BR112012002934B1 - Processos cromatográficos e seus compostos purificados - Google Patents
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Abstract
processos cromatográficos e seus compostos purificados. a presente divulgação demonstra a utilidade de agentes de pareamento iônico na escala preparatória de purificação. mais especificamente, a divulgação se refere o uso de agentes de pareamento iônico na cromatografia linear preparatória rp, possibilitando uma alta pureza do produto final desejado. a divulgação demonstra que agentes de pareamento iônico têm efeito dramático sobre a pureza desejada dos polipeptídeos.
Description
(001) A presente divulgação demonstra a utilidade de agentes de pareamento iônico na escala preparatória de purificação. Mais especificamente, a divulgação se refere ao uso de agentes de pareamento iônico na cromatografia preparatória de fase reversa, possibilitando uma alta pureza do produto final desejado. A divulgação demonstra que agentes de pareamento iônico têm efeito dramático sobre a pureza alvo dos polipeptídeos.
(002) Um número de diferentes procedimentos cromatográficos é aplicável para obter o resultado final desejado com relação a pureza e rendimento. A cromatografia de fase reversa é um dos métodos de purificação mais poderosos empregados. A cromatografia líquida de fase reversa (“RP-LC”) e cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (“RP-HPLC”) são comumente usadas para purificar moléculas como peptídeos e proteínas, produzidas por métodos sintéticos ou recombinantes. Os métodos de RP-LC e RP-HPLC podem separar efetivamente impurezas de relação próxima e é usado para purificar diversas moléculas (Lee et al., "Preparative HPLC,” 8th Biotechnology Symposium, Pt. 1, 593610 (1988)). Além disso, RP-LC e RP-HPLC são usados com sucesso para purificar moléculas, em particular; proteínas em escala industrial (Olsen et al., 1994, J. Chromatog. A, 675, 101).
(003) O uso de agentes de pareamento iônico como trietilamina (TEA), Ácido trifluoro acético (TFA), Ácido hexano sulfônico (HSA) etc. no desenvolvimento do método analítico e seu efeito sobre a resolução do pico de proteína é bem conhecido Shayne Cox Gad; Handbook of Pharmaceutical Biotechnology. Um agente de pareamento iônico adsorve para a fase estacionária via criação de camada elétrica dupla por sua corrente de hidrocarbonos, que impõe um potencial elétrico sobre a superfície da fase estacionária. Por isso, as moléculas de proteína/peptídeo passam por troca iônica com os íons de eletrólito da fase móvel e o efeito de adsorção com a fase reversa fase estacionária (Frederick F. Cantwell et al., 1984, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 2, Páginas 153-164).
(004) A presente divulgação refere-se ao uso de agentes de pareamento iônico na escala preparatória da purificação de proteínas e peptídeos.
(005) Mais especificamente, essa divulgação se refere ao uso de HSA e TEA na cromatografia linear preparatória RP-HPLC.
(006) Os agentes de pareamento iônico usados em RP-HPLC contêm essencialmente cadeia longa de hidrocarbonos com um grupo ionizável. Essas moléculas, na fase móvel, fazem pareamento iônico com as cargas superficiais da proteína/peptídeo. Devido a esse pareamento iônico, a hidrofobicidade do peptídeo/proteína aumenta, o que é atribuído à cadeia de hidrocarbono do agente de pareamento iônico. Essa interação depende das cargas superficiais. Diferentes proteínas de uma mistura têm diferentes cargas superficiais, e assim, ligam-se de forma diferente à fase estacionária, o que melhora a resolução entre os picos proteicos. Os agentes de pareamento iônico adsorvidos transmitem uma carga específica a seu grupo funcional na superfície da fase estacionária. Isso repele as cargas iguais, mudando assim a seletividade de diversas proteínas em uma mistura.
(007) Foi observado em cromatografia convencional que, conforme a carga aumenta na coluna, a resolução cai entre as impurezas e proteínas de interesse alvo. As bandas de proteína durante a eluição tendem a se fundir afetando o desempenho da cromatografia em termos de pureza da preparação e rendimento. A presente divulgação contorna esse problema, o que é essencial para a fabricabilidade de proteínas. O carregamento mais alto da coluna além da proteína injetada na coluna para detecção analítica, é crucial para o desenvolvimento do processo e dita o custo e o rendimento de um dado processo. A presente divulgação demonstra que os agentes de pareamento iônico têm efeito dramático na pureza de proteínas mesmo após o carregamento proteico ter aumentado. A presente divulgação demonstra o uso de pareamento iônico no aprimoramento do rendimento da etapa cromatográfica.
(008) O objetivo principal da presente divulgação é obter um processo cromatográfico para a purificação de polipeptídeos de uma mistura.
(009) Outro dos principais objetivos da presente divulgação é obter análogos de Insulina, como Aspart, Glargina e Lispro.
(0010) Além disso, outro dos principais objetivos da presente divulgação é obter polipeptídeos purificados, como Atosiban e Eptifibatide.
(0011) De acordo, a presente divulgação se refere a um processo cromatográfico para a purificação de polipeptídeos de uma mistura com pelo menos uma impureza relacionada, sendo que esse processo abrange uma etapa de emprego de RP- HPLC com um agente de pareamento iônico com concentração que varia de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 2% em combinação com modificador orgânico com concentração de aproximadamente 5% a aproximadamente 85 %; um processo cromatográfico para purificação de polipeptídeo de uma mistura com pelo menos uma impureza relacionada, sendo que o referido processo compreende as etapas de a) revestimento da coluna de RP-HPLC com resina à base de sílica (C4-C18), equilibrada com modificador orgânico de aproximadamente 5% a aproximadamente 85%, b) carregamento da mistura polipeptídica na coluna a uma taxa de fluxo de aproximadamente 180 cm/hr a aproximadamente 360 cm/hr, c) lavagem da coluna com um agente de pareamento iônico com concentração que varia de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 1% em combinação com o modificador orgânico com concentração que varia de aproximadamente 5% a aproximadamente 85%, e d) realização de um gradiente linear de aproximadamente 10% a aproximadamente 70% para eluir o polipeptídeo purificado da coluna; um análogo de Insulina obtido por um processo conforme definido acima com pureza que varia de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%; Aspart purificado com pureza de pelo menos 98%; Glargina purificada com pureza de pelo menos 99%; Lispro purificado com pureza de pelo menos 97%; um polipeptídeo obtido por um processo como definido acima com pureza que varia de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%, Atosiban purificado com pureza de pelo menos 99,14%; e Eptifibatida purificada com pureza de pelo menos 94%.
(0012) A presente divulgação se refere a um processo cromatográfico para a purificação de polipeptídeo de uma mistura com pelo menos uma impureza relacionada, sendo que esse processo abrange uma etapa de emprego de RP- HPLC com um agente de pareamento iônico com concentração que varia de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 2% em combinação com modificador orgânico com concentração de aproximadamente 5% a aproximadamente 85%.
(0013) Em uma configuração da presente divulgação, mais preferencialmente o agente de pareamento iônico e o modificador orgânico têm uma concentração que varia de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 1% e de aproximadamente 8% a aproximadamente 65%, respectivamente.
(0014) Em outra configuração da presente invenção, o agente de pareamento iônico é selecionado de um grupo que compreende Ácido hexano sulfônico, Ácido trifluoro acético, Ácido pentafluoro propanoico, Trietil amina e Ácido heptafluorobutírico.
(0015) Ainda em outra configuração da presente divulgação, o modificador orgânico é selecionado de um grupo que compreende Acetonitrila, Etanol, Metanol e Álcool isopropílico.
(0016) Ainda em outra configuração da presente divulgação, o polipeptídeo é selecionado de um grupo que compreende Análogo de Insulina, Eptifibatida e Atosiban.
(0017) Ainda em outra configuração da presente divulgação, os análogos de Insulina são Aspart, Lispro e Glargina.
(0018) A presente divulgação também se refere a um processo cromatográfico para purificação de polipeptídeo de uma mistura com pelo menos uma impureza relacionada, sendo que o referido processo compreende as etapas de: revestimento da coluna de RP-HPLC com resina à base de sílica (C4-C18), equilibrada com modificador orgânico de aproximadamente 5% a aproximadamente 85%, b) carregamento da mistura polipeptídica na coluna a uma taxa de fluxo de aproximadamente 180 cm/hr a aproximadamente 360 cm/hr, c) lavagem da coluna com um agente de pareamento iônico com concentração que varia de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 1% em combinação com o modificador orgânico com concentração que varia de aproximadamente 5% a aproximadamente 85%, e d) realização de um gradiente linear de aproximadamente 10% a aproximadamente 70% para eluir o polipeptídeo purificado da coluna.
(0019) Em uma configuração da presente divulgação, a resina de sílica é preferencialmente C8.
(0020) Em outra configuração da presente divulgação, a purificação cromatográfica é realizada em um pH que varia de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 8,5.
(0021) Ainda em outra configuração da presente divulgação, a resina tem tamanho de partícula que varia de aproximadamente 5μ a aproximadamente 40μ, preferencialmente de aproximadamente 7μ a aproximadamente 20μ, e mais preferencialmente de aproximadamente 10μ a aproximadamente 13μ.
(0022) Ainda em outra configuração da presente divulgação, a gota de resina tem tamanho de poro que varia de aproximadamente 50A a aproximadamente 2000A, preferencialmente de aproximadamente 100A a aproximadamente 500A, e mais preferencialmente 120A.
(0023) Ainda em outra configuração da presente divulgação, a pureza do polipeptídeo varia de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%, preferencialmente de pelo menos 100%.
(0024) A presente divulgação refere-se ainda a um análogo de Insulina obtido por um processo conforme definido acima com pureza que varia de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%.
(0025) A presente divulgação também se refere a Aspart purificado com pureza de pelo menos 98%.
(0026) A presente divulgação também se refere a Glargina purificada com pureza de pelo menos 99%.
(0027) A presente divulgação também se refere a Lispro purificado com pureza de pelo menos 97%.
(0028) A presente divulgação refere-se ainda a um polipeptídeo purificado obtido por um processo conforme definido acima com pureza que varia de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%.
(0029) A presente divulgação também se refere a Atosiban purificado com pureza de pelo menos 99,14%.
(0030) A presente divulgação também se refere a Eptifibatida purificada com pureza de pelo menos 94%.
(0031) A divulgação se refere ao uso de agentes de pareamento iônico como Trietilamina, Ácido trifluoro acético, Ácido hexano sulfônico, Ácido pentafluoro propanoico, etc. na cromatografia linear preparatória RP-HPLC de polipeptídeos. Mais especificamente, a divulgação se refere ao uso de agentes de pareamento iônico através de cromatografia linear preparatória de fase reversa de análogos de Insulina e peptídeos
(0032) Outro objetivo e vantagem da presente divulgação é o aumento da pureza alvo da proteína mesmo após o aumento do carregamento proteico.
(0033) A menos que sejam definidos de outra forma no presente instrumento, os termos usados com relação à presente divulgação terão os significados comumente entendidos por pessoas de habilidade comum na arte. Além disso, a menos que seja exigido de outra forma pelo contexto, os termos no singular incluirão as pluralidades e os termos no plural incluirão o singular. Os métodos e técnicas da presente divulgação são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na arte.
(0034) Os termos 'polipeptídeo', ’proteína’, ’peptídeo’ referem-se a um polímero de aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto; assim, peptídeos, oligopeptídeos e proteínas são incluídos na definição de polipeptídeo. Esse termo também não se refere ou exclui modificações pós-expresão do polipeptídeo, embora modificações químicas ou pós-expressão desses polipeptídeos possam ser incluídas ou excluídas como configurações específicas. Portanto, por exemplo, modificações a polipeptídeos que incluem a ligação covalente de grupos de glicosil, grupos de acetil, grupos de fosfato, grupos de lipídio e afins são expressamente compreendidas pelo termo polipeptídeo. Além disso, polipeptídeos com essas modificações podem ser especificados como espécies individuais a serem incluídas ou excluídas da presente divulgação. Em uma configuração, a molécula é um polipeptídeo ou um de seus análogos ou derivados relacionados. De acordo com a configuração preferencial, o polipeptídeo é selecionado de análogos de Insulina como aspart, lispro e glargina. Preferencialmente, o polipeptídeo é um peptídeo cíclico. De acordo com outra configuração preferencial, o polipeptídeo é um peptídeo não cíclico. Ainda em outra configuração preferencial, o polipeptídeo é selecionado do grupo que compreende eptifibatida e atosiban.
(0035) O termo “análogo de Insulina” tem a intenção de compreender qualquer forma de “Insulina” como definida acima em que um ou mais dos aminoácidos da cadeia de polipeptídeo foi substituído por um aminoácido alternativo e/ou em que um ou mais dos aminoácidos foi deletado ou em que um ou mais aminoácidos adicionais foi adicionado à cadeia de polipeptídeo. O análogo de Insulina é selecionado do grupo que compreende Aspart, Lispro e Glargina.
(0036) Insulina Aspart é um análogo humano que é um agente de rápida ação, de redução de glicose sanguínea parenteral. Aspart é homólogo com Insulina humana regular com exceção de uma única substituição na prolina de ácido por ácido aspártico na posição B28, e é produzido por tecnologia de DNA recombinante.
(0037) Insulina Glargina difere de Insulina humana pelo fato de que o aminoácido aspargina na posição 21 na cadeia A de Insulina é substituído por glicina e duas argininas são adicionadas ao término C da cadeia B. Insulina Glargina também é um análogo humano que é um agente de rápida ação, de redução de glicose sanguínea parenteral.
(0038) Insulina Lispro também é um análogo humano que é um agente de rápida ação, de redução de glicose sanguínea parenteral. Quimicamente, é um análogo de insulina humana Lis (B28), Pro (B29), criado quando os aminoácidos nas posições 28 e 29 na cadeia B de Insulina são revertidos.
(0039) Atosiban- um peptídeo sintético que é um inibidor dos hormônios oxitocina e vasopressina. Trata-se de um antagonista de receptor de oxitocina, é eficaz no tratamento de episódio agudo de trabalho de parto precoce. Trata-se de um antagonista concorrente de oxitocina em receptores de oxitocina uterinos e foi desenvolvido como uma nova terapia tocolítica no tratamento de trabalho de parto precoce. Atosiban também é chamado de ADH (Hormônio Anti-Diurético).
(0040) Eptifibatida- é um medicamento antiplaquetário da classe de inibidor de glicoproteína IIb/IIIa. É um heptapeptídeo cíclico derivado de uma proteína encontrada no veneno da cascavel anã do sudeste. Pertence à classe dos chamados argicina-glicina-aspartato-miméticos e liga-se de forma reversa às plaquetas.
(0041) O termo “cromatografia” se refere ao processo pelo qual um analito de interesse em uma mistura é separado dos outros solutos em uma mistura como resultado de diferenças nas taxas em que os solutos individuais da mistura migram através de uma fase estacionária sob a influência de uma fase móvel, ou em processos de ligação e eluição.
(0042) O termo “Cromatografia líquida de alto desempenho”, conforme usado no presente instrumento, refere-se ao procedimento cromatográfico em que as partículas (fase estacionária) usadas no revestimento da coluna sejam pequenas (entre 3 e 50 mícrons) e regulares com pouca variação do tamanho selecionado. Essa cromatografia tipicamente emprega pressões relativamente altas (em torno de 500-3500 psi).
(0043) O termo “impureza” se refere a qualquer produto que não compartilhe a mesma natureza da proteína de interesse. As impurezas são principalmente relacionadas ao produto. A impureza que foi alvo na Insulina Aspart crua pelo uso dos agentes de pareamento iônico foi precursor de Insulina Aspart arginina B Des leader des. Difere de Insulina Aspart pelo fato de possuir uma extensão de 5 aminoácidos no terminal C da cadeia B, sendo os 5 aminoácidos Arg-Asp-Ala-Asp- Asp, o que mostra que em pH acídico tem uma carga extra positiva com relação a Aspart.
(0044) “Agentes de pareamento iônico” são normalmente compostos iônicos que formam pares iônicos com íons de carga oposta. Normalmente agentes de pareamento iônico usados em RP-HPLC contêm uma cadeia de hidrocarbono que transmite uma determinada hidrofobicidade de forma que os agentes de pareamento iônico possam ser retidos em uma coluna de fase reversa. Agentes de pareamento iônico típicos capazes de formar pares iônicos com proteínas podem ser usados na presente divulgação, podendo incluir Ácido Trifluoro Acético (TFA), Ácido Hexano Sulfônico (HSA), Ácido Pentafluoro Propanoico (PFPA), Trietil amina (TEA), Ácido Heptafluorobutírico (HFBA), etc.
(0045) Especificamente, a presente divulgação se refere ao uso de HSA e TEA em cromatografia linear preparatória RP-HPLC como exemplificado nas configurações preferenciais. HSA tem uma estrutura composta de uma cadeia de hidrocarbono longa 6C com grupo funcional de ácido sulfônico (SO3-). Em pH acídico, essencialmente abaixo do valor de pI de um peptídeo/proteína, todos os grupos de amino funcionais dos aminoácidos básicos como Lisina, Arginina e Histidina presentes na superfície da estrutura proteica teriam carga positiva devido a protonação. O grupo SO3 de HSA existe na forma iônica mesmo em pH baixo devido à alta densidade de elétrons nos átomos de O, que é atribuída ao efeito indutivo demonstrado pela cadeia lateral de hidrocarbono longa 6-C. O grupo de SO3 teria especificamente como alvo os grupos de carga positiva na estrutura proteica. Essa interação entre HSA e o peptídeo causaria uma alteração conformacional minúscula e reversível na estrutura 3D da proteína. Isso, às vezes, causaria uma alteração na seletividade de algumas impurezas durante a cromatografia RP. HSA é muito bem conhecido por aprimorar a resolução dos picos proteicos na cromatografia RP analítica. Também foi observado na presente divulgação que HSA auxilia no aprimoramento dos rendimentos e níveis de pureza na cromatografia preparatória.
(0046) Trietil amina (TEA), como um agente de pareamento iônico bem conhecido, elui a proteína na forma de bandas firmes e essa propriedade é atualmente empregada em carregamentos mais altos (carregamento preparatório) para melhorar os rendimentos e a pureza da cromatografia RP.
(0047) “Modificadores orgânicos” são solventes não polares usados em cromatografia RP que, em concentrações baixas, auxiliam as moléculas de analitos a ligarem-se à fase estacionária e em maiores concentrações as eluem. Diversos modificadores orgânicos são usados na presente divulgação, como acetonitrila, álcool isopropílico, etanol, metanol, Dimetilformamida, etc.
(0048) “Desocta” é uma impureza relacionada ao produto que é gerada durante a etapa de tripsinação do processo. É caracterizada pela falta de 8 aminoácidos rumo ao terminal C da cadeia B de Insulina e seus análogos.
(0049) 0,85RRT, 0,9RRT, 1,05RRT e 1,07RRT são impurezas relacionadas ao produto que são geradas durante intermediários da reação, e algumas são geradas durante o processo. Essas impurezas são formadas por conta das etapas de reação múltiplas envolvidas no processo de preparação de Atosiban.
(0050) 0,86RRT, 1,22RRT, 1,8RRT e 2,1RRT são impurezas formadas por conta da etapa de reações múltiplas envolvidas no processo de preparação de eptifibatida. São tipicamente intermediários de reação e alguns são gerados durante o processo. Pode haver intermediários que tenham grupos protegidos, que os impedem de se converter no produto.
(0051) A presente divulgação se refere ao uso de agentes de pareamento iônico para obter análogos de Insulina substancialmente puros e peptídeos na faixa de 90%-100%. Análogos de insulina podem ser selecionados de um grupo que compreende Aspart, Lispro e Glargina. Proteína ou peptídeo é Atosiban e eptifibatida.
(0052) É um objetivo da presente divulgação usar pelo menos 0,05% a 1% (p/v) de um agente de pareamento iônico em que o processo se baseia em RP-HPLC. Mais preferencialmente, um agente de pareamento iônico é usado na faixa de 0,05%-1% (p/v).
(0053) Em um aspecto amplo, a presente divulgação se refere ao uso de pareamento iônico sendo empregado para purificar uma proteína de interesse que compreende as etapas de.
(0054) O equilíbrio para manter a fase estacionária pronta para se ligar ao analito de interesse, seguido pelo carregamento e que o material cru ou impuro que contém o analito é passado através da fase estacionária. A amostra é carregada em uma taxa de fluxo de aproximadamente 180- 360 cm/hr. Os gradientes usados estão sujeitos a variação com relação ao peptídeo de amostra a ser purificado.
(0055) A primeira etapa do processo no presente instrumento envolve a purificação de moléculas de misturas que as contenham pelo carregamento das misturas em uma coluna de cromatografia líquida de fase reversa. Preferencialmente, a coluna é revestida com um meio com diâmetro de partícula de aproximadamente 5-40 μ, mais preferencialmente aproximadamente 10-40 μ, e mais preferencialmente aproximadamente 10-13 μ. Preferencialmente, a coluna tem um tamanho de poro de aproximadamente 100-2000 ângstrons, mais preferencialmente aproximadamente 100-500 ângstrons. No contexto da presente divulgação, o tamanho de poro da resina revestida na coluna é de 120 ângstroms.
(0056) Ela é seguida pela lavagem para remover as moléculas não ligadas, eluir o analito da fase estacionária e regeneração para remover quaisquer moléculas com ligação firme que não sejam eluídas com as condições de eluição dadas. 5%-65% de diversos modificadores orgânicos são usados para equilíbrio e lavagem, como acetonitrila, álcool isopropílico, metanol, dimetilformamida, etc. A purificação é realizada em pH na faixa de 2,5-8,5.
(0057) O meio da coluna pode ser qualquer material adequado, incluindo meio de resina com base polimérica, meio à base de sílica ou meio metacrilato.
(0058) Um aspecto da presente divulgação reside no uso de agentes de pareamento iônico na cromatografia linear preparatória RP-HPLC para obter proteínas e peptídeos substancialmente puros. Agentes de pareamento iônico típicos capazes de formar pares iônicos com proteínas podem ser usados na presente divulgação, podendo incluir Ácido Trifluoro Acético (TFA), Ácido Hexano Sulfônico (HSA), Ácido Pentafluoro Propanoico (PFPA), Trietil amina (TEA), Ácido Heptafluorobutírico (HFBA), etc.
(0059) Especificamente, a presente divulgação se refere ao uso de HSA e TEA em cromatografia linear preparatória RP como exemplificado nas configurações preferenciais. HSA tem uma estrutura composta de uma cadeia de hidrocarbono longa 6C com grupo funcional de ácido sulfônico (SO3-). Em pH acídico, essencialmente abaixo do valor de pI de um peptídeo/proteína, todos os grupos de amino funcionais dos aminoácidos básicos como Lisina, Arginina e Histidina presentes na superfície da estrutura proteica teriam carga positiva devido a protonação. O grupo de SO3 teria especificamente como alvo os grupos de carga positiva na estrutura proteica. Conforme HSA interage com as cargas superficiais, o grupo de hexil de HSA seria exposto na superfície da proteína, o que aumentaria sua hidrofobicidade. A medida da interação de HSA com diversos peptídeos resultaria em uma mudança em sua seletividade. HSA é muito bem conhecido por aprimorar a resolução dos picos proteicos na cromatografia RP analítica. Também foi observado na presente divulgação que HSA auxilia no aprimoramento dos rendimentos e níveis de pureza na cromatografia preparatória.
(0060) Trietil amina (TEA) também funciona de forma semelhante a HSA, pares iônicos de TEA com os meios de carga negativa na superfície da proteína e aumenta a hidrofobicidade das proteínas.
(0061) Outro objetivo da presente divulgação se refere ao uso do agente de pareamento iônico que auxiliou na mudança da seletividade de uma impureza que tem reação muito próxima com a proteína de interesse e foi uma grande preocupação na purificação.
(0062) As impurezas são principalmente relacionadas ao produto. A impureza que foi alvo na Insulina Aspart crua pelo uso dos agentes de pareamento iônico foi precursor de Insulina Aspart arginina B Des leader des. Difere de Insulina Aspart pelo fato de possuir uma extensão de 5 aminoácidos no terminal C da cadeia B, sendo os 5 aminoácidos Arg-Asp-Ala-Asp-Asp, o que mostra que em pH acídico tem uma carga extra positiva com relação a Aspart, o que seria um alvo para HSA. Em Insulina Glargina, HSA auxilia na separação do precursor de Insulina Glargina, visto que possui cargas extra positivas em comparação com Insulina Glargina.
(0063) Outro aspecto da presente divulgação é o aumento da pureza alvo da proteína mesmo após o aumento do carregamento proteico.
(0064) O desempenho eficaz da presente divulgação exige a individualização da combinação certa da matriz cromatográfica a ser usada, o valor do pH e a potência iônica do tampão para purificações eficientes.
(0065) O pH do sistema tampão influencia a separação em combinação com a hidrofobicidade dos compostos. A mudança no pH atribuída durante diferentes etapas da separação cromatográfica afeta a mobilidade dos compostos na coluna.
(0066) As descrições de configurações da presente divulgação acima são apresentadas para fins de ilustração e descrição. Elas não se destinam a ser exaustivas ou a limitar a divulgação às formas precisas divulgadas. Diversas modificações e variações são possíveis à luz dos ensinamentos acima. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapas de processo específicos ao objetivo, espírito e escopo da presente divulgação. Todas essas modificações são destinadas a estarem dentro do escopo das reivindicações anexas ao presente instrumento.
(0067) A tecnologia da presente Solicitação é posteriormente elaborada com o auxílio dos exemplos abaixo. No entanto, os exemplos não devem ser interpretados de forma a limitar o escopo da divulgação.
(0068) Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar ainda mais as configurações da presente divulgação, mas não têm a intenção de limitar seu escopo. Embora sejam típicos dos que podem ser usados, outros procedimentos, metodologias ou técnica conhecidos por uma pessoa habilidosa na arte podem ser alternativamente usados.
(0069) Uma compreensão mais completa pode ser obtida com referência aos seguintes exemplos específicos, que são fornecidos apenas para fins ilustrativos, não devendo limitar o escopo da divulgação.
(0070) EXEMPLOS:
(0071) Controle 1
(0072) Material Cru de Insulina Aspart de pureza ~75% foi diluído 10 vezes com água purificada e IPA foi adicionado para uma concentração final de 5%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 250 mM de acetato de sódio, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool isopropílico. Uma Eluição de Gradiente de 15% a 18% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. A separação de Insulina Aspart desocta foi observada, mas a separação do precursor de desleader desB-arginina Insulina Aspart não foi alcançada. A pureza geral chegou a ~90%.
(0073) EXEMPLO 1
(0074) Material Cru de Insulina Aspart de pureza ~75% foi diluído 10 vezes com água purificada e IPA foi adicionado para uma concentração final de 5%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 1% de Ácido hexano sulfônico (HSA) (p/v) em 250 mM de acetato de sódio, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool isopropílico. Uma Eluição de Gradiente de 18%-22% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. A adição de HSA removeu de forma eficiente Insulina Aspart desocta, e também a redução do precursor desleader desB-arginina Insulina Aspart de um nível de ~ 2,77% para menos de 0,27% foi observada e a pureza geral obtida foi de ~97,85%.
(0075) Controle 2
(0076) Material Cru de Insulina Aspart de pureza ~75% foi diluído 10 vezes com água purificada e álcool etílico foi adicionado para uma concentração final de 10%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 25mM de sulfato de amônio em 250 mM de acetato de sódio, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool etílico. Uma Eluição de Gradiente de 26%-32% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. O precursor de desleader desB-arginina Insulina Aspart foi reduzido de um nível de ~2% a 1%. A impureza Insulina Aspart desocta foi completamente removida e a Insulina Aspart monoglicosilada foi reduzida de ~3% para 1,3%. A pureza geral obtida foi de ~94%
(0077) EXEMPLO 2
(0078) Material Cru de Insulina Aspart de pureza ~75% foi diluído 10 vezes com água purificada e álcool etílico foi adicionado para uma concentração final de 10%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 1% de Ácido hexano sulfônico (HSA) (p/v) em 25mM de sulfato de amônio em 250 mM de acetato de sódio, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool etílico. Uma Eluição de Gradiente de 25%-35% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. A adição de HSA reduziu o precursor de desleader desB- arginina Insulina Aspart de um nível de um nível de ~3% para menos de 0,3%. A impureza Insulina Aspart desocta foi completamente removida e a Insulina Aspart monoglicosilada foi reduzida de ~2% para 0,3%. A pureza geral obtida foi de ~98%
(0079) Controle 3
(0080) Material Cru de Insulina Aspart de pureza ~75% foi diluído 10 vezes com água purificada e álcool metílico foi adicionado para uma concentração final de 10%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 25mM de sulfato de amônio em 250 mM de acetato de sódio, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metílico. Uma Eluição de Gradiente de 45%-55% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. O precursor de desleader desB-arginina Insulina Aspart foi reduzido de um nível de ~2% para menos de 1%. A impureza Insulina Aspart monoglicosilada não demonstrou nenhuma redução significativa. A redução foi de 2% para 1,5%. A Insulina Aspart desocta foi reduzida de ~10% para menos de ~2%. A pureza geral obtida foi de ~89%
(0081) EXEMPLO 3
(0082) Material Cru de Insulina Aspart de pureza ~75% foi diluído 10 vezes com água purificada e álcool metílico foi adicionado para uma concentração final de 10%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 1% de Ácido hexano sulfônico (HSA) (p/v) em 25mM de sulfato de amônio em 250 mM de acetato de amônio, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metílico. Uma Eluição de Gradiente de 55%-65% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. A adição de HSA purificou o precursor de desleader desB-arginina Insulina Aspart de um nível de ~2% para 1%. A impureza Insulina Aspart monoglicosilada foi reduzida de 3% para menos de 0,5%. A Insulina Aspart desocta foi reduzida de ~10% para menos de ~2%. A pureza geral obtida foi de ~92%
(0083) EXEMPLO 4
(0084) Material Cru de Insulina Aspart de pureza ~75% foi diluído 10 vezes com água purificada e álcool metílico foi adicionado para uma concentração final de 10%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 1% de Ácido hexano sulfônico (HSA) (p/v) em 25mM de sulfato de amônio em 250 mM de acetato de amônio, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metílico. Uma eluição de gradiente de 20%-50% da fase móvel B na fase móvel A sobre 5 volumes de coluna seguida por 55%-65% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. A adição de HSA purificou o precursor de desleader desB-arginina Insulina Aspart de um nível de ~2% para menos de 1% e a impuresa monoglicosilada de ~3% para 0,6%. A Insulina Aspart desocta foi reduzida de ~10% para menos de ~2%. A pureza geral obtida foi de ~92%
(0085) EXEMPLO 5
(0086) Material Cru de Insulina Aspart de pureza ~75% foi diluído 10 vezes com água purificada e álcool metílico foi adicionado para uma concentração final de 10%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 1% de Ácido hexano sulfônico (HSA) (p/v) em 25mM de sulfato de amônio em 250 mM de acetato de amônio, pH 3,5 e a fase móvel B foi álcool metílico. Uma Eluição de Gradiente de 55%-60% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. A adição de HSA purificou Insulina Aspart monoglicosilada de um nível de ~3% para menos de 0,4%. A Insulina Aspart desocta foi reduzida de ~10% para menos de ~1%. A pureza geral obtida foi de ~90%.
(0087) Controle 6
(0088) Material de Insulina Glargina parcialmente purificada de pureza ~94% foi diluído 3 vezes com água purificada e álcool metílico e foi adicionado para uma concentração final de 10%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 100mM de sulfato de amônio, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metílico. Uma Eluição de Gradiente de 51%-59% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. Os níveis do precursor Insulina Glargina foram reduzidos de ~2,0% para 1,2% e DesB32-R Insulina Glargina não foi reduzida. A pureza geral obtida foi de ~97,5%.
(0089) EXEMPLO 6
(0090) Material de Insulina Glargina parcialmente purificada de pureza ~94% foi diluído 3 vezes com água purificada e álcool metílico e foi adicionado para uma concentração final de 10%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 0,5% de Ácido hexano sulfônico (HSA) (p/v) em 100mM de sulfato de amônio, pH 4,0 e a fase móvel B foi álcool metílico. Uma Eluição de Gradiente de 51%-59% da fase móvel B na fase móvel A sobre 20 volumes de coluna. A adição de HSA purificou o precursor de Insulina Glargina de um nível de ~2,5% para menos de 0,8% e DesB32-R de 0,7% para menos de 0,2%. A pureza geral obtida foi de ~99,2%.
(0091) EXEMPLO 7
(0092) Material de Insulina Lispro de pureza ~77% foi diluído 3 vezes com água purificada e acetonitrila foi adicionada para uma concentração final de 10%. A mistura crua foi purificada em uma coluna de Kromasil™ (100 A -13 μ -C8). A fase móvel A foi 1% de Trietil amina (TEA) (v/v) em 20 mM de cloreto de magnésio e 100mM Tris, pH 8,5 e a fase móvel B foi acetonitrila. Uma Eluição de Gradiente de 24%-30% da fase móvel B na fase móvel A sobre 25 volumes de coluna. A adição de TEA purificou o precursor de desleader desB-Arginina Insulina Lispro de um nível de 15% para menos de 1%. A pureza geral obtida foi de ~97,5%.
(0093) Controle 8
(0094) Atosiban cru após uma etapa de purificação tem uma pureza de ~95%. O pool de eluição da primeira etapa é diluído de forma a obter a concentração do solvente final de 5%. A carga é, então, purificada em uma coluna Daiso (120A- 10μ- C8). A fase móvel A foi ácido acético 50mM e a fase móvel B foi Acetonitrila. Uma eluição de gradiente de 9% a 12% da fase móvel B na fase móvel A sobre 15 volumes de coluna seguida por 12% a 17% da fase móvel B na fase móvel A sobre 10 volumes de coluna foi realizada. A pureza obtida foi ~96%, demonstrando a remoção completa de apenas impurezas 1,05RRT. A impureza 0,85RRT e 0,9RRT não apresentou nenhuma redução.
(0095) EXEMPLO 8
(0096) Atosiban cru após uma etapa de purificação tem uma pureza de ~95%. O pool de eluição da primeira etapa é diluído de forma a obter a concentração do solvente final de 5%. A carga é, então, purificada em uma coluna Daiso (120A- 10μ- C8). A fase móvel A foi 0,05% de ácido hexano sulfônico (HSA) (p/v) em 50mM de ácido acético e a fase móvel B foi Acetonitrila. Uma eluição de gradiente de 10% a 17% da fase móvel B na fase móvel A sobre 25 volumes de coluna foi realizada. A adição de HSA ajudou no aumento da pureza para 98,6%, demonstrando a remoção completa das impurezas 0,85RRT, 0,90RRT, 1,05RRT e 1,07RRT.
(0097) Controle 9
(0098) Atosiban cru após uma etapa de purificação tem uma pureza de ~95%. O pool de eluição da primeira etapa é diluído de forma a obter a concentração do solvente final de 5%. A carga é, então, purificada em uma coluna Daiso (120A- 10μ- C8). A fase móvel A foi tampão de fosfato 50mM em um pH de 8,0 e a fase móvel B foi Acetonitrila. Uma eluição de gradiente de 18% a 24% da fase móvel B na fase móvel A sobre 25 volumes de coluna foi realizada. A pureza obtida foi de 98,5%. A impureza 0,97RRT foi reduzida de ~1,7% para ~0,6%. A impureza 0,95RRT não foi removida, as impurezas 1,05RRT e 1,07RRT foram reduzidas de ~0,8% para ~0,3%.
(0099) EXEMPLO 9
(00100) Atosiban cru após uma etapa de purificação tem uma pureza de ~95%. O pool de eluição da primeira etapa é diluído de forma a obter a concentração do solvente final de 5%. A carga é, então, purificada em uma coluna Daiso (120A- 10μ- C8). A fase móvel A foi 0,2% de Trietil amina (TEA) (v/v) em 50mM de tampão de fosfato em um pH de 8,0 e a fase móvel B foi Acetonitrila. Uma eluição de gradiente de 20% a 24% da fase móvel B na fase móvel A sobre 25 volumes de coluna foi realizada. A adição de TEA ajudou no aumento da pureza para 99,14%, demonstrando a remoção completa das 0,95RRT, 0,97RRT e uma redução de 50% nas impurezas 1,05RRT e 1,07RRT.
(00101) EXEMPLO 10:
(00102) Eptifibatida Crua tem pureza de ~58%. A carga é preparada pela dissolução do cru em 50mM de ácido acético e 5% de acetonitrila. A carga é, então, purificada em uma coluna Daiso (120A- 10μ-C8). A fase móvel A foi ácido trifluoro acético 0.1% (TFA) (v/v) e a fase móvel B foi Acetonitrila. Uma eluição de gradiente de 8% a 14% da fase móvel B na fase móvel A sobre 25 volumes de coluna foi realizada. A adição de TFA ajudou no aumento da pureza para 94%, demonstrando a remoção completa das impurezas 0,86RRT, 1,22RRT, 1,8RRT and 2,1RRT.
(00103) As configurações preferenciais da presente divulgação foram divulgadas. Uma pessoa de habilidade comum na arte perceberia, no entanto, que determinadas modificações viriam com os ensinamentos da presente divulgação. Portanto, as reivindicações abaixo devem ser estudadas para determinar o verdadeiro escopo e teor da divulgação.
Claims (7)
1. Processo cromatográfico para purificação de análogo de insulina, atosiban ou eptifibatida a partir de uma mistura, caracterizada por ter pelo menos uma impureza relacionada, a um pH variando de 2,5 a 8,5, o referido processo compreendendo as etapas de: a) empacotamento da coluna RP-HPLC com resina à base de sílica (C8), equilibrada com 5% a 85% de modificador orgânico, em que o modificador orgânico é selecionado a partir de um grupo que compreende acetonitrila, etanol, metanol, álcool isopropílico e dimetilformamida; b) carregamento da mistura de análogo de insulina, atosiban ou eptifibatida na coluna a uma taxa de fluxo de 180 cm/h a 360 cm/h; c) lavar a coluna com um agente de emparelhamento de íons com uma concentração variando de 0,05% a 1% em combinação com o modificador orgânico com uma concentração variando de 5% a 85%, a um pH variando de 2,5 a 8,5, em que o emparelhamento de íons o agente é selecionado a partir de um grupo que consiste em ácido hexano sulfônico, ácido trifluoroacético e trietilamina; d) realizar um gradiente linear de 10% a 70% para eluir o análogo de insulina purificado, atosiban ou eptifibatida da coluna.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo análogo da insulina é selecionado a partir de um grupo compreendendo Aspart, Lispro e Glargine ou qualquer combinação dos mesmos.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela resina de sílica ser C8.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a resina ter um tamanho de partícula variando de 10 μ para 13μ.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo cordão de resina ter um tamanho de poro variando de 100A a 120A.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo cordão de resina ter um tamanho de poro de 120A.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela pureza do análogo da insulina, atosiban ou eptifibatida, varia de 90% a 99%.
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