JP4173124B2

JP4173124B2 - バンコマイシン塩酸塩の精製方法

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Publication number: JP4173124B2
Application number: JP2004270625A
Authority: JP
Inventors: ジューウォンリー; ユンテクジュン; ジュンウォースー; クワンソブリー
Original assignee: サンヤンジェネックスコーポレーション; ジェノテックコーポレイテッドリミテッド
Priority date: 2004-06-30
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2024-09-17
Also published as: US7018814B2; JP2006014720A; EP1612216B1; ATE442380T1; TWI270575B; KR20060001329A; EP1612216A1; DE602004023065D1; TW200600576A; US20060003406A1; WO2006004238A1; KR100554481B1

Description

本発明はバンコマイシンを含有する微生物醗酵液から高純度のバンコマイシン塩酸塩を分離精製する方法に関する。

バンコマイシンは、アクチノミセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属の微生物、例えば、アミコラトプシスオリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）種（ＡＴＣＣ１９７９５）菌株により生産されるグリコペプチド系抗生物質として葡萄状球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、連鎖状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、クロストリジウムディフィシルのようなグラム陽性菌及びペニシリンやセファ系の抗生物質耐性グラム陽性菌に優秀な薬効を奏する。また、手術患者及び高齢患者、免疫力の弱い人に致命的なメチシリン耐性葡萄状球菌（ＭＲＳＡ）の治療に効果が高いものに知られている。バンコマイシン塩酸塩は経口（液剤あるいはカプセル）または注射剤として常用されている。

現在ヨーロッパ抗生物質医薬品基準によれば、バンコマイシンの含有量が９３％以上であり、それ以外の最大不純物の含有量が４％以下である品質を持つバンコマイシンを要求している。

従来の通常的なバンコマイシンを精製する方法は、特許文献１ないし７に開示された方法を挙げられる。この特許方法によれば、収率を高めるために醗酵液のｐＨを１１に調整した後にろ過し、ろ液のｐＨを８に調整した後に２回ないし３回の吸着樹脂に通過させて溶出する。次に、溶媒を使用してバンコマイシン塩基塩結晶を収得した後、再び酸性化してアセトンまたはアルコール類の溶媒内で結晶化することによってバンコマイシン塩酸塩を製造する。しかし、このような方法を利用する場合、ｐＨの数回の調整によってバンコマイシン塩酸塩結晶を収得し、中間体としてバンコマイシン塩基塩結晶を収得した後、再びバンコマイシン塩酸塩を収得するために工程が非常に複雑であり、かつ高いｐＨでバンコマイシンの安定性が問題になりうる。特に、残存した色素の影響で製品が若干赤い色を表し、純度９３％以上のバンコマイシンを製造し難い。その結果、ヨーロッパ抗生物質医薬品基準に規定された品質条件を満たすバンコマイシンを生産し難い。

本発明者らは既存に開発されたバンコマイシン精製方法の問題点を補完して高純度のバンコマイシン塩酸塩を得られる簡単かつ新たな精製方法を開発しようと集中的な研究を行った。その結果、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液を強酸性陽イオン交換樹脂に通過させて溶出させた後、ｐＨを酸性すなわち、ｐＨ３〜５に調整した後に弱塩基性陰イオン交換樹脂及びアルミナにより色素を除去し、疎水性吸着樹脂に順次通過させてアセトン溶媒によりバンコマイシン塩酸塩を回収することによって、ｐＨを塩基性に変える操作によりバンコマイシン塩基塩の中間体を収得する過程なしに直接バンコマイシン塩酸塩を回収することによって、工程が単純化しつつバンコマイシンの純度も高まり、特に、大部分の色素が除去されて所期の目的を達成できることを確認し、本発明を完成するに至った。

米国特許第４，４４０，７５３号公報米国特許第４，８４５，１９４号公報米国特許第５，０３７，６５２号公報米国特許第５，１４９，７８４号公報米国特許第５，２３５，０３７号公報米国特許第５，２５８，４９５号公報米国特許第５，５７４，１３５号公報

したがって、本発明の目的は、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液から高純度のバンコマイシン塩酸塩を簡単に精製する方法を提供することである。

本発明の一態様によれば、（ａ）バンコマイシンを含有する微生物醗酵液をｐＨ１ないし３の条件で強酸性陽イオン交換樹脂に通過させ、ｐＨが９ないし１１であり、かつ濃度が０．０５Ｎないし０．２Ｎである水酸化アンモニウム水溶液で溶出させる段階と、（ｂ）得られた溶出液をｐＨ３ないし５に調整した後に弱塩基性陰イオン交換樹脂及びアルミナに連続的に通過させ、水で洗浄して色素を除去する段階と、（ｃ）得られた溶出液を疎水性吸着樹脂に通過させてＣ１ないしＣ４のアルコール水溶液で溶出させる段階と、（ｄ）前記溶出液に塩酸を加えてｐＨを２ないし５範囲に調整し、Ｃ１ないしＣ４のアルコール、アセトニトリル、アセトンまたはメチルイソブチルケトンを含む水溶性有機溶媒を加えてバンコマイシン塩酸塩を結晶化する段階と、を含む、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液からバンコマイシン塩酸塩を精製する方法を提供する。

本発明に係る方法においては、［１］（ａ）バンコマイシンを含有する微生物醗酵液をｐＨ１ないし３の条件で強酸性陽イオン交換樹脂に通過させ、ｐＨが９ないし１１であり、かつ濃度が０．０５Ｎないし０．２Ｎである水酸化アンモニウム水溶液で溶出させる段階と、（ｂ）得られた溶出液をｐＨ３ないし５に調整した後に弱塩基性陰イオン交換樹脂及びアルミナに連続的に通過させ、水で洗浄して色素を除去する段階と、（ｃ）得られた溶出液を疎水性吸着樹脂に通過させてＣ１ないしＣ４のアルコール水溶液で溶出させる段階と、（ｄ）前記溶出液に塩酸を加えてｐＨを２ないし５範囲に調整し、Ｃ１ないしＣ４のアルコール、アセトニトリル、アセトンまたはメチルイソブチルケトンを含む水溶性有機溶媒を加えてバンコマイシン塩酸塩を結晶化する段階と、を含む、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液からバンコマイシン塩酸塩を精製する方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、［２］前記微生物はアミコラトプシスオリエンタリスである上記[１]に記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、［３］前記強酸性陽イオン交換樹脂はＤＯＷＥＸ５０ＷＸ２−１００（５０〜１００メッシュ、スルホン系樹脂、Ｄｏｗｃｈｅｍｉｃａｌ社製）である上記[１]に記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、［４］前記弱塩基性陰イオン交換樹脂はＤＣＡ１１（アクリル系多孔性樹脂、三菱社製）である上記[１]に記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、［５］（ｃ）または（ｄ）段階でＣ１ないしＣ４のアルコールはメタノール、エタノール、及びイソプロパノールよりなる群から選択される上記[１]に記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、［６］前記疎水性吸着樹脂はＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ−１６１Ｍ（Ｒｏｈｍ＆ｈａａｓ社製）である上記[１]に記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、［７］（ｂ）段階から得られる溶出液を活性炭と混合してろ過する段階をさらに含む上記[１]に記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、［８］（ｃ）段階から得られる溶出液を濃縮する段階をさらに含む上記[１]に記載の方法であることを特徴とする。

本発明による精製方法を利用すれば、バンコマイシン塩酸塩中色素の含有量が顕著に減少した９５％以上の含有量を持つ高純度のバンコマイシン塩酸塩を分離精製できる。

本発明は、（ａ）バンコマイシンを含有する微生物醗酵液をｐＨ１ないし３の条件で強酸性陽イオン交換樹脂に通過させ、ｐＨが９ないし１１であり、かつ濃度が０．０５Ｎないし０．２Ｎである水酸化アンモニウム水溶液で溶出させる段階と、（ｂ）得られた溶出液をｐＨ３ないし５に調整した後に弱塩基性陰イオン交換樹脂及びアルミナに連続的に通過させ、水で洗浄して色素を除去する段階と、（ｃ）得られた溶出液を疎水性吸着樹脂に通過させてＣ１ないしＣ４のアルコール水溶液で溶出させる段階と、（ｄ）前記溶出液に塩酸を加えてｐＨを２ないし５範囲に調整し、Ｃ１ないしＣ４のアルコール、アセトニトリル、アセトンまたはメチルイソブチルケトンを含む水溶性有機溶媒を加えてバンコマイシン塩酸塩を結晶化する段階と、を含む、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液からバンコマイシン塩酸塩を精製する方法を提供する。

本発明の（ａ）段階で、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液をｐＨ１ないし３の条件で強酸性陽イオン交換樹脂に通過させて水酸化アンモニウム溶液で溶出させる。前記微生物はバンコマイシンを生産し、培養物中にバンコマイシンを蓄積できる微生物ならばいずれも含まれる。例えば、アミコラトプシスオリエンタリス、さらに具体的にはアミコラトプシスオリエンタリス（ＡＴＴ１９７９５）を振とう培養した培養物になりうる。このような培養物は酸、例えば塩酸及び硫酸のような強い無機酸を使用して培養物をｐＨ１ないし３に調整できる。酸性ｐＨに調整された培養物を一定時間、例えば、３０分間放置した後、ろ過じょうごを使用して菌体および固形不純物を除去してそのろ液を今後の精製過程に使用できる。前記強酸性陽イオン交換樹脂は強酸性、望ましくはｐＨ１ないし３の条件で陽イオン物質を吸着できる化合物である。前記強酸性陽イオン交換樹脂は望ましくは、ＤＯＷＥＸ５０ＷＸ２（５０〜１００メッシュ、スルホン系樹脂、Ｄｏｗｃｈｅｍｉｃａｌ社製）である。醗酵液を前記陽イオン交換樹脂にローディングする速度は当業者ならば任意的に調節でき、例えば０．５ないし２．０倍のカラム体積の流速でローディングできる。溶出は水酸化アンモニウム溶液、例えば、ｐＨが９〜１１であり、濃度が０．０５Ｎないし０．２Ｎである水酸化アンモニウム水溶液を利用して溶出する。本段階で得られるバンコマイシンの純度は約８５％以上である。前記バンコマイシン溶出液は溶出されるやいなや酸、例えば、塩酸でｐＨを３ないし５に調整しなければならない。

本発明の（ｂ）段階で、（ａ）段階で得られた溶出液を弱塩基性陰イオン交換樹脂及びアルミナに連続的に通過させ、水で洗浄してバンコマイシンを溶出させ、色素を吸着させて除去する。前記弱塩基性陰イオン交換樹脂は例えば、ＤＣＡ１１（アクリル系多孔性樹脂、三菱社製）であり、前記アルミナは活性アルミナ（〜１５０メッシュ、酸性活性、ＡＬＤＲＩＣＨ社製造）でありうる。

本発明の一具現例で、前記（ｂ）段階で得られた溶出液を活性炭素と混合して攪拌した後にろ過して色素をさらに除去できる。活性炭素の使用量は例えば、バンコマイシン量の１０％になりうる。このように得られた水中にはバンコマイシンの純度が約９０％に増加する。

本発明の（ｃ）段階で、（ｂ）段階で得られた溶出液を疎水性吸着樹脂に通過させてＣ１ないしＣ４アルコール水溶液で溶出させる。疎水性吸着樹脂としては、逆相クロマトグラフィーに使われる通常の疎水性樹脂が使われうる。例えば、ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ−１６１Ｍ（粒径７５μｍ、Ｒｏｈｍ＆ｈａａｓ社製）になりうる。前記Ｃ１ないしＣ４アルコール溶液は例えば、メタノール、エタノール、及びイソプロパノールよりなる群から選択されるアルコール溶液になりうる。また、前記アルコール溶液には無機塩、例えば５０ｍＭ濃度の無水燐酸ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）が含まれ、溶出はバンコマイシンの溶出の効率を高めるために一定の勾配を通じて適用できる。このような濃度勾配を加える過程は当業者ならば適切な予備実験を通じて容易に設定できる。前記Ｃ１ないしＣ４アルコール溶液による溶出によって得られるバンコマイシンはヨーロッパ抗生物質基準によるＨＰＬＣで分析した結果、純度が９５％以上となる。

本発明の一具現例で、前記（ｃ）段階から得られる溶出液を濃縮する段階をさらに含む。このような濃縮過程は当業界で公知の方法、例えば、逆滲透（ＲｅｖｅｒｓｅＯｓｍｏｓｉｓ；Ｒ／Ｏ）及び真空乾燥などが使われうる。

本発明の（ｄ）段階で、前記溶出液に塩酸を加えてｐＨを２ないし５範囲に調整ししてＣ１〜Ｃ４のアルコール、アセトニトリル、アセトンまたはメチルイソブチルケトンを含む水溶性有機溶媒、望ましくはアセトンを加えてバンコマイシン塩酸塩を結晶化する。前記溶出液は例えば、Ｒ／Ｏによって濃縮された後に塩酸を加えてｐＨを２ないし５の範囲に調整し、アセトンを前記溶出液体積の５倍の量で加えた後、約２ないし８℃で一定の時間、例えば、約２０時間放置することによってバンコマイシン結晶を得ることができる。このように得られたバンコマイシン結晶をろ過して、真空乾燥器を通じて乾燥することでバンコマイシン塩酸塩を回収できる。最終的に回収されたバンコマイシン塩酸塩はヨーロッパ抗生物質基準によるＨＰＬＣで分析した結果、純度が９５％以上であり、１，０００ｍｃｇ／ｍｌ以上の抗菌力価を持つ。したがって、本発明の方法によって、高純度のバンコマイシンを簡単な精製工程を通じて得られる。

以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：強酸性陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ５０ＷＸ２）を通じた精製
まず、バンコマイシンを５，０００ｍｇ／リットル濃度で含有するアミコラトプシスオリエンタリス種（ＡＴＣＣ１９７９５）の醗酵液６，０００ｍｌに硫酸を混合してｐＨを２に調整した。酸性に調整された培養物を３０分間放置した後、硅藻土ろ過器を使用してろ過して７，５００ｍｌのろ液を得た。

濃縮液を強酸性陽イオン交換樹脂であるＤＯＷＥＸ５０ＷＸ２（Ｄｏｗｃｈｅｍｉｃａｌ社製）２，０００ｍｌに時間当り２，０００ｍｌの流速で通過させて吸着させた。次に、時間当り２，０００ｍｌ流速で蒸溜水４，０００ｍｌを加えて洗浄し、洗浄後にｐＨ１０の０．１ＮＮＨ_４ＯＨ水溶液５，０００ｍｌを使用してＤＯＷＥＸ５０ＷＸ２樹脂からバンコマイシンを溶出させた。その結果、４，５００ｍｌの溶出液を得た（収率：８８％）。溶出させるやいなや２ＮＨＣｌを加えて溶出液のｐＨを３．５に調整した。

実施例２：弱塩基性陰イオン交換樹脂及びアルミナを通じた精製
実施例１で得た溶出液４，５００ｍｌを弱塩基性陰イオン交換樹脂であるＤＣＡ１１（三菱社製）１，０００ｍｌ及び活性アルミナ（米国のＡＬＤＲＩＣＨ社製）８００ｍｌに時間当り１，０００ｍｌの流速で連続的に通過させた。以後、水２，０００ｍｌを時間当り１，０００ｍｌの流速で洗浄した。

収得された溶出液に活性炭素１５ｇを投入して２０分間攪拌してからろ過した。収得された溶出液の体積は４，８００ｍｌであった（収率：８５％）。

実施例３：疎水性吸着樹脂（ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ−１６１Ｍ）を通じた精製
実施例２で得た溶出液４，８００ｍｌを疎水性吸着樹脂であるＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ−１６１Ｍ（Ｒｏｈｍ＆ｈａａｓ社製）５００ｍｌに時間当り１，０００ｍｌの速度で通過させて吸着させた。時間当り１，０００ｍｌの流速で水１，０００ｍｌを適用して洗浄し、以後に同一流速で２．５時間の間５０ｍＭ濃度の無水燐酸ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）が添加されたイソプロパノールの濃度を８％まで一定かつ連続的に高めつつバンコマイシンを溶出させた。この時、４００ｍｌずつ分取してヨーロッパ抗生物質基準のＨＰＬＣで分析して純度９３％以上の分画だけを合せてバンコマイシンを回収した。収得された溶出液の体積は１，４００ｍｌであり、バンコマイシンを９５％以上含有し、大部分の色素が除去された。

実施例４：結晶回収及び分析
実施例３の方法で得た溶出液をＲ／Ｏを利用して４００ｍｌに濃縮した。濃縮液に同一体積の水を加えてＲ／Ｏ濃縮を続けて４００ｍｌまで濃縮した。このような方法により水を１２回加えて１００ｍｌまで濃縮した。２ＮＨＣｌを使用してｐＨを３．２に調整した後に５倍の体積のアセトンを徐々に点滴し、４℃で一晩中放置してろ過した。ろ過された沈殿物を４０℃以下の真空乾燥器で一晩中乾燥した。乾燥されたバンコマイシン塩酸塩の重さは１３，５００ｍｇであった。これを２００１年ヨーロッパ抗生物質医薬品基準によるＨＰＬＣで分析した。この時、対照品として、現在販売中のバンコマイシン塩酸塩（日本のリリー社製）を使用した。

その結果を図１及び２にそれぞれ示した。図１に示したように、本発明の方法によって精製することによって、バンコマイシンの含有量が９５．５％であり、１，０２４ｍｃｇ／ｍｇ以上の抗菌効能を持つ高純度のバンコマイシン塩酸塩を収得できた。一方、図２に示したように、販売中のバンコマイシンの場合、本発明による精製品と比較してバンコマイシンの含有量が９３％程度であり、色度の差が多いと認められた。

本発明はバンコマイシン塩酸塩の精製に適用できる。

本発明によって精製されたバンコマイシン塩酸塩のＨＰＬＣ分析結果（ヨーロッパ抗生物質医薬品基準分析法）を示す図面である。対照品としてバンコマイシン塩酸塩（日本リリー社製）のＨＰＬＣ分析結果（ヨーロッパ抗生物質医薬品基準分析法）を示す図面である。

Claims

（ａ）バンコマイシンを含有する微生物醗酵液をｐＨ１ないし３の条件で強酸性陽イオン交換樹脂に通過させ、ｐＨが９ないし１１であり、かつ濃度が０．０５Ｎないし０．２Ｎである水酸化アンモニウム水溶液で溶出させる段階と、
（ｂ）得られた溶出液をｐＨ３ないし５に調整した後に弱塩基性陰イオン交換樹脂及びアルミナに連続的に通過させ、水で洗浄して色素を除去する段階と、
（ｃ）得られた溶出液を疎水性吸着樹脂に通過させてＣ１ないしＣ４のアルコール水溶液で溶出させる段階と、
（ｄ）前記溶出液に塩酸を加えてｐＨを２ないし５範囲に調整し、Ｃ１ないしＣ４のアルコール、アセトニトリル、アセトンまたはメチルイソブチルケトンを含む水溶性有機溶媒を加えてバンコマイシン塩酸塩を結晶化する段階と、を含む、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液からバンコマイシン塩酸塩を精製する方法。
前記微生物はアミコラトプシスオリエンタリスである請求項１に記載の方法。
前記強酸性陽イオン交換樹脂は５０〜１００メッシュのスルホン系樹脂である請求項１に記載の方法。
（ｃ）または（ｄ）段階でＣ１ないしＣ４のアルコールはメタノール、エタノール、及びイソプロパノールよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
（ｂ）段階から得られる溶出液を活性炭と混合してろ過する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
（ｃ）段階から得られる溶出液を濃縮する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。