CN106518978B - 一种加压素[4-Glu，5-Asp]的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种加压素[4‑Glu,5‑Asp]的制备方法。该制备方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素[4‑Glu,5‑Asp]前体粗品溶液依次进行反相环化、反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯‑二乙烯基苯共聚物；所述的加压素[4‑Glu,5‑Asp]前体粗品为含两游离巯基的加压素[4‑Glu,5‑Asp]前体粗品。本发明创新性运用了反相吸附法环化、纯化和脱盐，一次性解决环化、纯化和脱盐的问题，优化了生产工艺，适合工业化连续生产。

Description

一种加压素[4-Glu，5-Asp]的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域。更具体地，本发明涉及一种加压素[4-Glu,5-Asp]的制备方法。
背景技术
加压素是由九个氨基酸残基组成的合成多肽，其化学结构为加压素的理论分子量1084.24。鞣酸加压素为抗利尿激素药，能促进远端肾小管及集合管对水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制剂临床用于治疗尿崩症。
目前国内加压素[4-Glu,5-Asp]大多先是采用固相合成保护加压素[4-Glu,5-Asp]树脂，再经过裂解干燥得加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品(Cys-Tyr-Phe-Glu-Asp-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2的三氟乙酸盐)，高度稀释环化，纯化，转盐等步骤，最终得到加压素[4-Glu,5-Asp]。高度稀释环化由于样品浓度稀，体积庞大，对于后期纯化很不利。现在还缺乏一种有效的制备含二硫键的多肽原料药的方法，因此仍然迫切需要开发新的含二硫键多肽的制备方法。
就一个药品而言，其中所含的少量杂质是引发药品副作用最重要的原因，因此对其纯度的检查是保证药品安全有效性的重要基础之一，而纯度检查的内容，根据各个药物的性质和特点有些不同，但基本上均要涉及各自的“有关物质”检查研究。合成多肽的有关物质主要来自合成过程中的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物、聚合物等杂质，尽管目前合成多肽的纯化工艺已经有了很大进步，但工艺杂质仍是合成多肽有关物质的重要来源，这主要是由于合成多肽的一些工艺杂质(如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换的产物等)与药物本身的性质可能非常近似，从而给纯化造成了一定的难度。研究表明合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中，天冬酰胺、谷胺酰胺和肽链C段酰胺易于发生脱酰胺反应(尤其是在pH值升高和高温条件下)。
由于合成多肽中有些杂质的性质与目标产品非常接近，因此建立适宜的方法充分检出这些杂质是合成多肽药物有关物质研究中面临的巨大困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中加压素[4-Glu,5-Asp]的制备工艺复杂、收率低、样品浓度稀、体积庞大的缺陷，而提供了一种加压素[4-Glu,5-Asp]的制备方法。本发明的加压素[4-Glu,5-Asp]的制备方法以含一对游离巯基(-SH)的多肽粗品——加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品为起始原料，经过高压液相反相色谱环化、纯化和脱盐步骤，制备高纯度的加压素[4-Glu,5-Asp]的方法。本发明的多肽是加压素制备过程中的1个关键杂质，因此可作为加压素检测过程的标准对照品，对加压素以及杂质进行定性和定量分析，对于提高加压素的质量标准，控制产品质量具有重要意义。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了一种加压素[4-Glu,5-Asp]的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液依次进行反相环化、反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物；
所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品为含两游离巯基的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品；
所述的加压素[4-Glu,5-Asp]为
其中，所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品较佳地为采用固相合成法经过裂解干燥制得的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品，HPLC纯度为60～90％；所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品的结构式为Cys-Tyr-Phe-Glu-Asp-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2的三氟乙酸盐。
其中，所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液较佳地为加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
本发明中，所述的反相环化、反相纯化、反相脱盐均是在一步的反相洗脱过程中完成。
其中，所述的反相环化、反相纯化、反相脱盐的条件优选如下：流动相A1为纯水，A2为体积百分比0.01～0.05％(较佳的为0.02～0.03％)的H2O2pH为7.5～9.0的NaOH水溶液，流动相B为乙腈，流动相C1为所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液，流动相C2为0.1mol/L的NaOH溶液，流速为180～220mL/min(较佳的为200mL/min)，检测波长为220nm；
按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；
洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～10min 100％C1
2 10.1～25min 75％A1+5％B+20％C2
3 25.1～40min 95％A1+5％B
4 40.1～45min 95％A2+5％B
5 45.1～60min 95％A1+5％B
6 60～75min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
7 75～90min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
8 90～105min 50％A1+50％B
9 105～115min 95％A1+5％B
收集保留时间为75～90min的洗脱液即得到加压素[4-Glu,5-Asp]溶液。
其中，所述的高效液相反相色谱法的装填条件优选如下：填料为安捷伦PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，孔径10nm，粒径10μm。
加压素[4-Glu,5-Asp]是一种多肽物质，在碱性条件下不稳定，易降解，尤其是强碱环境下，本发明综合考察了碱洗脱的浓度和时间，以保证减少脱盐过程中样品的破坏及损失。
本发明创新点在于将环化、纯化和脱盐一步反相得到多肽纯品，加压素[4-Glu,5-Asp]含有两巯基并含有碱性氨基酸，传统工艺环化和纯化分步进行，而且环化的体积庞大，增加了纯化的难度，为了快速高效的环化和制备工艺，设计出聚合物填料PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯的最新应用。本发明创新性运用了反相吸附法环化、纯化和脱盐，一次性解决环化、纯化和脱盐的问题。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明采用在线环化的方法，先将还原型多肽粗品吸附到固定相上，利用多肽和反相填料的疏水结合，在色谱柱上先碱性洗脱强结合的酸根离子、再中性洗脱游离的羟基，并采用pH偏碱的含H2O2的流动相冲洗，促使两巯基成二硫键，获得目标多肽粗品，样品保留在色谱柱上。
(2)本发明采用在线环化，环化的样品避免洗脱，可直接变换流动相后进行梯度洗脱纯化，得到最终的纯品，适合连续的生产。
(3)本发明创新性地运用了反相吸附环化、纯化、脱盐一步法制得多肽纯品，优化了生产工艺，适合工业化连续生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，加压素[4-Glu,5-Asp]为
实施例1
实施例1(HPLC法检测加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品和纯化后产品溶液纯度)
仪器：Waters 2695/2489高效液相色谱仪
分离柱：Agilent XDB-C18 4.6×250mm，5μm
流动相：A为体积百分比为0.1％TFA水溶液，B为体积百分比为0.1％TFA-50％的乙腈水溶液(TFA为三氟乙酸)
流速为1.0mL/min，检测波长为214nm，室温检测，洗脱梯度见下表，百分比为体积百分比。
洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～5min 95％A+5％B
2 5～25min 95％A+5％B→50％A+50％B
3 25～30min 100％B
4 30～35min 95％A+5％B
实施例2(75mm内径L&L4003制备柱装填)
运用Load&Lock动态轴向压缩和静态锁紧技术，填料为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(反相填料安捷伦PLRP-S)，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度0.33g/mL，装填至柱床压力650psi，采用Varian色谱装填系统，370g干粉填料，2L甲醇搅拌匀浆后，倒入内径75mm L&L4003制备柱，压缩比为3:1，载气为N2，调节载气压力使得油压表压力为2000psi，动态轴向压缩至柱床高度26cm，作为反相环化、反相纯化和反相脱盐方案所用的制备柱。
实施例3加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品原料的反相环化、反相纯化和反相脱盐
仪器：Varian SD-1高压液相制备系统
色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock4003 75×260mm，PLRP-S 10μm 10nm
加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品为采用固相合成法经过裂解干燥制得的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品，结构式为Cys-Tyr-Phe-Glu-Asp-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2的三氟乙酸盐。
加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液为上述加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
流动相A1为纯化水，A2为体积百分比0.03的H2O2pH为7.5的NaOH水溶液，流动相B为乙腈，流动相C1为所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液(采用固相合成法制得的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品)，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为80.25％，保留时间为12.4min，流动相C2为0.1M的NaOH溶液。
本实施例的反相环化、反相纯化和反相脱盐条件如下：流速200mL/min，220nm检测，纯化洗脱梯度见下表所示，百分比为体积百分比。
洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～10min 100％C1
2 10.1～25min 75％A1+5％B+20％C2
3 25.1～40min 95％A1+5％B
4 40.1～45min 95％A2+5％B
5 45.1～60min 95％A1+5％B
6 60～75min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
7 75～90min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
8 90～105min 50％A1+50％B
9 105～115min 95％A1+5％B
收集保留时间为75～90min的洗脱液得到加压素[4-Glu,5-Asp]溶液。按实施例1的方法测定其HPLC纯度为99.65％，保留时间为9.43min。
实施例4加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品原料的反相环化、反相纯化和反相脱盐
仪器：Varian SD-1高压液相制备系统
色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock4003 75×260mm，PLRP-S 10μm 10nm
加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品为采用固相合成法经过裂解干燥制得的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品，结构式为Cys-Tyr-Phe-Glu-Asp-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2的三氟乙酸盐。
加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液为上述加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
流动相A1为纯化水，A2为体积百分比0.02的H2O2pH为9.0的NaOH水溶液，流动相B为乙腈，流动相C1为所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液(采用固相合成法制得的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品)，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为80.25％，保留时间为12.4min，流动相C2为0.1M的NaOH溶液。
本实施例的反相环化、反相纯化和反相脱盐条件如下：流速200mL/min，220nm检测，纯化洗脱梯度见下表所示，百分比为体积百分比。
洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～10min 100％C1
2 10.1～25min 75％A1+5％B+20％C2
3 25.1～40min 95％A1+5％B
4 40.1～45min 95％A2+5％B
5 45.1～60min 95％A1+5％B
6 60～75min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
7 75～90min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
8 90～105min 50％A1+50％B
9 105～115min 95％A1+5％B
收集保留时间为75～90min的洗脱液得到加压素[4-Glu,5-Asp]溶液。按实施例1的方法测定其HPLC纯度为99.63％，保留时间为9.42min。
实施例5(加压素[4-Glu,5-Asp]的质谱检测)
采用waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定实施例3、4得到的加压素[4-Glu,5-Asp]的分子质量峰[M+1]+测定值1087.30，主要离子碎片峰[M+2]2+测定值544.19，都符合理论值1086.24。

Claims (8)

1.一种加压素[4-Glu,5-Asp]的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液依次进行反相环化、反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物；
所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品为含两游离巯基的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品；
所述的加压素[4-Glu,5-Asp]为
所述的反相环化、反相纯化、反相脱盐的条件如下：流动相A1为纯水，A2为体积百分比0.01～0.05％的H2O2 的NaOH水溶液，pH 为 7.5 ～ 9.0 ， 流动相B为乙腈，流动相C1为所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液，流动相C2为0.1mol/L的NaOH溶液，流速为180～220mL/min，检测波长为220nm；
按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；
洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液 1 0～10min 100％C1 2 10.1～25min 75％A1+5％B+20％C2 3 25.1～40min 95％A1+5％B 4 40.1～45min 95％A2+5％B 5 45.1～60min 95％A1+5％B 6 60～75min 95％A1+5％B→80％A1+20％B 7 75～90min 80％A1+20％B→73％A1+27％B 8 90～105min 50％A1+50％B 9 105～115min 95％A1+5％B
收集保留时间为75～90min的洗脱液即得到加压素[4-Glu,5-Asp]溶液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品为采用固相合成法经过裂解干燥制得的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品，HPLC纯度为60～90％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品的结构式为Cys-Tyr-Phe-Glu-Asp-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2的三氟乙酸盐。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶液为加压素[4-Glu,5-Asp]前体粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反相环化、反相纯化、反相脱盐均是在一步的反相洗脱过程中完成。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的A2为体积百分比0.02～0.03％的H2O2 的NaOH水溶液， pH 为 7.5 ～ 9.0 。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的流速为200mL/min。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的高效液相反相色谱法的装填条件如下：填料为安捷伦PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，孔径10nm，粒径10μm。
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