom hexamér-stabilizujúca zlúčenina je prítomná v koncentrácii, ktorá uľahčuje vytváranie hexaméru.

26. Použitie mikrokryštálov podľa nároku 19 na prípravu liečiva na liečbu diabetes mellitus.

32 276/B ty l'í

27. Spôsob prípravy inzulínovej zlúčeniny, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kroky:

(a) acylácia každej voľnej amínovej skupiny templátu inzulínu chránenou aminokyselinou alebo derivátom chránenej aminokyseliny za účelom prípravy acylovanej inzulínovej zlúčeniny;

(b) čistenie acylovanej inzulínovej zlúčeniny;

(c) odstránenie ochrannej skupiny z každej chránenej aminokyseliny alebo derivátu chránenej aminokyseliny kvôli príprave nechránenej acylovanej inzulínovej zlúčeniny; a (d) čistenie nechránenej acylovanej inzulínovej zlúčeniny.

28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že chránená aminokyselina je aktivovaná karboxylová kyselina.

29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že aktivovaná karboxylová kyselina je N-hydroxysukcinimid.

30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že templátom inzulínu je rekombinantný ľudský inzulín alebo jeho analóg.

31. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že templátom inzulínu je A21^Xaa-inzulín.

32. Spôsob liečby hyperglykémie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie inzulínovej zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 subjektu v množstve, ktoré je dostatočné na reguláciu koncentrácie krvnej hladiny

32 276/B glukózy u subjektu.

33. Spôsob liečby hyperglykémie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie kompozície podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 17 subjektu v množstve, ktoré je dostatočné na reguláciu koncentrácie krvnej hladiny glukózy u subjektu.

34. Spôsob podľa nároku 32 alebo 33, vyznačujúci sa tým, že subjekt sa lieči na diabetes mellitus.

35. Spôsob liečby diabetes mellitus, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie mikrokryštálu podľa nároku 19 subjektu v množstve, ktoré je dostatočné na reguláciu koncentrácie krvnej hladiny glukózy u subjektu.

36. Inzulínová zlúčenina, ktorá obsahuje:

(a) reťazec A všeobecného vzorca I,

A-l AO Al A2 A3 A4 A5 Ά6 A7 A8 A9 A10 All A12 A13 Xaa-Xaa-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-LeuA14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa, kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca I je znázornená v Sekv. ID č. 1, a (b) reťazec B všeobecného vzorca II,

B-l BO BI B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 Bil B12 Xaa-Xaa-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-ValB13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-ThrB28 B29 B30

Xaa-Xaa-Xaa,

32 276/B kde aminokyselinová sekvencia všeobecného vzorca II je znázornená v Sekv. ID č. 2, kde Xaa v polohe A-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe AO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín,

Xaa v polohe A21 je geneticky kódovatelná aminokyselina,

Xaa v polohe B-1 predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín alebo je neprítomný,

Xaa v polohe BO predstavuje Arg, derivatizovaný Arg, homoarginín, desamino homoarginín, desaminoarginín, Lys, derivatizovaný Lys, desaminolyzín, alfa guanidino homoarginín, alfa metyl arginín;

Xaa v polohe B28 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B29 je Lys alebo Pro,

Xaa v polohe B30 je Thr, Ala alebo je neprítomný, jeden z Xaa v polohe B28 alebo Xaa v polohe B29 je Lys, a

Xaa v polohe B28 a Xaa v polohe B29 nie sú oba Lys.

37. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 36, kde:

Xaa v polohe A-1 je neprítomný, a

Xaa v polohe B-1 je neprítomný.

32 276/B we-

38. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 37, kde:

Xaa v polohe AO je Arg alebo Lys, a

Xaa v polohe BO je Arg alebo Lys.

39. Inzulínová zlúčenina podľa nároku 38, kde:

Xaa v polohe AO je Arg a

Xaa v polohe BO je Arg.

40. Mikrokryštál zahrňujúci inzulínovú zlúčeninu podľa nároku 36 a divalentný katión.

41. Mikrokryštál podľa nároku 40, kde divalentný kovový katión je zinok.

42. Mikrokryštál podľa nároku 40 alebo 41, ďalej zahrňujúci protamín.

43. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje inzulínovú zlúčeninu podľa nároku 36.

44. Kompozícia podľa nároku 43, vyznačujúca sa tým, že ďalej zahrňuje divalentný kovový katión.

45. Kompozícia podľa nároku 44, vyznačujúca sa tým, že divalentný kovový katión je zinok.

46. Kompozícia podľa nároku 44, vyznačujúca sa tým, že kompozícia je farmaceutická kompozícia.

32 276/B

X

47. Kompozícia podľa nároku 46, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje farmaceutický prijateľný nosič.

48. Použitie inzulínovej zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 36 až 39 na prípravu liečiva na liečbu diabetes mellitus.

49. Použitie kompozície podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 47 na prípravu liečiva na liečbu diabetes mellitus.

50. Spôsob liečby hyperglykémie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie inzulínovej zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 36 až 39 subjektu v množstve, ktoré je dostatočné na reguláciu koncentrácie krvnej hladiny glukózy u subjektu.

51. Spôsob liečby hyperglykémie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie kompozície podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 47 subjektu v množstve, ktoré je dostatočné na reguláciu koncentrácie krvnej hladiny glukózy u subjektu.

52. Spôsob podľa nároku 50 alebo 51, vyznačujúci sa tým, že subjekt sa lieči na diabetes mellitus.

53. Spôsob liečby diabetes mellitus, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie mikrokryštálu podľa nárokov 40 až 42 subjektu v množstve, ktoré je dostatočné na reguláciu koncentrácie krvnej hladiny glukózy u subjektu.