CN110041406B - 一种缩宫素[+Gly]杂质的精制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；所述的高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步的反相洗脱过程中完成。本发明缩宫素[+Gly]杂质的精制方法在纯化的过程中产生的废液大部分为废水，可经污水站简单处理就可以重复利用，经济环保。

Description

一种缩宫素[+Gly]杂质的精制方法
技术领域
本发明涉及一种缩宫素[+Gly]杂质的精制方法。
背景技术
缩宫素，又称催产素，英文名为Oxytocin，结构式：
Figure BDA0002051674620000011
分子式为：C43H66N12O12S2，分子量为1007.2
缩宫素用于引产、催产、产后及流产后因宫缩无力或缩腹不良而引起的子宫出血；了解胎盘储备功能(催产素激怒试验)；滴鼻可促使排乳。缩宫素能间接刺激子宫平滑肌收缩，模拟正常分娩的子宫收缩作用，导致子宫颈扩张，子宫对缩宫素的反应在妊娠过程中逐渐增加，足月时达高峰。缩宫素也可刺激乳腺的平滑肌收缩，有助于乳汁自乳房排出，但并不增加乳腺的乳汁分泌量。
就一个药品而言，其中所含的少量杂质是引发药品副作用最重要的原因，因此对其纯度的检查是保证药品安全有效性的重要基础之一，而纯度检查的内容，根据各个药物的性质和特点有些不同，但基本上均要涉及各自的“有关物质”检查研究。合成多肽的有关物质主要来自合成过程中的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物、聚合物等杂质，尽管目前合成多肽的纯化工艺已经有了很大进步，但工艺杂质仍是合成多肽有关物质的重要来源，这主要是由于合成多肽的一些工艺杂质(如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换的产物等)与药物本身的性质可能非常近似，从而给纯化造成了一定的难度。研究表明合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中，天冬酰胺、谷胺酰胺和肽链C段酰胺易于发生脱酰胺反应(尤其是在pH值升高和高温条件下)。
其中，缩宫素[+Gly]杂质是缩宫素在合成过程中常见的杂质，该杂质可以在缩宫素质量检测中作为杂质对照品，因此，制备纯度高的缩宫素[+Gly]杂质对缩宫素质量控制具有重要意义。
目前已上市多肽药物常见的纯化方法大都采用了制备型高效液相色谱法，该法是获得高纯度多肽目标分子的最有效的方法。一般多肽药物纯化制备工艺设计是先中低压色谱富集目标多肽，然后高压色谱精制，但是考虑到目标多肽缩宫素分子量约1kDa，无合适的分子筛凝胶柱(其上样量小，流速低，处理量小，比较适合分子量大于10kDa蛋白的脱盐)或超滤膜选择。而且中低压色谱中常用的分离方法有分子筛色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法，这些色谱方法中用到的填料的粒径通常从几十微米到几百微米不等，空隙尺寸多为几百纳米不等，无法得到高纯度的目标多肽。采用固相合成+稀释环化得到的缩宫素[+Gly]粗品溶液浓度均比较稀，采用一般的反相色谱柱进行纯化时，仅上样的过程中就产生大量的有机废液，不能直排或经污水站简单处理就可以重复利用，尤其是低浓度的样品纯化处理，废液量更大，危废的处理费用很高。因此，迫切需要开发新的适合纯化低浓度多肽及盐的经济有效的工艺。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中缩宫素[+Gly]杂质的精制过程中产生大量有机废液，且危废液量大，造成的废液处理成本大，不经济的缺陷，而提供了一种缩宫素[+Gly]杂质的精制方法。本发明的精制缩宫素[+Gly]杂质的方法在纯化目标产物的过程中产生的废液大部分为废水可经污水处理可直接回用，经济环保。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了一种缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其包括下述步骤：
采用高效液相反相色谱法将缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；
所述的高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料。
所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步的反相洗脱过程中完成；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化的条件如下：
Figure BDA0002051674620000031
收集保留时间为53～63min的洗脱液即得到缩宫素[+Gly]杂质溶液；
所述的流动相A为体积百分比0.005～0.1％的乙酸/水溶液，所述的流动相B为体积百分比0.005～0.1％的乙酸/乙腈，所述的样品C1为所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，所述的流动相C2为5～50mM NH4Ac-NH4OH水溶液，所述的流动相C2的pH为7.0～9.0，所述的洗脱液的流速为80～100ml/min。
本发明中，在20～21min期间，将所述的洗脱液由所述的样品C1更换为所述的流动相C2；在31～32min期间，将所述的洗脱液由所述的流动相C2更换为所述的流动相A。依照本领域常规，上述时间区间不应理解为对洗脱条件的限定，时间长短可依高效液相色谱仪厂家型号的不同进行相应调整。
所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液为先将固相合成的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶解、稀释得到还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，再将所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液氧化而得。
所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液的具体制备步骤如下：以Rink AmideMBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBt/DIC为缩合剂，依次逐个接上氨基酸；加入切肽试剂进行切肽，加入甲基叔丁基醚进行沉淀，得还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品；将所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品用50％乙酸/水溶液溶解，再用水稀释，得还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液；用碱性物质将所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液的pH调节至7.0-9.0，加入浓度为30％的双氧水进行氧化过程，每克还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品加0.5ml的30％的双氧水，得氧化型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，即为所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液。
其中，所述的切肽试剂可为本领域常规，较佳地为体积比为90：7.5：2.5的TFA/TIS/H2O。
其中，所述的碱性物质可为本领域常规，较佳地为NaOH。
本发明中，所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品的浓度为0.1～4mg/ml，较佳地为0.5～2mg/ml，例如，0.8mg/ml、1mg/ml和1.5mg/ml。
本发明中，所述的流动相A较佳地为体积百分比为0.02～0.05％的乙酸/水溶液。
所述的流动相B较佳地为体积百分比为0.02～0.05％的乙酸/乙腈。
所述的流动相C2较佳地为10～20mM NH4Ac-NH4OH水溶液。
所述的流动相C2的pH较佳地为7.5～8.5。
本发明中，所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中所述的缩宫素[+Gly]杂质的HPLC纯度为60％～85％，较佳地为70％～80％。
其中，所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中所述的缩宫素[+Gly]杂质的结构式为
Figure BDA0002051674620000041
本发明中，所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中的溶剂为含三氟乙酸和乙酸的水溶液。
本发明中，所述超耐水填料为
Figure BDA0002051674620000042
ODS-AQ超耐水填料，较佳地为苏州纳微科技股份有限公司提供的
Figure BDA0002051674620000043
ODS-AQ超耐水填料。所述的超耐水填料的孔径较佳地为7～10nm，所述的超耐水填料的粒径较佳地为10μm。
本发明中，所述的高效液相反相色谱法的检测波长为220nm。
所述的反相富集为所述的洗脱步骤(1)，所述的反相转盐为所述的洗脱步骤(2)～(3)，具体地，所述的洗脱步骤(2)为用所述的NH4Ac-NH4OH水溶液去除所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品中的三氟乙酸根的过程，所述的洗脱步骤(3)是去除所述的洗脱步骤(2)中的铵根离子的过程，所述的反相纯化为所述的洗脱步骤(4)和(5)，其中，所述的洗脱步骤(4)是去除较弱的吸附杂质的过程。
其中，所述的洗脱步骤(4)和(5)中的所述的洗脱液的转换速率是一个匀速变化的过程，所述的洗脱步骤(4)中所述匀速变化的速率为2％所述的流动相B/min，即每分钟在原洗脱液的基础上增加2％所述的流动相B，同时相应减少2％所述的流动相A；所述的洗脱步骤(5)中所述匀速变化的速率为0.333％所述的流动相B/min，即每分钟在原洗脱液的基础上增加0.333％所述的流动相B，同时相应减少0.333％所述的流动相A。
其中，步骤(5)结束后的72～73min，所述的洗脱液为80％所述的流动相A+20％所述的流动相B更换到50％所述的流动相A+50％所述的流动相B。73～85min，所述的洗脱液为50％所述的流动相A+50％所述的流动相B。通过快速提高有机相的比例，达到清洗色谱柱的目的。
缩宫素[+Gly]杂质是一种多肽物质，在高pH条件下不稳定，易降解，尤其是碱环境下，本发明综合考察了转盐洗脱的pH和时间，以保证减少转盐过程中样品的破坏及损失。
在某一较佳实施方式中，运用Load&Lock动态轴向压缩和静态锁紧技术，填料为所述的
Figure BDA0002051674620000051
ODS-AQ超耐水填料，孔径10nm，粒径10μm，装填至柱床压力为1000psi，采用Varian色谱装填系统，300g干粉状的所述的
Figure BDA0002051674620000052
ODS-AQ超耐水填料，600ml异丙醇搅拌匀浆后，倒入内径50mm的Load&Lock4002制备柱，压缩比为1.5:1，载气为N2，调节所述载气压力使得油压表压力为1500psi，动态轴向压缩至柱床高度25cm，作为反相富集、反相转盐和反相纯化方案所用的制备柱。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明采用在线富集的方法，利用填料的超耐水性能和吸附性能，先将多肽粗品溶液中粗肽吸附到固定相上进行富集，多肽和反相填料疏水结合。
(2)本发明采用在线富集，可直接变换流动相后进行梯度洗脱纯化，得到最终的纯品，适合连续的生产。
(3)本发明创新性地运用了反相吸附富集、转盐、除盐一步法制得多肽纯品，优化了生产工艺，适合工业化连续生产。
(4)本发明设计出超耐水填料的最新应用，柱平衡阶段、上样富集阶段和转盐阶段的流动相为含盐的水溶液，其流出液直接排至污水处理站，经简单处理后可回收利用，相对传统的制备工艺，大大的降低了危废的产生量，节约环保。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
HPLC法检测缩宫素[+Gly]杂质粗品和纯化后产品溶液纯度：
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪
分离柱：Waters XBridge-C18，4.6×150mm，5μm
流动相：A为体积百分比50％乙腈水溶液，B为0.02M KH2PO4pH 3.0水溶液，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，室温检测，洗脱梯度见下表所示，百分比为体积百分比。
洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～15min 35％A+65％B
2 15～25min 35％A+65％B→100％A
3 25～28min 100％A
4 28～28.1min 100％A→35％A+65％B
5 28.1～32min 35％A+65％B
下述实施例中，所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液为先将固相合成的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶解、稀释得到还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，再将所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液氧化而得。
所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液的具体制备步骤如下：以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBt/DIC为缩合剂，依次逐个接上氨基酸；加入切肽试剂进行切肽，加入甲基叔丁基醚进行沉淀，得还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品；将所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品用50％乙酸/水溶液溶解，再用水稀释，得还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液；用碱性物质将所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液的pH调节至7.0-9.0，加入浓度为30％的双氧水进行氧化过程，每克还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品加0.5ml的30％的双氧水，得氧化型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，即为所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液。其中，所述的切肽试剂为90：7.5：2.5的TFA/TIS/H2O。其中，所述的碱性物质为NaOH。
实施例1内径50mm Load&Lock4002制备柱装填
运用Load&Lock动态轴向压缩和静态锁紧技术，填料为所述的
Figure BDA0002051674620000071
ODS-AQ，孔径10nm，粒径10μm，装填至柱床压力为1000psi，采用Varian色谱装填系统，300g干粉状的所述的
Figure BDA0002051674620000072
ODS-AQ超耐水填料，600ml异丙醇搅拌匀浆后，倒入内径为50mm的Load&Lock4002制备柱，压缩比为1.5:1，载气为N2，调节所述载气压力使得油压表压力为1500psi，动态轴向压缩至柱床高度25cm，作为反相富集、反相转盐和反相纯化方案所用的制备柱。
实施例2缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液的反相富集、反相转盐和反相纯化
仪器：Varian SD-1高压液相制备系统
色谱柱：实施例1自装的制备柱Load&Lock400250×250mm，
Figure BDA0002051674620000081
ODS-AQ粒径为10μm，孔径为10nm
缩宫素[+Gly]杂质的结构式为
Figure BDA0002051674620000082
缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中的溶剂为含三氟乙酸和乙酸的水溶液，还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品的浓度为1mg/ml。
流动相A为体积百分比0.02％的乙酸/水溶液，流动相B为体积百分比0.02％的乙酸/乙腈，样品C1为缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，根据HPLC法测定的所述的缩宫素[+Gly]杂质HPLC纯度为73.33％，流动相C2为10mM的NH4Ac-NH4OH水溶液，流动相C2的pH为7.5。
本实施例的反相富集、反相转盐和反相纯化条件如下：流速为100ml/min，检测波长为220nm，纯化洗脱梯度见下表所示，百分比为体积百分比
Figure BDA0002051674620000083
收集保留时间为53～63min的洗脱液即得到缩宫素[+Gly]杂质溶液。根据HPLC法测定的所述的缩宫素[+Gly]杂质HPLC的纯度为99.67％。
实施例3缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液的反相富集、反相转盐和反相纯化
仪器：Varian SD-1高压液相制备系统
色谱柱：实施例1的制备柱Load&Lock400250×250mm，
Figure BDA0002051674620000091
ODS-AQ粒径为10μm，孔径为10nm
缩宫素[+Gly]杂质的结构式为
Figure BDA0002051674620000092
缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中的溶剂为含三氟乙酸和乙酸的水溶液，还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品的浓度为1.5mg/ml。
流动相A为体积百分比0.05％的乙酸/水溶液，流动相B为体积百分比0.05％的乙酸/乙腈，样品C1为缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，根据HPLC法测定的所述的缩宫素[+Gly]杂质HPLC的纯度为72.13％，流动相C2为20mM的NH4Ac-NH4OH水溶液，流动相C2的pH为8.5。
本实施例的反相富集、反相转盐和反相纯化条件如下：流速为100ml/min，检测波长为220nm，纯化洗脱梯度见下表所示，百分比为体积百分比。
Figure BDA0002051674620000093
收集保留时间为53～63min的洗脱液即得到缩宫素[+Gly]杂质溶液。根据HPLC法测定的所述的缩宫素[+Gly]杂质的HPLC的纯度为99.66％。
实施例4缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液的反相富集、反相转盐和反相纯化
仪器：Varian SD-1高压液相制备系统
色谱柱：实施例1的制备柱Load&Lock400250×250mm，填料为
Figure BDA0002051674620000094
ODS-AQ粒径为10μm，孔径为10nm缩宫素[+Gly]杂质的结构式为
Figure BDA0002051674620000101
缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中的溶剂为含三氟乙酸和乙酸的水溶液，还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品的浓度为0.8mg/ml。
流动相A为体积百分比为0.05％的乙酸/水溶液，流动相B为体积百分比0.05％的乙酸/乙腈，样品C1为缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，根据HPLC法测定的所述的缩宫素[+Gly]杂质的HPLC纯度为75.63％，流动相C2为20mM的NH4Ac-NH4OH水溶液，流动相C2的pH为7.5。
本实施例的反相富集、反相转盐和反相纯化条件如下：流速为100ml/min，检测波长为220nm，纯化洗脱梯度见下表所示，百分比为体积百分比。
Figure BDA0002051674620000102
收集保留时间为53～63min的洗脱液即得到缩宫素[+Gly]杂质溶液。根据HPLC法测定的所述的缩宫素[+Gly]杂质的HPLC的纯度为99.50％。
实施例5缩宫素[+Gly]杂质的质谱检测
采用Waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定实施例2、3和4得到的缩宫素[+Gly]杂质，测试条件为：采用电喷雾电离(ESI)源，在正离子电离模式下进行质谱分析，毛细管电离电压3.0kV，取样锥孔电压35kV；离子源温度115℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂氮气流速700L/h，锥孔反吹氮气50L/h，四级杆扫面范围50.0～1500m/z。
检测的结果为：分子离子峰[M+H]+质荷比(m/z)为1064.45，主要离子碎片峰[M+2H]2+质荷比(m/z)为532.73，都符合理论值(缩宫素[+Gly]杂质的相对分子质量为1064.27)。

Claims (10)

1.一种缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；
所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中所述的缩宫素[+Gly]杂质的结构式为
Figure 806408DEST_PATH_IMAGE001
，所述的高效液相反相色谱法 的填料为超耐水填料；所述的超耐水填料为UniSil ODS-AQ超耐水填料；
所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步的反相洗脱过程中完成；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化的条件如下：
Figure 362340DEST_PATH_IMAGE004
收集保留时间为53~63min的洗脱液即得到缩宫素[+Gly]杂质溶液；
所述的流动相A为体积百分比0.005~0.1%的乙酸/水溶液，所述的流动相B为体积百分比0.005~0.1%的乙酸/乙腈溶液，所述的样品C1为所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，所述的流动相C2为5~50mM NH4Ac-NH4OH水溶液，所述的流动相C2的pH为7.0~9.0，所述的洗脱液的流速为80~100ml/min。
2.如权利要求1所述的缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：在20~21min期间，将所述的洗脱液由所述的样品C1更换为所述的流动相C2；在31~32min期间，将所述的洗脱液由所述的流动相C2更换为所述的流动相A。
3.如权利要求1所述的缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液为先将固相合成的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶解、稀释得到还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液，再将所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液氧化而得。
4.如权利要求3所述的缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品的浓度为0.1~4mg/ml。
5.如权利要求4所述的缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：所述的还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中还原型缩宫素[+Gly]杂质粗品的浓度为0.5~2mg/ml。
6.如权利要求1所述的缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：
所述的流动相A为体积百分比为0.02~0.05%的乙酸/水溶液；
和/或，所述的流动相B为体积百分比为0.02~0.05%的乙酸/乙腈溶液；
和/或，所述的流动相C2为10~20 mM NH4Ac-NH4OH水溶液；
和/或，所述的流动相C2的pH为7.5~8.5；
和/或，所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中所述的缩宫素[+Gly]杂质的HPLC纯度为60%~85%。
7.如权利要求6所述的缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中所述的缩宫素[+Gly]杂质的HPLC纯度为70%~80%。
8.如权利要求1所述的缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：所述的缩宫素[+Gly]杂质粗品溶液中溶剂为含三氟乙酸和乙酸的水溶液。
9.如权利要求1所述的缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：所述的超耐水填料的孔径7~10nm，所述的超耐水填料的粒径10μm。
10.如权利要求1所述的缩宫素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：所述的高效液相反相色谱法的检测波长为220nm。
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