CN106749528B - 一种奥曲肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种奥曲肽的制备方法。该制备方法包括下述步骤:采用高效液相反相色谱法将奥曲肽前体粗品溶液依次进行反相环化、反相纯化、反相脱盐,即可;高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯‑二乙烯基苯共聚物;所述的奥曲肽前体粗品为含两游离巯基的奥曲肽前体粗品。本发明的制备方法运用了反相吸附环化、纯化、除盐一步法制得多肽纯品,优化了生产工艺,适合工业化连续生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域。更具体地,本发明涉及一种奥曲肽的制备方法。
背景技术
醋酸奥曲肽(Octreotide acetate),是由七个氨基酸残基和一个苏氨醇组成的合成多肽,化学结构为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨醇(2→7)-二硫化物醋酸盐,奥曲肽的理论分子量为1019.26,其原料药冻干粉中醋酸含量为5%~12%。醋酸奥曲肽可抑制生长激素,抑制胃肠胰脏分泌多肽等,其制剂临床用于需要长期奥曲肽治疗的活动性肢端肥大症,如术后生长激素残留致血清生长激素水平增高,垂体外照射放射治疗后尚未达到充分疗效的血清生长激素水平升高,部分不适合手术治疗及新诊断生长激素分泌腺瘤患者的术前治疗。
目前国内奥曲肽大多先是采用固相合成保护奥曲肽树脂,再经过裂解干燥得奥曲肽前体粗品(D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨醇的三氟乙酸盐),再高度稀释环化,纯化,转盐等步骤,最终得到奥曲肽醋酸盐。高度稀释环化由于样品浓度稀,体积庞大,对于后期纯化很不利。现在还缺乏一种有效的制备含二硫键的多肽原料药的方法,因此仍然迫切需要开发新的含二硫键多肽的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中奥曲肽的制备工艺复杂、收率低、样品浓度稀、体积庞大的缺陷,而提供了一种奥曲肽的制备方法。本发明的奥曲肽的制备方法以含一对游离巯基(-SH)的多肽粗品——奥曲肽前体粗品为起始原料,经过一步高效液相反相色谱进行环化、纯化和除盐步骤,制备高纯度的奥曲肽的方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:
本发明提供了一种奥曲肽的制备方法,其包括下述步骤:采用高效液相反相色谱法将奥曲肽前体粗品溶液依次进行反相脱盐、反相环化、反相纯化,即可;高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物;
所述的奥曲肽前体粗品为含两游离巯基的奥曲肽前体粗品。
其中,所述的奥曲肽前体粗品较佳地为采用固相合成法经过裂解干燥制得的奥曲肽前体粗品,HPLC纯度为60~90%;所述的奥曲肽前体粗品的结构式为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨醇的三氟乙酸盐。
其中,所述的奥曲肽前体粗品溶液较佳地为奥曲肽前体粗品溶于体积百分比浓度为5%的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
本发明中,所述的反相脱盐、反相环化、反相纯化均是在一步的反相洗脱过程中完成。
其中,所述的反相脱盐、反相环化、反相纯化的条件优选如下:流动相A1为纯水,A2为体积百分比0.01~0.05%(较佳的为0.02~0.03%)的H2O2pH为7.5~9.0的NaOH水溶液,流动相B为乙腈,流动相C1为所述的奥曲肽前体粗品溶液,流动相C2为0.1mol/L的NaOH溶液,流速为180~220mL/min(较佳的为200mL/min),检测波长为220nm;
按照下表的条件进行在线上样、洗脱,百分比为体积百分比;
收集保留时间为75~90min的洗脱液即得到奥曲肽溶液。
其中,所述的高效液相反相色谱法的装填条件优选如下:填料为安捷伦PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物,孔径10nm,粒径10μm。
奥曲肽是一种多肽物质,在碱性条件下不稳定,易降解,尤其是强碱环境下,本发明综合考察了碱洗脱的浓度和时间,以保证减少脱盐过程中样品的破坏及损失。
本发明创新点在于将环化、纯化和除盐一步反相得到多肽纯品,奥曲肽前体含有两游离巯基并含有碱性氨基酸,传统工艺环化和纯化分步进行,而且环化反应时样品高度稀释,体积庞大,增加了纯化的难度,为了快速高效的环化和制备工艺,设计出聚合物填料PLRP-S的最新应用。本发明创新性运用了反相吸附法环化、纯化和除盐,一次性解决环化、纯化和除盐的问题。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
(1)本发明采用在线环化的方法,先将还原型多肽粗品吸附到固定相上,利用多肽和反相填料的疏水结合,在色谱柱上先碱性洗脱强结合的酸根、再中性洗脱游离的羟基,并采用pH偏碱的含H2O2的流动相冲洗,促使两巯基成二硫键,获得目标多肽粗品,样品保留在色谱柱上。
(2)本发明采用在线环化,环化的样品避免洗脱,可直接变换流动相后进行梯度洗脱纯化,得到最终的纯品,适合连续的生产。
(3)本发明创新性地运用了反相吸附环化、纯化、除盐一步法制得多肽纯品,优化了生产工艺,适合工业化连续生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1(HPLC法检测奥曲肽前体粗品和纯化后产品溶液纯度)
仪器:Waters 2695/2489高效液相色谱仪
分离柱:Kromasil 100-3.5C18column 4.6×100mm
流动相:A为10%四甲基氢氧化铵:水:乙腈体积百分比为2:88:10的水溶液,B为10%四甲基氢氧化铵:水:乙腈体积百分比为2:38:60的水溶液。
流速为0.8mL/min,检测波长为210nm,室温检测,
洗脱梯度见下表所示,百分比为体积百分比。
流动相洗脱梯度
洗脱步骤 | 洗脱时间 | 洗脱液 |
1 | 0~30min | 73%A+27%B |
2 | 30~31min | 73%A+27%B→55%A+45%B |
3 | 31~37min | 73%A+27%B |
实施例2(75mm内径L&L4003制备柱装填)
运用Load&Lock动态轴向压缩和静态锁紧技术,填料为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(反相填料安捷伦PLRP-S),孔径10nm,粒径10μm,装柱密度0.33g/mL,装填至柱床压力650psi,采用Varian色谱装填系统,370g干粉填料,2L甲醇搅拌匀浆后,倒入内径75mm L&L4003制备柱,压缩比为3:1,载气为N2,调节载气压力使得油压表压力为2000psi,动态轴向压缩至柱床高度26cm,作为反相脱盐、反相环化和反相纯化方案所用的制备柱。
实施例3奥曲肽前体粗品原料的反相脱盐、反相环化和反相纯化仪器:Varian SD-1高压液相制备系统
色谱柱:实施例2自装的制备柱Load&Lock4003 75×260mm,PLRP-S10μm 10nm
奥曲肽前体粗品为采用固相合成法经过裂解干燥制得的奥曲肽前体粗品,结构式为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨醇的三氟乙酸盐。
奥曲肽前体粗品溶液为上述奥曲肽前体粗品溶于体积百分比浓度为5%的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
流动相A1为纯水,A2为体积百分比0.02%的H2O2pH为7.5的NaOH水溶液,流动相B为乙腈,流动相C1为所述的奥曲肽前体粗品溶液,按实施例1的方法测定其HPLC纯度为80.50%,保留时间为8.59min,流动相C2为0.1M的NaOH溶液。
本实施例的反相脱盐、反相环化、反相纯化条件如下:流速200mL/min,220nm检测,洗脱梯度见下表所示,百分比为体积百分比。
洗脱步骤 | 洗脱时间 | 洗脱液 |
1 | 0~10min | 100%C1 |
2 | 10.1~25min | 75%A1+5%B+20%C2 |
3 | 25.1~40min | 95%A1+5%B |
4 | 40.1~45min | 95%A2+5%B |
5 | 45.1~60min | 95%A1+5%B |
6 | 60~75min | 95%A1+5%B→80%A1+20%B |
7 | 75~90min | 80%A1+20%B→73%A1+27%B |
8 | 90~105min | 50%A1+50%B |
9 | 105~115min | 95%A1+5%B |
收集保留时间为75~90min的洗脱液得到奥曲肽溶液。按实施例1的方法测定其HPLC纯度为99.26%,保留时间为8.70min。
实施例4奥曲肽前体粗品原料的反相脱盐、反相环化和反相纯化
仪器:Varian SD-1高压液相制备系统
色谱柱:实施例2自装的制备柱Load&Lock4003 75×260mm,PLRP-S10μm 10nm
奥曲肽前体粗品为采用固相合成法经过干燥裂解制得的奥曲肽前体粗品,结构式为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨醇的三氟乙酸盐。
奥曲肽前体粗品溶液为上述奥曲肽前体粗品溶于体积百分比浓度为5%的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
流动相A1为纯水,A2为体积百分比0.03%的H2O2 pH为9.0的NaOH水溶液,流动相B为乙腈,流动相C1为所述的奥曲肽前体粗品溶液,按实施例1的方法测定其HPLC纯度为80.50%,保留时间为8.59min,流动相C2为0.1M的NaOH溶液。
本实施例的反相脱盐、反相环化和反相纯化条件如下:流速200mL/min,220nm检测,洗脱梯度见下表所示,百分比为体积百分比。
洗脱步骤 | 洗脱时间 | 洗脱液 |
1 | 0~10min | 100%C1 |
2 | 10.1~25min | 75%A1+5%B+20%C2 |
3 | 25.1~40min | 95%A1+5%B |
4 | 40.1~45min | 95%A2+5%B |
5 | 45.1~60min | 95%A1+5%B |
6 | 60~75min | 95%A1+5%B→80%A1+20%B |
7 | 75~90min | 80%A1+20%B→73%A1+27%B |
8 | 90~105min | 50%A1+50%B |
9 | 105~115min | 95%A1+5%B |
收集保留时间为75~90min的洗脱液得到奥曲肽溶液。按实施例1的方法测定其HPLC纯度为99.50%,保留时间为8.73min。
实施例5(奥曲肽的质谱检测)
采用waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定实施例3、4得到的奥曲肽的分子质量峰[M+1]+测定值1020.38,主要离子碎片峰[M+2]2+测定值510.73,都符合理论值1019.26。
Claims (8)
1.一种奥曲肽的制备方法,其包括下述步骤:采用高效液相反相色谱法将奥曲肽前体粗品溶液依次进行反相脱盐、反相环化、反相纯化,即可;所述的反相脱盐、反相环化、反相纯化均是在一步的反相洗脱过程中完成;高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物;
所述的奥曲肽前体粗品为含两游离巯基的奥曲肽前体粗品;
所述的反相脱盐、反相环化、反相纯化的条件如下:流动相A1为纯水,A2为体积百分比0.01~0.05%的H2O2、pH为7.5~9.0的NaOH水溶液,流动相B为乙腈,流动相C1为所述的奥曲肽前体粗品溶液,流动相C2为0.1mol/L的NaOH溶液,
按照下表的条件进行在线上样、洗脱,百分比为体积百分比;
收集保留时间为75~90min的洗脱液即得到奥曲肽溶液。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的奥曲肽前体粗品为采用固相合成法经过裂解干燥制得的奥曲肽前体粗品,HPLC纯度为60~90%。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的奥曲肽前体粗品的结构式为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨醇的三氟乙酸盐。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的奥曲肽前体粗品溶液为奥曲肽前体粗品溶于体积百分比浓度为5%的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述洗脱液的流速为180~220mL/min;所述高效液相反相色谱法的检测波长为220nm。
6.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的A2为体积百分比0.02~0.03%的H2O2、pH为7.5~9.0的NaOH水溶液。
7.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述的流速为200mL/min。
8.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的高效液相反相色谱法的装填条件如下:填料为安捷伦PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,孔径10nm,粒径10μm。
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