CN106565827B - 一种高度纯化糖肽类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高度纯化糖肽类化合物的方法，通过色谱分离技术将糖肽类化合物从其所在混合溶液中纯化出来。本发明的色谱分离技术采用反相色谱法，并采用梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱液流动相A和B分别是酸溶液和95％乙醇。本发明方法操作简单、可靠、准确，消除了干扰因素，大大缩短了生产时间，可用于糖肽类化合物，特别是万古霉素和含有此化合物的药物组合物的生产。
Description
技术领域
本发明涉及糖肽类化合物的制备领域，具体涉及一种通过色谱分离技术纯化糖肽类化合物的方法。
背景技术
万古霉素属于糖肽类大分子抗生素，结构如下所示：
万古霉素
万古霉素是1956年由印度尼西亚土壤中得到的东方链霉素菌中分离获得的，由美国Lilly公司开发成产品，于1956年获得FDA批准上市，在临床上应用数十年之久。万古霉素(Vancomycin)在临床上主要用于严重的革兰氏阳性菌，特别是MRSA、MRSE及肠球菌感染，包括败血症、心内膜炎、骨膜炎、化脓性关节炎、肺炎、脑膜炎等。
万古霉素发酵液为多组分化合物，传统的生产工艺是以常规离子交换树脂、大孔树脂、氧化铝层析柱为基础纯化，周期长，生产过程废水多，加之糖肽类化合物万古霉素稳定性差，不利于制备万古霉素B色谱纯度＞98.0％的高度纯化糖肽类化合物。
因此，有必要寻求一种方法，可以高效、操作简单、可靠、高度纯化糖肽类化合物，以用于万古霉素及其他糖肽类化合物的制备。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种可高度纯化糖肽类化合物的方法，特别是从发酵液中高效分离纯化万古霉素。
本发明的技术方案如下：
一种高度纯化糖肽类化合物的方法，通过色谱分离技术将糖肽类化合物从其所在混合溶液中纯化出来，其特征在于，所述色谱分离技术采用反相色谱法，并采用梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱液流动相A和B分别是酸溶液和95％(V/V)乙醇。
在本发明的实施例中，所述糖肽类化合物为万古霉素，也可以是含有万古霉素的药物组合物。
优选的，作为梯度洗脱流动相A的酸溶液为0.1％(V/V)醋酸。
在本发明的实施例中，所述梯度洗脱的程序设定为：流速1.0mL/min，按时间分段：0～30min按体积百分比计，流动相A从100％至92％，流动相B从0％至8％；30～40min按体积百分比计，流动相A从92％至20％，流动相B从8％至80％；40min之后为100％的流动相A。具体的梯度洗脱程序如下表所示：
表1
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.01 | 100 | 0 |
| 30 | 92 | 8 |
| 40 | 20 | 80 |
| 40.01 | 100 | 0 |
| 45 | 100 | 0 |
优选的，本发明的制备色谱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶柱(C18)或辛烷基硅烷键合硅胶柱(C8)。
在进行万古霉素的分离纯化时，通常先将其发酵液调pH2-3，然后加助剂(例如15％的硅藻土)便于分层过滤，依次进行陶瓷膜过滤，0.2μm聚醚砜折叠试过滤器过滤，滤液根据上述方法上色谱柱分离纯化。
1.本发明高度纯化糖肽类化合物的方法与现有技术相比，具有以下优点和积极效果：本发明得到可用于糖肽类化合物，特别是万古霉素和含有此化合物的药物组合物的生产。使用色谱分离技术，消除了干扰因素、大大缩短了生产时间，操作简单、可靠、准确，改变了以往的操作步骤多、干扰因素较多等因素，因此是进行高度纯化糖肽类化合 物工业化生产的有效手段。
附图说明
图1是利用本发明方法纯化后的万古霉素的色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在以下实施例中，确认万古霉素纯化质量的分析方法为《中国药典》2010版第二部盐酸万古霉素原料检测方法。具体为：
1、色谱系统
色谱柱：C18，4.6mm×25cm，5μm
流速：1.0mL/min
柱温：25℃
检测波长：280nm
进样量：20μL
运行时间：30min
流动相：
流动相A：取4mL三乙胺，加入1996mL水，用磷酸试液调节pH值为3.2；取该溶液920mL，加入10mL四氢呋喃和70mL乙腈，即得。
流动相B：取4mL三乙胺，加入1996mL水，用磷酸试液调节pH值为3.2；取该溶液700mL，加入10mL四氢呋喃和290mL乙腈，即得。
梯度系统：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 13 | 100 | 0 |
| 22 | 0 | 100 |
| 26 | 0 | 100 |
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些例子不应被理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1：万古霉素的纯化
取万古霉素发酵液调pH2，加15％的硅藻土助剂分层过滤，陶瓷膜过滤，通过0.2μm聚醚砜折叠试过滤器后上色谱纯化分离。
色谱柱：C8，50mm×250cm，10μm
流速：1.0mL/min
柱温：室温
检测波长：280nm
流动相：流动相A为0.1％醋酸；流动相B为95％乙醇。
梯度系统：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.01 | 100 | 0 |
| 30 | 95 | 5 |
| 40 | 30 | 70 |
| 40.01 | 100 | 0 |
| 45 | 100 | 0 |
纯化得到的万古霉素按照《中国药典》2010版第二部盐酸万古霉素原料检测方法分析，万古霉素B色谱纯度＞99.0％。
实施例2：万古霉素的纯化
取万古霉素发酵液调pH3，15％的硅藻土助剂分层过滤，陶瓷膜过滤，通过0.2μm聚醚砜折叠试过滤器后上色谱纯化分离。
色谱柱：C18，50mm×250cm，10μm
流速：1.0mL/min
柱温：室温
检测波长：280nm
流动相：流动相A为0.1％醋酸；流动相B为95％乙醇。
梯度系统：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.01 | 100 | 0 |
| 30 | 92 | 8 |
| 45 | 20 | 80 |
| 40.01 | 100 | 0 |
| 45 | 100 | 0 |
纯化得到的万古霉素按照《中国药典》2010版第二部盐酸万古霉素原料检测方法分析，万古霉素B色谱纯度＞100.0％。图1为色谱分离纯化后的万古霉素色谱图。
Claims (2)
1.一种高度纯化糖肽类化合物的方法，通过色谱分离技术将糖肽类化合物从其所在混合溶液中纯化出来，其特征在于，所述糖肽类化合物为万古霉素，将万古霉素的发酵液调pH2-3，然后加便于分层过滤的助剂，依次进行陶瓷膜过滤，0.2μm聚醚砜折叠试过滤器过滤，滤液通过色谱分离技术将万古霉素分离纯化出来；所述色谱分离技术采用反相色谱法，并采用梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱液流动相A和B分别是酸溶液和95％乙醇，所述酸溶液为为0.1％醋酸，所述梯度洗脱的程序设定为：流速1.0mL/min，按时间分段：0～30min按体积百分比计，流动相A从100％至92％，流动相B从0％至8％；30～40min按体积百分比计，流动相A从92％至20％，流动相B从8％至80％；40min之后为100％的流动相A；采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱或辛烷基硅烷键合硅胶柱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述助剂为硅藻土。
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