CN109666065B - 一种快速制备高纯度达托霉素的方法 - Google Patents

一种快速制备高纯度达托霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速制备高纯度达托霉素的方法，该方法是将达托霉素溶液先通过一次粗颗粒聚酰胺填料进行层析，去除干扰层的大量杂质，再使用制备级球形聚酰胺颗粒进行分离，获得高纯度达托霉素。本发明方法操作简单，获得的达托霉素纯度高，分离速度快，生产周期大大缩短，减少了废水量，相对于现有技术使用低浓度有机溶剂作为解吸剂，对操作人员更安全，环境更友好，同时避免了回收低浓度有机溶剂所带来的高能源的消耗，降低生产成本，值得推广使用。

Description

一种快速制备高纯度达托霉素的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵制药技术领域，具体地说涉及一种快速制备高纯度达托霉素的方法。
背景技术
达托霉素 ( Daptomycin ) 是由Lilly（礼来）公司最初研究，Cubist制药公司开发的一环脂肽类抗生素。应病人对新型耐药抗生素的迫切需求，2003年底，美国食品与药物管理局（FDA）经过快速审理程序批准注射用达托霉素 ( Daptomycin )（商品名cubicin）用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。达托霉素的作用机制与其他抗生素不同，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的，因此细菌对达托霉素产生耐药性可能会比较困难。
目前达托霉素的纯化工艺主要为：采用陶瓷膜或者板框处理发酵液，得到的滤液通过多次层析的方式得到。其层析的方法主要为离子交换（例如中国专利CN201210230891.0、CN200910085837.X），制备级反相硅胶填料分离（例如中国专利CN201080008292.3、CN200910058577.7），疏水性大孔树脂（例如中国专利CN01821937.3、CN201210125075.3）；在纯化过程中基本会混合使用这三种层析方式的两种以上。由于达托霉素稳定性较差，纯化过程较长往往会导致新杂质的产生，这些杂质有很大一部分是很难用层析的方法再次去除（或者成本高工业化无法接受），所以基本的层析工艺后都需要对达托霉素进行结晶进一步提高纯度。这个结晶过程需要将达托霉素转化成钙盐，再用有机溶剂结晶，该纯化过程中不仅有机溶剂用量大，难以重复使用，结晶体还需要脱掉达托霉素上的钙离子，才能进一步冻干成成品，从而导致操作工艺繁琐，工艺周期进一步加长，风险增多。结晶过程有25%以上的收率损失，加上树脂脱钙离子操作，最终的收率损失会超过35%。
另一方面，现有技术纯化达托霉素工艺中，使用疏水性大孔树脂、反相硅胶制备填料分离达托霉素，或者填料再生、平衡的时候都需要使用到有机溶剂，且很大一部分是低浓度的有机溶剂水溶液，回收能源消耗大，直接排放又会带来环保问题（不少反相硅胶制备填料层析工艺使用的溶剂是乙腈、甲醇类毒性较大的溶剂）。为了适应环境友好型、资源节约型社会的发展，迫切需要研发一种成本低、操作方便、降低有机溶剂用量、纯化效果好的制备高纯度达托霉素的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术在达托霉素纯化方面的技术不足，提供一种高纯度达托霉素的制备方法。
发明人在实验中意外发现了聚酰胺填料在层析过程中对于达托霉素的特异选择性，其分离效果包含了单一离子交换和疏水性大孔大孔树脂的分离优点，却又比它们单一分离的效果更加优秀，这是发明人始料未及的。
本申请首先提供一种快速制备高纯度达托霉素的方法，包括以下步骤：
（1）将pH为2.5-3.0的达托霉素溶液使用填料1进行吸附；解吸附，收集解吸液；
（2）步骤（1）的解吸液脱盐浓缩，调整pH2.5-5.0，使用填料2进行吸附；解吸附，收集解吸液；所述填料2的粒径小于所述填料1的粒径；
（3）步骤（2）的解吸液经脱内毒素、脱盐、浓缩后冻干。
步骤（1）达托霉素溶液通过以下方法制备得到：
①达托霉素发酵液通过陶瓷膜过滤或者板框过滤得到滤液；
②将滤液用酸调节到pH3.5-3.7，过滤，去掉清液，保留沉淀物；
③在pH8-10的水溶液中将沉淀物溶解，并使用0.22-0.45微米孔径的过滤介质过滤澄清。
本发明的方法中，填料1为75-150μm的聚酰胺颗粒，优选球形聚酰胺颗粒。
本发明方法中，步骤（1）解吸附为使用pH6.0-8.0、浓度为0.01-0.1%的缓冲盐溶液，所述缓冲盐为乙酸钠、乙酸铵、磷酸钠、磷酸铵、二乙胺，三乙胺、碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸钠、碳酸氢钠，优选碳酸氢铵、碳酸氢钠。
优选地，缓冲盐溶液pH7.0-8.0、浓度为0.05%。
本发明提供了快速制备高纯度达托霉素的方法中，步骤（2）所述的解吸液脱盐浓缩，是指步骤（1）获得的解吸液经过纳滤膜系统脱盐，浓缩至10-50 mg/ml；然后调整浓缩液pH为3.0-4.0使用填料2进行吸附。
本发明方法中，所述填料2为20-30μm的聚酰胺颗粒，优选球形聚酰胺颗粒。
步骤（2）使用填料2吸附后，解吸附，收集色谱纯度≥97%的达托霉素的解吸液。
具体地，所述的解吸附是采用pH5.0-8.0的不同pH的缓冲盐溶液梯度解吸。
采用pH5.0-8.0的不同pH的缓冲盐溶液梯度解吸的方法为：
①采用氨水调节至pH5.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第一次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
②采用氨水调节至pH6.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第二次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
③采用氨水调节至pH6.5的0.2％氯化钠-0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第三次洗脱，洗脱体积为6倍填料2体积。
本发明的方法中，步骤（2）采用带分布器的中高压层析柱进行吸附，填料装填高度为300-450 mm；
步骤（3）经超滤膜系统脱掉内毒素，再使用纳滤膜系统脱盐，浓缩至50-100 mg/ml，进行冻干。
本发明通过对发酵滤液中达托霉素进行沉淀，去除了大量色素、杂蛋白、多糖类杂质后，使用75-150微米粒径聚酰胺（前述填料1）层析，进一步去除了大量影响层析的杂质，再使用制备级球形聚酰胺颗粒（前述填料2）进行分离，一次达到高纯度达托霉素。由于聚酰胺对达托霉素优秀的吸附能力，根据发酵液来料质量的不同，聚酰胺吸附量最高可以到33g/L（达托霉素重量/填料体积）的吸附量，而目前同等粒径分离达托霉素主流使用的离子交换树脂吸附量为10-12 g/L，疏水性大孔树脂为15-20 g/L，为了获得更好的分离效果和收率，实际生产中往往降低1/3-1/2达托霉素量上柱。
由于使用了颗粒更大的聚酰胺填料进行初纯化，后续使用20-30微米粒径的聚酰胺填料能够直接分离得到高纯度的达托霉素。且由于是同样结构的填料，所以层析过程中不能解吸附的杂质极少，这就免去了每次层析完成后都需要再生的过程，大大节省了时间，加上中/高压制备柱在分离效能上的优势，使用带分布器的中/高压制备柱，分离速度快，生产周期大大缩短，生产废水量也大大减少。达托霉素在整个生产过程停留时间短，降解杂质少，不进行结晶也可以得到高纯度的达托霉素。相对其它工艺中使用低浓度有机溶剂作为解吸剂，既相对安全，也避免了由于要回收低浓度有机溶剂而带来的高能源的消耗。
本发明全程都不使用有机溶剂，能耗少，对生产环境要求低，适合工艺推广，作为填料的聚酰胺价格便宜，来源广泛，无害化处理过程也比硅胶基质填料更容易。本发明相对已有报道的工艺更绿色环保，更符合对构建环境友好型、资源节约型社会的要求。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本实施例起始所用的达托霉素溶液通过以下方法制得：
①达托霉素发酵液通过陶瓷膜过滤或者板框过滤得到滤液；
②将滤液用酸调节到pH3.5-3.7，过滤，去掉清液，保留沉淀物；
③在pH8-10的水溶液中将沉淀物溶解，并使用0.22-0.45微米孔径的过滤介质过滤澄清。
实施例1
将达托霉素溶液调节pH3.0上75-150 μm的球形聚酰胺树脂，上柱完，0.05%的碳酸氢铵溶液pH8.0解吸，收集黄色解吸液。所得解吸液经过截留分子量为300-500的纳滤膜系统纳滤浓缩至20mg/ml，并调节pH3.0上带分布器的中高压层析柱，该柱中填料为20-30μm的聚酰胺球形颗粒。
上柱完，按照以下步骤进行操作：采用氨水调节至pH5.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第一次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第二次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.2％氯化钠-0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第三次洗脱，洗脱体积为6倍填料2体积。
洗脱液用高效液相跟踪检测（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THEPURIFICATION OF DAPTOMYCIN”（ EP 1586580A2）公开的方法相同），收集色谱纯度>97%的达托霉素洗脱液，经检测其综合纯度98.57%。
洗脱物经过截留分子量为10000的超滤膜超滤去内毒素和色素，再经截留分子量为100-200的纳滤膜系统脱盐浓缩，得到达托霉素浓缩液。
浓缩液真空冻干，所得固体达托霉素采用高效液相色谱法（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”（ EP 1586580A2）公开的方法相同）检测达托霉素纯度，其纯度为98.56%。
实施例2
将达托霉素溶液调节pH3.0上75-150μm的球形聚酰胺树脂，上柱完，0.05%的碳酸氢铵溶液pH7.5解吸，收集黄色解吸液。所得解吸液经过截留分子量为300-500的纳滤膜系统纳滤浓缩至30mg/ml，并调节pH3.0上带分布器的中高压层析柱，该柱中填料为20-30μm的聚酰胺球形颗粒。
上柱完，按照以下步骤进行操作：
采用氨水调节至pH5.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第一次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第二次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.2％氯化钠-0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第三次洗脱，洗脱体积为6倍填料2体积。
洗脱液用高效液相跟踪检测（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THEPURIFICATION OF DAPTOMYCIN”（ EP 1586580A2）公开的方法相同），收集色谱纯度>97%的达托霉素洗脱液，经检测其综合纯度99.15%。
洗脱物经过截留分子量为10000的超滤膜超滤去内毒素和色素，再经截留分子量为100-200的纳滤膜系统脱盐浓缩，得到达托霉素浓缩液。
浓缩液真空冻干，所得固体达托霉素采用高效液相色谱法（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”（ EP 1586580A2）公开的方法相同）检测达托霉素纯度，其纯度在99.12%。
实施例3
将达托霉素物料调节pH2.5上75-150μm的球形聚酰胺树脂，上柱完，0.05%的碳酸氢铵溶液pH8.0解吸，收集黄色解吸液。所得解吸液经过截留分子量为300-500的纳滤膜系统纳滤浓缩至30mg/ml，并调节pH3.0上带分布器的中高压层析柱，该柱中填料为20-30μm的聚酰胺球形颗粒。
上柱完，按照以下步骤进行操作：
采用氨水调节至pH5.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第一次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第二次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.2％氯化钠-0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第三次洗脱，洗脱体积为6倍填料2体积。
洗脱液用高效液相跟踪检测（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THEPURIFICATION OF DAPTOMYCIN”（ EP 1586580A2）公开的方法相同），收集色谱纯度>97%的达托霉素洗脱液，经检测其综合纯度97.44%。
洗脱物经过截留分子量为10000的超滤膜超滤去内毒素和色素，再经截留分子量为100-200的纳滤膜系统脱盐浓缩，得到达托霉素浓缩液。
浓缩液真空冻干，所得固体达托霉素采用高效液相色谱法（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”（ EP 1586580A2）公开的方法相同）检测达托霉素纯度，其纯度在97.39%。
实施例4
将达托霉素物料调节pH3.0上75-150μm的球形聚酰胺树脂，上柱完，0.05%的碳酸氢铵溶液pH7.5解吸，收集黄色解吸液。所得解吸液经过截留分子量为300-500的纳滤膜系统纳滤浓缩至30mg/ml，并调节pH3.5上带分布器的中高压层析柱，该柱中填料为20-30μm的聚酰胺球形颗粒。
上柱完，按照以下步骤进行操作：
采用氨水调节至pH5.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第一次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第二次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.2％氯化钠-0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第三次洗脱，洗脱体积为6倍填料2体积。
洗脱液用高效液相跟踪检测（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THEPURIFICATION OF DAPTOMYCIN”（ EP 1586580A2）公开的方法相同），收集色谱纯度>97%的达托霉素洗脱液，经检测其综合纯度98.22%。
洗脱物经过截留分子量为10000的超滤膜超滤去内毒素和色素，再经截留分子量为100-200的纳滤膜系统脱盐浓缩，得到达托霉素浓缩液。
浓缩液真空冻干，所得固体达托霉素采用高效液相色谱法（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”（ EP 1586580A2）公开的方法相同）检测达托霉素纯度，其纯度在98.15%。
实施例5
将达托霉素物料调节pH2.5上75-150μm的球形聚酰胺树脂，上柱完，0.05%的碳酸氢铵溶液pH7.5解吸，收集黄色解吸液。所得解吸液经过截留分子量为300-500的纳滤膜系统纳滤浓缩至20mg/ml，并调节pH4.0上带分布器的中高压层析柱，该柱中填料为20-30μm的聚酰胺球形颗粒。
上柱完，按照以下步骤进行操作：
采用氨水调节至pH5.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第一次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第二次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.2％氯化钠-0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第三次洗脱，洗脱体积为6倍填料2体积。
洗脱液用高效液相跟踪检测（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THEPURIFICATION OF DAPTOMYCIN”（EP 1586580A2）公开的方法相同），收集色谱纯度>97%的达托霉素洗脱液，经检测其综合纯度97.61%。
洗脱物经过截留分子量为10000的超滤膜超滤去内毒素和色素，再经截留分子量为100-200的纳滤膜系统脱盐浓缩，得到达托霉素浓缩液。
浓缩液真空冻干，所得固体达托霉素采用高效液相色谱法（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”公开的方法相同）检测达托霉素纯度，其纯度在97.58%。
实施例6
将达托霉素物料调节pH2.5上75-150 μm的球形聚酰胺树脂，上柱完，0.05%的碳酸氢铵溶液pH8.0解吸，收集黄色解吸液。所得解吸液经过截留分子量为300-500的纳滤膜系统纳滤浓缩至20mg/ml，并调节pH4.0上带分布器的中高压层析柱，该柱中填料为20-30μm的聚酰胺球形颗粒。
上柱完，按照以下步骤进行操作：
采用氨水调节至pH5.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第一次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第二次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
采用氨水调节至pH6.5的0.2％氯化钠-0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第三次洗脱，洗脱体积为6倍填料2体积。
洗脱液用高效液相跟踪检测（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THEPURIFICATION OF DAPTOMYCIN”公开的方法相同），收集色谱纯度>97%的达托霉素洗脱液，经检测其综合纯度96.35%。
洗脱物经过截留分子量为10000的超滤膜超滤去内毒素和色素，再经截留分子量为100-200的纳滤膜系统脱盐浓缩，得到达托霉素浓缩液。
浓缩液真空冻干，所得固体达托霉素采用高效液相色谱法（检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”公开的方法相同）检测达托霉素纯度，其纯度在96.22%。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种快速制备高纯度达托霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将pH为2.5-3.0的达托霉素溶液使用填料1进行吸附；解吸附，收集解吸液，其中步骤(1)填料1为75-150μm的聚酰胺颗粒；
其中，步骤(1)的解吸附使用pH6.0-8.0、浓度为0.01-0.1％的缓冲盐溶液，所述缓冲盐为乙酸钠、乙酸铵、磷酸钠、磷酸铵、二乙胺，三乙胺、碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸钠或碳酸氢钠；
(2)步骤(1)的解吸液脱盐浓缩，调整pH2.5-5.0，使用填料2进行吸附；解吸附，收集解吸液；所述填料2的粒径小于所述填料1的粒径，其中，步骤(2)填料2为20-30μm的聚酰胺颗粒，步骤(2)的解吸附使用pH5.0-8.0的不同pH值的缓冲盐溶液进行梯度解吸，解吸附后收集色谱纯度≥97％的达托霉素的解吸液；
(3)步骤(2)的解吸液经脱内毒素、脱盐、浓缩后冻干。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)达托霉素溶液通过以下方法制备得到：
①达脱霉素发酵液通过陶瓷膜过滤或者板框过滤得到滤液；
②将滤液用酸调节到pH3.5-3.7，过滤，去掉清液，保留沉淀物；
③在pH8-10的水溶液中将沉淀物溶解，并使用0.22-0.45微米孔径的过滤介质过滤澄清。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）填料1为75-150μm的球形聚酰胺颗粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的解吸附使用pH7.0-8.0、浓度为0.05％的缓冲盐溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的解吸液脱盐浓缩是指将步骤(1)获得的解吸液经过纳滤膜系统脱盐，浓缩至10-50mg/ml；然后调整浓缩液pH为3.0-4.0，使用填料2进行吸附。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）填料2为20-30μm的球形聚酰胺颗粒。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用pH5.0-8.0的不同pH的缓冲盐溶液梯度解吸的方法为：
①采用氨水调节至pH5.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第一次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
②采用氨水调节至pH6.5的0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第二次洗脱，洗脱体积为3倍填料2体积；
③采用氨水调节至pH6.5的0.2％氯化钠-0.25％醋酸铵缓冲盐溶液进行第三次洗脱，洗脱体积为6倍填料2体积。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)采用带分布器的中高压层析柱进行吸附，填料装填高度为300-450mm；
步骤(3)经超滤膜系统脱掉内毒素，再使用纳滤膜系统脱盐，浓缩至50-100mg/ml，进行冻干。
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