PT2464655T

PT2464655T - Processos cromatográficos

Info

Publication number: PT2464655T
Application number: PT108080359T
Authority: PT
Inventors: Dave Nitesh; Chaitanya Gulla Krishana; Shankar Sundaresh; Iyer Harish
Original assignee: Biocon Ltd
Priority date: 2009-08-11
Filing date: 2010-08-09
Publication date: 2017-05-25
Also published as: JP6169354B2; ES2625125T3; MX2012001824A; MY186089A; CN102471368A; MX346473B; BR112012002934A2; BR112012002934B1; IL217999A0; EP2464655A4; KR20120055653A; WO2011018745A1; US20120178900A1; SG178306A1; RU2508294C2; RU2012108039A; IL217999B; EP2464655A1; EP2464655B1; JP2013501773A

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS CAMPO DA TÉCNICA: A presente divulgação demonstra a utilidade de agentes de emparelhamento de iões à escala preparativa de purificação. Mais particularmente, a divulgação refere-se à utilização de agentes de emparelhamento de iões em cromatograf ia preparativa de fase reversa permitindo pureza elevada do produto final desejado. A divulgação mostra que os agentes de emparelhamento de iões têm um efeito dramático sobre a pureza desejada dos polipéptidos. ANTECEDENTES E TÉCNICA ANTERIOR DA DIVULGAÇÃO: São aplicados uma série de procedimentos cromatogrãficos para obter o resultado final desejado relativamente à pureza e ao rendimento. A cromatograf ia de fase reversa é um dos métodos mais poderosos de purificação empregues. São habitualmente utilizadas cromatograf ia líquida de fase reversa (™RP-LC™) e cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (™RP-HPLC™) para purificar moléculas tais como péptidos e proteínas, produzidos através de métodos ou sintéticos ou recombinantes. Os métodos de RP-LC e RP-HPLC podem separar eficazmente impurezas estreitamente relacionadas e têm sido utilizados para purificar várias moléculas diversas (Lee et al., ™Preparative HPLC,™ 8th Biotechnology Symposium, Pt. 1.593-610 (1988)) .

Adicionalmente, RP-LC e RP-HPLC têm sido utilizadas exitosamente para purificar moléculas, particularmente; proteínas a uma escala industrial (Olsen et al., 1994, J. Chromatog. A, 675, 101). A utilização de agentes de emparelhamento de iões tais como trietilamina (TEA), Ácido trifluoroacético (TFA), Ácido hexanos sul fónico (HSA) no desenvolvimento do método analítico e o seu efeito sobre a resolução de pico de proteínas é bem-conhecida (Shayne Cox Gad; Handbook of Pharmaceutical Biotechnology) . Um agente de emparelhamento de iões é adsorvido até à fase estacionária por meio da sua cadeia de hidrocarboneto criando uma camada elétrica dupla que impõe um potencial elétrico sobre a superfície da fase estacionária. Devido a isto, As moléculas de proteína/péptido experimentam tanto permuta iónica com os iões de eletrolito da fase móvel como também o efeito de adsorção com a fase estacionária da fase reversa (Frederick F. Cantwell et al., 1984, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 2, Páginas 153-164). Gusarov et al (J. Chromatog. B; 877(2009), págs.1216-1220) descrevem a utilização de ácido acético e etanol na purificação da insulina. A presente divulgação demonstra a utilidade de agentes de emparelhamento de iões à escala preparativa de purificação de proteínas e péptidos.

Mais especificamente esta divulgação refere-se à utilização de HSA e TEA em cromatografia linear preparativa RP-HPLC.

Os agentes de emparelhamento de iões utilizados em RP-HPLC contêm essencialmente cadeias de hidrocarboneto longas com um grupo ionizável. Estas moléculas, no par iónico da fase móvel com as cargas de superfície da proteína/péptido. Devido a este emparelhamento, a hidrofobicidade do péptido/proteína aumenta, o que é atribuído à cadeia de hidrocarboneto do agente de emparelhamento de iões. Esta interação depende das cargas de superfície. Diferentes proteínas de uma mistura têm diferentes cargas de superfície, e como tal, ligam de forma diferente à fase estacionária, o que melhora a resolução entre os picos de proteína. Os agentes de emparelhamento de iões adsorvidos atribuem uma carga específica ao seu grupo funcional na superfície da fase estacionária. Isto repele as cargas semelhantes, consequentemente, alterando a seletividade de várias proteínas numa mistura.

Foi observado em cromatografia convencional que à medida que a carga aumenta na coluna a resolução diminui entre as impurezas e a proteína de interesse desejada. As bandas proteicas durante a eluição tendem a convergir afetando o desempenho da cromatografia em termos de pureza da preparação e rendimento. A presente divulgação evita este problema, o que é uma chave para a capacidade de fabrico de proteínas. A maior carga 11a coluna para além da proteína injetada na coluna para deteção analítica, é crucial para o desenvolvimento do processo e dita o custo e rendimento de um determinado processo. A presente divulgação mostra que os agentes de emparelhamento iónico têm efeito dramático na pureza das proteínas inclusive após a carga proteica ter sido aumentada. Apresente divulgação demonstra a utilização do emparelhamento iónico na melhoria do rendimento da etapa cromatográfica.

OBJETIVOS DA DIVULGAÇÃO 0 principal objetivo da presente divulgação é obter um processo cromatográfico para a purificação de polipéptidos a partir de uma mistura.

Outro principal objetivo da presente divulgação é obter, um análogo de insulina tal como Aspart, Glargine e Lispro.

Ainda outro principal objetivo da presente divulgação é obter polipéptidos purificados tais como Atosiban e Eptifibatide.

SUMARIO DA DIVULGAÇÃO

Consequentemente, a presente divulgação refere-se a um processo cromatográfico para a purificação de polipéptidos a partir de uma mistura tendo pelo menos uma impureza relacionada, o dito processo compreendendo a etapa de empregar RP-HPLC com um agente de emparelhamento de iões tendo uma concentração variando desde cerca de 0,01% até cerca de 2% em combinação com um modificador orgânico tendo uma concentração variando desde cerca de 5% até cerca de 85%; um processo cromatográfico para a purificação de polipéptidos a partir de uma mistura tendo pelo menos uma impureza relacionada, o dito processo compreendendo as etapas de a) preencher uma coluna de

RP-HPLC com resina à base de sílica (C4-Ci8) , equilibrada com modificador orgânico a cerca de 5% até cerca de 85%, b) carregar a mistura de polipéptidos na coluna a uma taxa de fluxo de cerca de 180 cm/h a cerca de 360 cm/h, c) lavar a coluna com um agente de emparelhamento de iões tendo uma concentração variando desde cerca de 0,05% até cerca de 1% em combinação com o modificador orgânico tendo uma concentração variando desde cerca de 5% até cerca de 85%, e d) realizar um gradiente linear de cerca de 10% até cerca de 70% para eluir o polipéptido purificado a partir da coluna; um análogo de insulina obtido através de um processo conforme estabelecido acima com pureza variando desde cerca de 90% até cerca de 100%; Aspart purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 98%; Glargine purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 99%; Lispro purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 97%; um polipéptido obtido através de um processo conforme estabelecido acima com pureza variando desde cerca de 90% até cerca de 100%, Atosiban purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 99,14%; e Eptifibatide purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 94%. DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO A presente divulgação refere-se a um processo cromatográfico para a purificação de polipéptidos a partir de uma mistura tendo pelo menos uma impureza relacionada, o dito processo compreendendo a etapa de empregar RP-HPLC com um agente de emparelhamento de iões tendo uma concentração variando desde cerca de 0,01% até cerca de 2% em combinação com um modificador orgânico tendo uma concentração variando desde cerca de 5% até cerca de 85%.

Num forma de realização da presente divulgação mais preferentemente o agente de emparelhamento de iões e o modificador orgânico têm uma concentração variando desde cerca de 0,05% até cerca de 1% e desde cerca de 8% até cerca de 65% respetivamente.

Noutra forma de realização da presente divulgação o agente de emparelhamento de iões é selecionado a partir de um grupo compreendendo ácido hexanossulfónico, ácido trif luoroacético, ácido pentafluoropropanoico, trietilamina e ácido heptafluorobutírico.

Ainda noutra forma de realização da presente divulgação o modificador orgânico é selecionado a partir de um grupo compreendendo acetonitrilo, etanol, metanol e álcool isopropílico.

Ainda noutra forma de realização da presente divulgação o polipéptido é selecionado a partir de um grupo compreendendo, análogo de insulina, Eptifibatide e Atosiban.

Ainda noutra forma de realização da presente divulgação os análogos de insulina são Aspart, Lispro e Glargine. A presente divulgação também se refere a um processo cromatogrãfico para a purificação de polipéptidos a partir de uma mistura tendo pelo menos uma impureza relacionada, o dito processo compreendendo as etapas de: a) preencher uma coluna de RP-HPLC com resina à base de sílica (C4-Ci8) , equilibrada com modificador orgânico a cerca de 5% até cerca de 85%, b) carregar a mistura de polipéptidos na coluna a uma taxa de fluxo de cerca de 180 cm/h a cerca de 360 cm/h, c) lavar a coluna com um agente de emparelhamento de iões tendo uma concentração variando desde cerca de 0,05% até cerca de 1% em combinação com o modificador orgânico tendo uma concentração variando desde cerca de 5% até cerca de 85%, e d) realizar um gradiente linear de cerca de 10% até cerca de 70% para eluir o polipéptido purificado a partir da coluna.

Numa forma de realização da presente divulgação a resina de sílica é preferentemente C8,

Noutra forma de realização da presente divulgação a purificação cromatográfica é levada a cabo a um pH variando desde cerca de 2,5 até cerca de 8,5.

Ainda noutra forma de realização da presente divulgação a resina tem um tamanho de partícula variando desde cerca de 5μ até cerca de 40μ, preferentemente, desde cerca de 7μ até cerca de 20μ, e mais preferentemente desde cerca de 10μ até cerca de 13μ.

Ainda noutra forma de realização da presente divulgação a microsfera de resina tem um tamanho de poro variando desde cerca de 50Ã até cerca de 2000À, preferentemente desde cerca de 100À até cerca de 500Ã, e mais preferentemente 120Â.

Ainda noutra forma de realização da presente divulgação a pureza do polipéptido varia desde cerca de 90% até cerca de 100%, preferentemente pelo menos 99%. A presente divulgação refere-se adicionalmente a um análogo de insulina obtido através de um processo conforme estabelecido acima com pureza variando desde cerca de 90% até cerca de 100%. A presente divulgação também se refere a Aspart purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 98%. A presente divulgação também se refere a Glargine purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 99%. A presente divulgação também se refere a Lispro purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 97%. A presente divulgação também se refere a um polipéptido purificado obtido através de um processo conforme estabelecido acima com pureza variando desde cerca de 90% até cerca de 100%. A presente divulgação também se refere a Atosiban purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 99,14%. A presente divulgação também se refere a Eptifibatide purificado, purificado com uma pureza de pelo menos 94%. A divulgação refere-se à utilização de agentes de emparelhamento de iões tais como trietilamina, ácido trifluoroacético, ácido hexanossulfónico, ácido pentafluoropropanoico, etc. em cromatografia linear preparativa RP-HPLC de polipéptidos. Mais especificamente a divulgação refere-se à utilização de agentes de emparelhamento de iões através de cromatografia linear preparativa de fase reversa de análogos de insulina e péptidos.

Outro objeto e vantagem da presente divulgação é a pureza aumentada da proteína desejada inclusive após a carga de proteína ter sido aumentada. 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações. DEFINIÇÃO DE TERMOS: A menos que definido de outra forma no presente documento, os termos científicos e técnicos utilizados em relação à presente divulgação destinam-se a ter os significados que são habitualmente entendidos pelos peritos na especialidade. Adicionalmente, a menos que requerido de outra forma por contexto, os termos singulares destinam-se a inclui pluralidades e os termos plurais deverão incluir os singulares. Os métodos e técnicas da presente divulgação são geralmente desempenhados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica. 0 termo "polipéptido", "proteína", "péptido" refere-se a um polímero de aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto; consequentemente, os péptidos, oligopéptidos, e proteínas estão incluídos dentro da definição de polipéptido. Este termo também não se refere a ou exclui modificações pós-expressão do polipéptido embora possam ser incluídas ou excluídas modificações químicas ou pós-expressão destes polipéptidos como formas de realização específicas. Como tal, por exemplo, as modificações de polipéptidos que incluem a união covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos e semelhantes são expressamente abrangidos pelo termo polipéptido. Adicionalmente, polipéptidos com estas modificações podem ser especificados como espécies individuais a ser incluídas ou excluídas da presente divulgação. Numa forma de realização, a molécula é um polipéptido ou os seus análogos relacionados ou derivados do mesmo. De acordo com uma forma de realização preferida, o polipéptido é selecionado a partir de análogos de insulina tais como Aspart, Lispro e Glargine. Preferentemente, o polipéptido é um péptido cíclico. De acordo com outra forma de realização preferida, o polipéptido é um péptido não cíclico. Ainda noutra forma de realização preferida, o polipéptido é selecionado a partir do grupo compreendendo eptifibatide, e, atosiban. 0 termo "análogo de insulina" destina-se a abranger qualquer forma de "insulina" conforme definido acima em que um ou mais dos atninoãcidos dentro da cadeia do polipéptido foi substituído com um aminoãcido alternativo e/ou em que um ou mais dos aminoácidos foi eliminado ou em que um ou mais aminoácidos adicionais foram adicionados a cadeia do polipéptido. 0 análogo de insulina é selecionado a partir do grupo compreendendo Aspart, Lispro e Glargine. A insulina Aspart é um análogo que é um agente de ação rápida, de redução de glucose em sangue parentérico. Aspart é homólogo com a insulina humana regular com a exceção de uma única substituição do aminoãcido prolina por ácido aspártico na posição B28, e é produzido através de tecnologia de ADN recombinante. A insulina Glargine diferente da insulina humana em que o aminoácido asparagina na posição 21 na cadeia A da insulina é substituído por glicina e são adicionadas duas argininas ao terminal C da cadeia B. A insulina Glargine é também um análogo da insulina humana que é um agente de ação rápida, de redução de glucose em sangue parentérico. A insulina Lispro é um análogo que é um agente de ação rápida, de redução de glucose em sangue parentérico. Quimicamente, é um análogo de insulina humana Lys (B28), Pro (B29), criado quando os aminoácidos nas posições 28 e 29 na cadeia B da insulina são revertidos.

Atosiban- um péptido sintético é um inibidor das hormonas oxitocina e vasopressina. É um antagonista do recetor da oxitocina, é eficaz no tratamento de um episódio agudo de trabalho de parto prematuro. É um antagonista competitivo da oxitocina nos recetores de oxitocina uterinos e foi desenvolvido como uma nova terapêutica tocolítica no tratamento do trabalho de parto prematuro. Atosiban também denominado ADH (Hormona Anti Diurética).

Eptifibatide- é um fármaco anti plaquetas da classe de inibidores de glicoproteína Ilb/lIIa. É um heptapéptido cíclico derivado a partir de uma proteína encontrada no veneno da cascavel pigmeia do sudeste. Pertence à classe dos denominados miméticos de arginina-glicina-aspartato e liga de forma reversível às plaquetas. 0 termo "cromatografia" refere-se ao processo através do qual um analito de interesse numa mistura é separado a partir de outros solutos numa mistura como resultado de diferenças nas taxas às quais os solutos individuais da mistura migram através de uma fase estacionária sob a influência de uma fase móvel, ou em processos de ligação e eluição. 0 termo "cromatografia líquida de alto desempenho", conforme utilizado no presente documento, refere-se ao procedimento cromatográfico no qual as partículas (fase estacionária) utilizadas no preenchimento da coluna são pequenas (entre 3 e 50 micra) e regulares com pouca variação a partir do tamanho selecionado. Tal cromatografia emprega tipicamente pressões relativamente elevadas (por volta de 500-3500 psi). 0 termo "impureza" refere-se a qualquer produto que não partilha a mesma natureza que a proteína de interesse. As impurezas estão principalmente relacionadas com o produto. A impureza que foi visada na insulina Aspart em bruto utilizando agentes de emparelhamento de iões foi o precursor de insulina Aspart Des líder des B arginina. Isto difere da insulina Aspart ao possuir uma extensão de 5 aminoácidos no terminal C da cadeia B, os 5 aminoácidos sendo Arg-Asp-Ala-Asp-Asp, o que mostra que a um pH ácido tem uma carga positiva extra em relação a Aspart. "Agentes de emparelhamento de iões" são habitualmente compostos iónicos que formam pares iónicos com iões com carga oposta. Habitualmente os agentes de emparelhamento de iões utilizados em RP-HPLC contêm uma cadena e hidrocarboneto que atribui determinada hidrofobicidade de modo a que os agentes de emparelhamento de iões possam ser retidos numa coluna de fase reversa. Podem ser utilizados agentes de emparelhamento de iões capazes de formar pares iónicos com proteínas na presente divulgação que podem incluir ácido trifluoroacético (TFA), ácido hexanos sulfónico (HSA), ácido pentafluoropropanoico (PFPA), trietilamina (TEA), ácido heptafluorobutírico (HFBA), etc.

Os agentes de emparelhamento de iões são definidos nas reivindicações.

Especificamente esta divulgação refere-se à utilização de HSA e TEA em cromatografia linear preparativa RP-HPLC conforme exemplificado nas formas de realização preferidas. HSA tem uma estrutura composta por uma cadeia de hidrocarboneto de 6C de comprimento com um grupo funcional de ácido sulfónico (S03-) . A pH ácido, essencialmente por debaixo do valor de pi se um péptido/proteína, todos os grupos amino funcionais dos aminoácidos básicos tais como lisina, arginina e histidina presentes na superfície da estrutura proteica teriam carga positiva devido a protonação. 0 grupo S03- de HSA existe na forma iõnica inclusive a pH baixo devido à elevada densidade eletrónica nos átomos 0- que é atribuída ao efeito indutor mostrado pela cadeia lateral de hidrocarboneto de 6-C de comprimento. 0 grupo S03- visaria especif icamente os grupos com carga positiva na estrutura proteica. Esta interação entre HSA e o péptido originaria uma alteração conformacional minúscula e reversível na estrutura 3D da proteína. Isto originaria algumas vezes uma alteração da seletividade de algumas impurezas durante a cromatograf ia RP. HSA é muito bem conhecido por melhorar a resolução dos picos de proteína na cromatograf ia RP analítica. Enquanto na presente divulgação, foi observado que HSA auxilia também na melhoria dos rendimentos e níveis de pureza em cromatografia preparativa.

Trietilamina (TEA) como um agente de emparelhamento de iões bem-conhecido elui a proteína na forma de bandas coesas e esta propriedade é atualmente empregue em carga mais elevado (carga preparatória) para melhorar os rendimentos e a pureza da cromatografia RP. "Modificadores orgânicos" são solventes apoiares que são utilizados em cromatografia RP que a menores concentrações assistem as moléculas de analito na ligação à fase estacionária e a concentrações mais elevadas eluem as mesmas. São utilizados vários modificadores orgânicos na presente divulgação como acetonitrilo, álcool isopropílico, etanol, metanol, dimetilformamida, etc.

Os modificadores orgânicos de iões são definidos nas reivindicações. "Desocta" é uma impureza relacionada com o produto que é gerada durante a etapa de tripsinização do processo. É caracterizado por carecer de 8 aminoácido em direção ao terminal C da cadeia B da insula e dos seus análogos. 0.85RRT, 0.9RRT, 1.05RRT e 1.07RRT são impurezas relacionadas com produto que são geradas durante os intermediários de reação; alguns são gerados durante o processo. Estas impurezas são formadas devido a várias etapas de reação envolvidas no processo de preparação de Atosiban. 0.86RRT, 1.22RRT, 1.8RRT e 2.1RRT são impurezas formadas devido a múltiplas etapas de reação envolvidas no processo de preparação de eptifibatide. São tipicamente intermediários de reação e alguns são gerados durante o processo. Podem existir intermediários que têm grupos protegidos que os previnem de ser convertidos no produto. A presente divulgação refere-se à utilização de agentes de emparelhamento de iões para obter análogos de insulina substancialmente puros e péptido no intervalo de 90%-100%. Os análogos de insulina podem ser selecionados a partir de um grupo compreendendo Aspart, Lispro e Glargine. A proteína ou péptido é Atosiban e eptifibatide. É um objeto da presente divulgação utilizar pelo menos 0,05% a 1% (p/v) de um agente de emparelhamento de iões em que o processo seja baseado em RP-HPLC. Mais preferentemente é utilizado um agente de emparelhamento de iões no intervalo de 0,0 5 % -1% (p/v) .

Num aspeto amplo, a presente divulgação refere-se à utilização de emparelhamento de iões sendo utilizado para purificar uma proteína de interesse compreendendo as etapas de: Equilíbrio para manter a fase estacionária pronta para ligar ao analito de interesse, seguido por carregamento em que o material em bruto ou impuro contendo o analito é passado através da fase estacionária. A amostra é carregada a uma taxa de fluxo de cerca de 180-360 cm/h. Os gradientes utilizados estão submetidos a variação em relação ao péptido da amostra a ser purificada. A primeira etapa do processo no presente documento envolve purificar moléculas a partir de misturas contendo as mesmas através de carregamento das misturas numa coluna de cromatografia líquida de fase reversa. Preferentemente, a coluna é preenchida com um meio tendo um diâmetro de partículas de cerca de 5-40 μ, mais preferentemente cerca de 10-40 μ, e mais preferentemente ainda cerca de 10-13 μ. Preferentemente, a coluna tem um tamanho de poro de cerca de 100-2000 angstrom, mais preferentemente cerca de 100-500 angstrom. No contexto da presente divulgação o tamanho de poro da resina preenchida na coluna é 120 angstrom.

Isto é seguido por lavagem para remover as moléculas não ligadas, eluição do analito ligado a partir da fase estacionária e regeneração para remover quaisquer moléculas ligadas que não eluem com as condições de eluição dadas. São utilizados vários modificadores orgânicos a 5%-65% para equilíbrio e lavagem tais como acetonitrilo, álcool isopropílico, etanol, metanol, dimetilformamida, etc. A purificação é levada a cabo a um pH no intervalo de 2,5-8,5. 0 meio da coluna pode ser qualquer material adequado, incluindo meios de resina à base de polímeros, meios à base de sílica ou meios de metacrilato.

Um aspeto da presente divulgação reside na utilização de agentes de emparelhamento de iões em cromatografia linear preparativa RP-HPLC para obter proteínas e péptidos substancialmente puros. Podem ser utilizados agentes de emparelhamento de iões capazes de formar pares iónicos com proteínas na presente divulgação que podem incluir ácido trifluoroacético (TFA), ácido hexanossulfõnico (HSA), ácido pentafluoropropanoico (PFPA), trietilamina (TEA), ácido heptafluorobutírico (HFBA), ácido heptafluorobutírico (HFBA), etc.

Especificamente esta divulgação refere-se à utilização de HSA e TEA em cromatografia linear preparativa RP conforme exemp 1 if icado nas formas de realização preferidas . HSA tem uma estrutura composta por uma cadeia de hidrocarboneto de 6C de comprimento com um grupo funcional de ácido sulfónico (S03-) . A pH ácido, essencialmente por debaixo do valor de pi se um péptido/proteína, todos os grupos amino funcionais dos aminoácidos básicos tais como lisina, arginina e histidina presentes na superfície da estrutura proteica teriam carga positiva devido a protonação. 0 grupo S03- visaria especificamente os grupos com carga positiva na estrutura proteica. Dado que HSA interatua com as cargas de superfície, o grupo hexilo de HSA estaria exposto na superfície da proteína, o que aumentaria a sua hidrofobicidade. A extensão da interação de HSA com vários péptidos originaria uma alteração na sua seletividade. HSA é muito bem conhecido por melhorar a resolução dos picos de proteína na cromatograf ia RP analítica. Enquanto na presente divulgação, foi observado que HSA auxilia também na melhoria dos rendimentos e níveis de pureza em cromatograf ia preparativa.

Trietilamina (TEA) também funciona de uma forma semelhante a HSA, o ião TEA é emparelhado com as frações com carga negativa da superfície proteica e aumenta a hidrofobicidade das proteínas.

Outro objeto da presente divulgação refere-se à utilização de um agente de emparelhamento de iões que auxiliou na alteração da seletividade de uma impureza que está muito estreitamente relacionada com a proteína de interesse e era um problema principal na purificação.

As impurezas estão principalmente relacionadas com o produto. A impureza que foi visada na insulina Aspart em bruto utilizando agentes de emparelhamento de iões foi o precursor de insulina Aspart Des líder des B arginina. Isto difere da insulina Aspart ao possuir uma extensão de 5 aminoãcidos no terminal C da cadeia B, os 5 aminoácidos sendo Arg-Asp-Ala-Asp-Asp, o que mostra que a um pH ácido tem uma carga positiva extra em relação a Aspart, o que seria um alvo para HSA. Na insulina Glargine, HSA auxilia na separação do precursor de insulina Glargine dado que possui mais cargas positivas do que as da insulina Glargine.

Ainda outro aspeto da presente divulgação é a pureza aumentada da proteína desejada inclusive após a carga de proteína ter sido aumentada. 0 desempenho eficaz da presente divulgação requer a individuação da combinação correta da matriz cromatográfica a ser utilizada, do valor de pH e da força iónica do tampão para purificações eficazes. 0 pH do sistema de tampão influencia a separação em combinação com a hidrofobicidade dos compostos. A alteração do pH atribuído durante diferentes etapas de separação por cromatografia, afeta a mobilidade dos compostos na coluna.

As descrições anteriores de formas de realização específicas da presente divulgação são apresentadas para propósitos de ilustração e descrição. Não se destinam a ser exaustivas ou a limitar a divulgação às formas precisas divulgadas. São possíveis várias modificações e variações em vista dos ensinamentos acima. Adicionalmente, podem ser realizadas várias modificações para adaptar uma situação, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapas de processo particulares, ao objetivo, espírito e âmbito da presente divulgação. Todas tais modificações destinam-se a estar dentro do âmbito das reivindicações anexas ao presente documento. A tecnologia da presente memória descritiva é adicionalmente elaborada com a ajuda dos seguintes exemplos.

Os seguintes exemplos são proporcionados para ilustrar adicionalmente as formas de realização da presente divulgação, mas não se destinam a limitar o âmbito da divulgação. Embora sejam típicos daqueles que podem ser utilizados, podem alternativamente ser utilizados outros procedimentos, metodologias, ou técnicas conhecidas para os peritos na especialidade.

Pode ser obtido um entendimento mais completo por referência aos seguintes exemplos específicos, que são proporcionados somente para propósitos de ilustração e não se destinam a limitar o âmbito da divulgação. EXEMPLOS:

Controlo 1

Foi diluído material de insulina Aspart em bruto de pureza de -75% 10 vezes com água purificada e foi adicionado IPA até uma concentração final de 5%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi acetato de sódio a 250 mM, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool isopropílico. Um gradiente de eluição de 15% a 18% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 2 0 volumes de coluna. Foi observada separação de desocta de insulina Aspart mas não foi alcançada separação do precursor de insulina Aspart des líder desB-arginina. A pureza global alcançou -90%. EXEMPLO 1

Foi diluído material de insulina Aspart em bruto de pureza de -75% 10 vezes com água purificada e foi adicionado IPA até uma concentração final de 5%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Ã -13 μ -C8) . A fase móvel A foi ácido hexanos sul fónico (HSA) a 1% (p/v) em acetato de sódio a 250 mM, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool isopropí lico. Um gradiente de eluição de 18%-22% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 20 volumes de coluna. A adição de HSA removeu eficazmente desocta de insulina Aspart e também ocorreu redução do precursor de insulina Aspart des líder desB-arginina a partir de um nível de -2,77% até menos de 0,27% e a pureza global alcançada é de -97,85%.

Controlo 2

Foi diluído material de insulina Aspart em bruto de pureza de -75% 10 vezes com água purificada e foi adicionado álcool etílico até uma concentração final de 10%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Ã -13 μ -C8) . A fase móvel A foi sulfato de amónio a 25 mM em acetato de sódio a 250 mM, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool etílico. Um gradiente de eluição de 26%-32% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 20 volumes de coluna. 0 precursor de insulina Aspart des líder desB-arginina foi reduzido a partir de um nível de -2% até 1%. A impureza desocta da insulina Aspart foi removida completamente e a insulina Aspart monoglicosilada foi reduzida desde -3% até 1,3%. A pureza global alcançada é de -94% EXEMPLO 2

Foi diluído material de insulina Aspart em bruto de pureza de -75% 10 vezes com água purificada e foi adicionado álcool etílico até uma concentração final de 10%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Á -13 μ -C8) . A fase móvel A foi ácido hexanossulfónico (HSA) a 1% (p/v) em sulfato de amónio a 25 mM em acetato de sódio a 250 mM, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool etílico. Um gradiente de eluição de 25%-35% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 20 volumes de coluna. A adição de HSA reduziu o precursor de insulina Aspart des líder desB-arginina a partir de um nível de -3% até menos de 0,3%. A desocta da insulina Aspart foi completamente removida e os níveis de insulina Aspart monoglicosilada foram reduzidos desde -2% até 0,3%. A pureza global alcançada é de -98% Controlo 3

Foi diluído material de insulina Aspart em bruto de pureza de -67% 10 vezes com água purificada e foi adicionado álcool metílico até uma concentração final de 10%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Ã -13 μ -C8) . A fase móvel A foi sulfato de amónio a 25 mM em acetato de amónio a 250 mM, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metílico. Um gradiente de eluição de 45%-55% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 20 volumes de coluna. 0 precursor de insulina Aspart des líder desB-arginina foi reduzido a partir de um nível de ~2% até menos de 1%. A impureza da insulina Aspart monoglicosilada não mostrou qualquer redução significativa. A redução foi de 2% a 1,5%. A desocta da insulina Aspart foi reduzida desde ~10% até menos de -2%. A pureza global alcançada é de ~89% EXEMPLO 3

Foi diluído material de insulina Aspart em bruto de pureza de ~67% 10 vezes com água purificada e foi adicionado álcool metílico até uma concentração final de 10%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Á -13 μ -C8) . A fase móvel A foi ácido hexanossulfónico (HSA) a 1% (p/v) em sulfato de amónio a 25 mM em acetato de amónio a 250 mM, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metílico. Um gradiente de eluição de 55%-65% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 20 volumes de coluna. A adição de HSA purificou o precursor de insulina Aspart des líder desB-arginina a partir de um nível de ~2% até menos de 1%. A impureza da insulina Aspart monoglicosilada foi reduzida desde 3% até menos de 0,5%. A desocta da insulina Aspart foi reduzida desde -10% até menos de -2%. A pureza global alcançada é de -92% EXEMPLO 4

Foi diluído material de insulina Aspart em bruto de pureza de -67% 10 vezes com água purificada e foi adicionado álcool metílico até uma concentração final de 10%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Â -13 μ -C8) . A fase móvel A foi ácido hexanossulfónico (HSA) a 1% (p/v) em sulfato de amónio a 25 mM em acetato de amónio a 250mM, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metílico. Um gradiente de eluição de 20%-50% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 5 volumes de coluna seguido por 55%-65% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 20 volumes de coluna. A adição de HSA purificou o precursor de insulina Aspart des líder desB-arginina a partir de um nível de ~2% até menos de 1 % e impureza monoglicosilada desde ~3% até 0,6%. A desocta da insulina Aspart foi reduzida desde ~10% até menos de ~2%. A pureza global alcançada é de -92%. EXEMPLO 5

Foi diluído material de insulina Aspart em bruto de pureza de -67% 10 vezes com água purificada e foi adicionado álcool metílico até uma concentração final de 10%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Ã -13 μ -C8) . A fase móvel A foi ácido hexanos sul fónico (HSA) a 1% (p./v) em sulfato de amónio a 25mM em acetato de amónio a 250mM, pH 3,5 e a fase móvel foi álcool metílico. Um gradiente de eluição de 55%-60% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 20 volumes de coluna. A adição de HSA purificou a insulina Aspart monoglicosilada a partir de um nível de -3% até menos de 0,4%. A desocta da insulina Aspart foi reduzida desde -10% até menos de -1%. A pureza global alcançada é de -90%.

Controlo 6

Foi diluído material de insulina Glargine parcialmente purificada de pureza de -94% 3 vezes com água purificada e foi adicionado álcool metílico até uma concentração final de 10%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Â -13 μ -C8) . A fase móvel A foi sulfato de amónio a lOOmM, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metílico. Um gradiente de eluição de 51%-59% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 20 volumes de coluna. Os níveis de precursor de insulina Glargine foram reduzidos desde -2,0% até 1,2% e a insulina Glargine DesB32-R não foi reduzida. A pureza global alcançada é de -97,5%. EXEMPLO 6

Foi diluído material de insulina Glargine parcialmente purificada de pureza de -94% 3 vezes com água purificada e foi adicionado álcool metílico até uma concentração final de 10%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Ã -13 μ -C8) . A fase móvel A foi ácido hexanossulfõnico (HSA) a 0,5% (p/v) em sulfato de amónio a lOOmM, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metilico. Um gradiente de eluição de 51%-59% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 20 volumes de coluna. A adição de HSA purificou o precursor de insulina Glargine a partir de um nível de 2,5% até menos de 0,8% e DesB32-R desde 0,7% até menos de 0,2%. A pureza global alcançada é de -99,2%. EXEMPLO 7

Foi diluído material de insulina Lispro parcialmente purificada de pureza de -77% 3 vezes com água purificada e foi adicionado acetonitrilo até uma concentração final de 10%. A mistura em bruto foi purificada numa coluna Kromasil™ (100 Â -13 μ -C8). A fase móvel A foi trietilamina (TEA) a 1% (v/v) em cloreto de magnésio a 20 mM e Tris a lOOmM, pH 8,5 e a fase móvel B foi acetonitrilo. Um gradiente de eluição de 24%-30% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 25 volumes de coluna. A adição de TEA purificou o nível do precursor de insulina Lispro des líder desB-arginina de 15% a menos de 1%. A pureza global alcançada é de -97,5%.

Controlo 8

Atosiban em bruto após uma etapa de purificação está a uma pureza de -95%. 0 material eluído da primeira etapa é diluído de tal forma a obter uma concentração de solvente final a 5%. A carga é então purificada numa coluna Daiso (120Â- 10p-C8). A fase móvel A foi ácido acético a 50mM e a fase móvel B foi acetonitrilo. Foi levado a cabo um gradiente de eluição de 9% a 12% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 15 volumes de coluna seguido por 12 a 17% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 10 volumes de coluna. A pureza alcançada foi -96% mostrando remoção completa somente de impurezas 1.05RRT. As impurezas 0.85RRT e 0.9RRT não mostraram qualquer redução significativa. EXEMPLO 8

Atosiban em bruto após uma etapa de purificação está a uma pureza de -95%. 0 material eluído da primeira etapa é diluído de tal forma a obter uma concentração de solvente final a 5%. A carga é então purificada numa coluna Daiso (120Ã- ΙΟμ-CS). A fase móvel A foi ácido hexanossulfónico (HSA) a 0,05% (p/v) em ácido acético a 50mM e a fase móvel B foi acetonitrilo. Foi levado a cabo um gradiente de eluição de 10% a 17% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 25 volumes de coluna. A adição de HSA auxiliou no aumento da pureza a 98,5% mostrando remoção completa das impurezas 0.85RRT, 0.90RRT, 1.05RRT e 1.07RRT, Controlo 9

Atosiban em bruto após uma etapa de purificação está a uma pureza de -95%. 0 material eluído da primeira etapa é diluído de tal forma a obter uma concentração de solvente final a 5%. A carga é então purificada numa coluna Daiso (120Ã- 10p-C8). A fase móvel A foi tampão fosfato a 50mM a pH 8,0 e a fase móvel B foi acetonitrilo. Foi levado a cabo um gradiente de eluição de 18% a 24% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 25 volumes de coluna. A pureza alcançada foi 98,5%. A 0.97RRT foi reduzida desde -1,7% até -0,6%. A impureza 0.95RRT não foi removida, as impurezas 1.05RRT e 1.07RRT foram reduzidas desde -0,8% até -0,3%. EXEMPLO 9

Atosiban em bruto após uma etapa de purificação está a uma pureza de -95%. O material eluído da primeira etapa é diluído de tal forma a obter uma concentração de solvente final a 5%. A carga é então purificada numa coluna Daiso (120À- ΙΟμ-CS). A fase móvel A foi trietilamina (TEA) a 0,2% (v/v) em tampão fosfato a 50mM a pH 8,0 e a fase móvel B foi acetonitrilo. Foi levado a cabo um gradiente de eluição de 20% a 24% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 25 volumes de coluna. A adição de TEA auxiliou no aumento da pureza a 9 9,14% mostrando remoção completa das impurezas 0.95RRT, 0.97RRT e redução de 50% das impurezas 1.05RRT e 1.07RRT. EXEMPLO 10:

Eptifibatide em bruto está a uma pureza de -58%. A carga é preparada dissolvendo o produto em bruto em ácido acético a 50mM e acetonitrilo a 5%. A carga é então purificada numa coluna Daiso (120Ã-10p-C8) . A fase móvel A foi ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% (v/v) e a fase móvel B foi acetonitrilo. Foi levado a cabo um gradiente de eluição de 8% a 14% da fase móvel B na fase móvel A ao longo de 2 5 volumes de coluna. A adição de TFA auxiliou no aumento da pureza a 94% mostrando remoção completa das impurezas 0.86RRT, 1.22RRT, 1.8RRT e 2.1RRT.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de não patente citados na descrição • LEE et al. Preparative HPLC. 8 th Biotechnology Symposium, 1988, 593-610 [0002] • OLSEN et al. J. Chromatog. A, 1994, vol. 675, 101 [0002] • FREDERICK F. CANTWELL et al. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1984, vol. 2, 153-164 [0003] • GUSAROV et al. J.Chromatog. B, 2009, vol. 877, 1216-1220 [0003]

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Um processo cromatogrãfico para purificação de um análogo de insulina, atosiban ou eptifibatide a partir de uma mistura tendo pelo menos uma impureza relacionada, a um pH variando desde cerca de 2,5 até cerca de 8,5, o dito processo compreendendo as etapas de: a) preencher uma coluna de RP-HPLC com resina à base de sílica (C4-Ci8) , equilibrada com modificador orgânico a cerca de 5% até cerca de 85%, em que o modificador orgânico é selecionado a partir de um grupo compreendendo acetonitrilo, etanol, metanol, álcool isopropílico e dimetilformamida,· b) carregar a mistura de análogo de insulina, atosiban ou eptifibatide na coluna a uma taxa de fluxo de cerca de 180 cm/h a cerca de 360 cm/h; c) lavar a coluna com um agente de emparelhamento de iões tendo uma concentração variando desde cerca de 0,05% até cerca de 1% em combinação com o modificador orgânico tendo uma concentração variando desde cerca de 5% até cerca de 85%, a um pH variando desde cerca de 2,5 até cerca de 8,5, em que o agente de emparelhamento de iões é selecionado a partir de um grupo consistido em ácido hexanossulfónico, ácido trifluoroacético, ácido pentafluoropropanoico, trietilamina e ácido heptafluorobutírico, e; d) realizar um gradiente linear de cerca de 10% a cerca de 70% para eluir o análogo de insulina purificado, atosiban ou eptifibatide a partir da coluna, 2. 0 processo conforme reivindicado na reivindicação 1, em que o análogo de insulina é selecionado a partir de um grupo compreendendo Aspart, Lispro e Glargine ou qualquer combinação dos mesmos, 3. 0 processo conforme reivindicado na reivindicação 1, em que a resina de sílica é C8. 4. 0 processo conforme reivindicado na reivindicação 1, em que a resina tem um tamanho de partícula variando desde cerca de 5μ até cerca de 40μ. 5. 0 processo conforme reivindicado na reivindicação 4, em que a resina tem um tamanho de partícula variando desde cerca de 7μ até cerca de 20μ. 6. 0 processo conforme reivindicado na reivindicação 5, em que a resina tem um tamanho de partícula variando desde cerca de 10μ até cerca de 13μ. 7. 0 processo conforme reivindicado na reivindicação 1, em que a microsf era de resina tem um tamanho de poro variando desde cerca de 50Â até cerca de 2000Â. 8. 0 processo conforme reivindicado na reivindicação 7, em que a microsf era de resina tem um tamanho de poro variando desde cerca de 100Â até cerca de 500Â. 9. 0 processo conforme reivindicado na reivindicação 8, em que a microsfera de resina tem um tamanho de poro de 120Â. 10. 0 processo conforme reivindicado nas reivindicações 1 a 9, em que a pureza do análogo de insulina, atosiban ou eptifibatide varia desde cerca de 90% até cerca de 100%, preferentemente pelo menos 99%.