TWI270575B - Process of purifying vancomycin hydrochloride - Google Patents

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127057534pif.doc 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是關於從一微生物發酵培養液純化以取得高純 度鹽酸萬古黴素的方法。 【先前技術】 % 優先權是依2004年6月30日在韓國智財局專利申請 ’ 號No· 10-2004-0050429，相關揭露之技術發明倂入本案之 參考資料。 φ 萬古黴素是一種多醣胜肽（glycopeptide)類抗生素， 是由微生物所產生同菌屬的放線菌類，例 如東方土壤絲菌所w,·⑼仏/以（atcc I9795)】 等菌種。萬古黴素是一對葛蘭氏陽性菌具強效之抗生素， 例如鍵球菌⑶’葡萄球菌（汾’ 困難腸梭菌（C7c^ir/d/wm (i访) ’與對盤尼西林 (penicillin)與頭孢子菌素（cephalosporin)有抗藥性的抗 葛蘭氏陽性菌抗生素。同時，萬古黴素也是已知對抗青徼 素金黃色葡萄球菌（methicillin_resistant Staphylococcus aureus，MRSA)具強效之抗生素，特別是對手術後可能致 命、老年、和免疫力弱的病人。鹽酸萬古黴素一般以口服 ^ 溶液或膠囊型式，或注射形式施予病人。 根據歐洲藥典，萬古黴素至少要有93%純度且不純物 組成不可以超過溶液的4%。 傳統純化萬古黴素的方法在下列美國專利中已描 述：Nos· 4,440,753、4,845，194、5,037,652、5，149,784、 I27057iS34pif.doc 5,235,037、5,258,495、5,574，135。爲了 增加萬古黴素產率， 在這些方法中，發酵培養液調整酸鹼値（pH)到11，然後 過瀘；獲得的濾液之酸鹼値（pH)調整到8。後續，濾液通 過吸收樹脂，將萬古黴素從吸收樹脂洗提出。程序重複二 到三次。之後鹼性萬古黴素鹽類以溶液結晶析出，晶體再 被酸化。酸化的產物被以丙酮或酒精再結晶以產生鹽酸萬 古黴素。前述過程相當複雜，因爲鹽酸萬古黴素結晶的獲 得要調整酸鹼値（pH)數次，且經過鹼性萬古黴素鹽類爲 中間體，才進到鹽酸萬古黴素的在結晶程序。另外，萬古 黴素在高酸鹼値（pH)的環境下可能不穩定。特別是當有 有色殘餘物時，所獲得的萬古黴素可能偏紅色且難以獲得 純度至少93%的萬古黴素。所以，很難產生符合歐洲抗生素 規範要求以得到令人滿意的萬古黴素。 本發明執行嚴格的硏究以克服前述問題並發明產生高 純度的鹽酸萬古黴素，直接回復鹽酸萬古黴素無須經過中 間產物階段，例如鹼性萬古黴素鹽類，前述步驟是因爲要 執行調高含萬古黴素產物之溶液的酸鹼値（pH)，所以本 發明提供一簡化的步驟且可提供一高純度萬古黴素，特別 是可以消除有色的殘餘物殘留在萬古黴素。 【發明內容】 本發明提供一從含有萬古黴素的微生物發酵培養液純 化鹽酸萬古黴素的簡化方法。 根據本發明之另一目的，本發明提供一從含有萬古徽 素的微生物發酵培養液純化鹽酸萬古黴素的方法，包括： Ι27057ι§34ρΐ f.doc 將含有萬古黴素的微生物發酵培養液通過一酸鹼値（pH) 介於1-3之強酸陽離子交換樹脂後再以酸鹼値（pH)介於 9-11濃度介於〇·〇5到0·2 N的氨水溶液洗提出萬古黴素， g周整洗液酸驗値（pH)介於3-5 ;再將前述溶液通過一弱鹼 陰離子交換樹脂並繼續通過氧化鋁，之後再水洗弱鹼陰離 子交換樹脂與氧化鋁以便洗提出萬古黴素，再將粗萬古黴 素去色；將洗液通過厭水性吸收樹脂且以碳數C1_4的醇類 水溶液洗出萬古黴素，並加入鹽酸以調整洗液的酸鹼値 (pH)介於2-5並加入一水溶性有機溶劑，且前述水溶性 有機溶劑選自由含有碳數C1-4的醇類、乙腈 (acetonitrile )、丙嗣與甲基異丁嗣（methyl isobutyl ketone )所組成的族群，使用爲洗液洗提出鹽酸萬古黴素 結晶。 依據本發明之一實施例，提供一從含有萬古黴素的微 生物發酵培養液純化鹽酸萬古黴素，包括：將含有萬古黴 素的微生物發酵培養液通過一酸驗値（pH)介於1-3之強 酸陽離子交換樹脂後再以酸鹼値（pH)介於9-11濃度介於 0·05到0·2 N的氨水溶液洗出萬古黴素，調整洗液酸鹼値 (pH)介於3-5;再將即述丨谷液通過一^弱驗陰離子交換樹脂 並繼續通過氧化鋁，之後再水洗弱鹼陰離子交換樹脂與氧 化鋁以便洗提出萬古黴素；最後再將粗萬古黴素去色，通 過洗液與厭水性吸收樹脂以碳數C1-4的醇類水溶液洗提出 萬古黴素，並加入鹽酸以調整洗液的酸鹼値（pH)介於2-5 並加入一水溶性有機溶劑，且前述水溶性有機溶劑選自由 1270575 · 16734pif.doc 含有碳數c 1-4的醇類、乙腈（acetonitrile)、丙酮與甲基異 丁酮（methyl isobutyl ketone)以爲洗液洗提出鹽酸萬古黴 素結晶。較佳者爲使用丙酮以洗提出鹽酸萬古黴素執行做 結晶化。 在本實施例中，含有萬古黴素的微生物發酵培養液被 通過一酸鹼値（pH)介於1-3之強酸陽離子交換樹脂，並以 氨水溶液洗過強酸陽離子交換樹脂。此處之微生物可以是 任何可產生萬古黴素的微生物，同時累積並產生萬古黴素 於養殖環境中。例如，一搖動的養殖環境可以使用東方土 壤絲菌（oriewia/以），更特別的是使用編號 ATT 19795的東方土壤絲菌出） Amycolatopsis orientalis (ΑΎΎ 19795) '。培養液的酸驗値 (pH)可以加入酸液調整到1-3，比如使用一強無機酸， 例如是鹽酸或硫酸。將培養液置放一段預定的時間例如30 分鐘，微生物與固態不純物使用過瀘漏斗濾過，濾液透過 純化過程純化。強酸陽離子交換樹脂是一種在強酸環境可 以吸收陽離子的物質，較佳環境是酸鹼値（pH)介於1-3。 可以使用 DOWEX 50WX2-100 (篩孔爲50-100 mesh，一種 颯樹脂（sulfone resin)，可向Dow Chemical購得）作爲強酸 陽離子交換樹脂。一般熟知該項技藝者在發酵液荷載到陽 離子交換樹脂之後，可任意控制流速。例如，流速可以是 0·5到2·0管柱體積。洗液可以是氨水溶液，例如濃度介於 0.05到0·2 Ν的氨水溶液，酸鹼値（pH)介於9-11。所獲得 的萬古黴素純度至少85 %。一旦萬古黴素溶液被洗出，萬 8 I270575734pif.doc 古黴素溶液必須用酸調整到酸鹼値（pH)，所使用的酸可 以是例如鹽酸。 然後所產生的溶液被通過一弱鹼陰離子交換樹脂並繼 續通過氧化鋁，然後弱鹼陰離子交換樹脂與氧化鋁再以水 洗以洗提出萬古黴素，再經過去色以吸附方式洗提出萬古 黴素。例如使用DCA11【一種多孔徑丙烯酸樹脂（porous acrylic resin)，可由Mitsubishi購得】做爲弱鹼性陰離子交 換樹脂，以及活性氧化鋁做爲氧化鋁（篩孔〜150 mesh，酸 性活化，可由ALDRICH購得）。 在本發明的示範性實施例，去色後的洗提液可進一步 與活性碳攪拌，之後執行過濾並進一步去色萬古黴素。活 性碳的使用量，例如以需去色量的萬古黴素量的10%。再 去色後的萬古黴素純度增加到約90%。 去色後所獲得的洗提液可被通過厭水性吸附樹脂，並 以碳數C1-4的醇類水溶液作爲沖提液。傳統厭水性樹脂 使用逆向層析（reverse phase chromatography)做爲厭水性 吸附樹脂，例如使用Amberchrom CG-161M (粒子大小： 75 //m，可自Rohm & Haas購得）。碳數C1-4的醇類溶液 可以選自含有由甲醇、乙醇、與異丙醇所組成的族群的溶 液。碳數C1-4的醇類溶液更可以進一步包含無機類鹽例 如無水磷酸鈉（NaH2P04)，例如，以50 mM的濃度。層析 法可以用以增加洗提萬古黴素的效率。一般熟知該項技藝 的人可以輕易透過合適的前置測試來執行層析。獲得的萬 古黴素以碳數C1-4的醇類溶液洗提以獲得至少95%純度， 12705 *7S34pif.doc 且以依據歐洲藥典之標準採高壓液態層析儀測試（HPLC) 分析。 在其他本發明示範性實施例，洗提液所獲得的萬古黴 素是以碳數C1-4的醇類水溶液進行洗提後再進一步執行 濃縮。洗提液的濃縮可以使用傳統的方法進行，例如，逆 滲透或者真空乾燥等方法。 鹽酸被加入以碳數C1-4的醇類水溶液作爲洗提液執 行洗提得到的萬古黴素調整調整到酸鹼値（pH)到洗提液 之酸鹼値（pH)介於2到5，在此所使用的水溶性有機溶劑 選自碳數C1-4的醇類，由醇類、乙腈（acetonitrile)、 丙酮與甲基異丁酮（methyl isobutyl ketone )所組成之族 群，較佳者爲丙酮，可以使用來析出溶液中結晶化的鹽酸 萬古黴素。例如，洗液以逆滲透法濃縮，再以鹽酸調整酸 鹼値（pH)使洗提液之酸鹼値（pH)介於2到5，再加入約 五倍於洗提液體積的丙酮。此溶液被置於室溫下約2到8°C 滯留預設的時間，例如，約20小時以獲得萬古黴素結晶。 所獲得的萬古黴素晶體被過濾且抽真空乾燥以回復鹽酸萬 古黴素。所產生的鹽酸萬古黴素有至少95%的純度，且依歐 洲藥典之標準方法執高壓液態層析儀測試（HPLC)分析， 且具有至少1，〇〇〇 mcg/ml的抗菌活性。所以根據本發明之一 實施例，高純度萬古黴素可以被本發明簡化的方法獲得。 雖然本發明已以上述較佳實施例揭露如上，然其並非 用以限定本發明。 12705¾ 34pif.doc 【實施方式】 範例 範例1 :使用強酸陽離子交換樹脂(DOWEX50WX2-100) 硫酸加到加到6,000毫升的東方土壤絲菌 [Amycolatopsis orientalis (ATCC 19795)】發酵培養液 包含萬古黴素濃度爲5,000 mg/L並調整酸鹼値(pH)爲2。調 * 整過的養殖環境滯留30分鐘，再過濾透過矽藻土過濾池以 獲得7,500毫升的濾液。 • 濃縮濾液被通過2,000毫升的強酸陽離子交換樹脂如 DOWEX 50WX2-100(Dow chemical)以流速2,000毫升/小 時（ml/hr)並加以吸附。接著，樹脂以4,000毫升的蒸餾水 水洗，流速2,000毫升/小時（ml/h〇。水洗後，萬古黴素 以DOWEX 50WX2-100用 5,000毫升的〇·1 N NH4OH水溶液 洗提以獲得4,500毫升的洗液（產率：88 %)。只要洗液一獲 得，再以濃度2 NHC1加入洗液以調整酸鹼値(pH)到3.5。 範例2 :使用弱鹼陰離子交換樹脂與氧化鋁執行純化 在範例1所獲得4,500毫升的洗液通過1，〇〇〇毫升的弱鹼 陰離子交換樹脂DCA11 (Mitsubishi，Japan)，後續以800 ml ' 活性碳（ALDRICH, U.S.A.)去色，以流速1，〇〇〇毫升/小時 (ml/hr)。然後，DCA11與氧化鋁以2,000毫升的水進行 水洗，流速1，〇〇〇毫升/小時（ml/hr)。 後續以15克的活性碳，置入前述步驟所獲得的洗液， 攪拌20分鐘再過濾。洗提出洗液體積爲4,800毫升（產 11 127057l§34pif.doc 率：85%)。 範例3 ··使用厭水性吸收樹脂（Amberchrom CG-161M)做 純化 範例2所獲得體積4,800毫升的洗提液被通過500毫升 的厭水性吸收樹脂 Amberchrom CG-161M (Rohm & Haas) 以流速1，〇〇〇毫升/小時（ml/hr)，並進行吸附。然後，樹 脂經過1，〇〇〇毫升的水水洗，流速設定在1,0000毫升/小時 (ml/hr)。經過水洗後，萬古黴素以流速1，000毫升/小時 (ml/h〇，且增加濃度的含50 mM無水磷酸鈉(NaH2P04) 異丙醇水溶液，直到8 %定速持續2.5小時。同時，依據歐 洲抗生素標準以高壓液態層析儀測試（HPLC)分析餾分所 獲得的400毫升的萬古黴素溶液之純度。然後，餾分所得純 度93%的部分被合倂以回復萬古黴素。合倂餾分的的體積有 1，400毫升且包含至少95%的萬古黴素，且大部份的有色雜 質已經被去除。 範例4 :回復並分析萬古黴素結晶 範例3所獲得之洗液被濃縮，並使用逆滲透(R/0)獲得 400毫升的體積。等體積的水被加入前述濃縮液，然後溶液 被再度濃縮，並使用逆滲透(R/0)獲得400毫升的體積。相 同的步驟被重複12次以將溶液濃縮到100毫升的體積。濃縮 的溶液以濃度2 NHC1調整酸鹼値（pH)到3.2。然後，丙 酮被逐滴緩慢加到溶液中，丙酮添加量是溶液體積的五倍 12 I27057lS34pif.doc 量。溶液置於4°C環境中過夜。且經過過濾。過濾的結晶被 40°c或更低的溫度真空乾燥。被乾燥的鹽酸萬古黴素重 13,5〇〇毫克且以依據歐洲藥典2001年版本之標準採高壓液 態層析儀測試（HPLC)分析。另外，商用鹽酸萬古黴素HC1 (Lilly，Japan)被使用來做控制對照組。 結果如圖1與圖2所述。如圖1，使用方法是依據本 ^ 發明之實施例所獲得之高純度的鹽酸萬古黴素，其中萬古 黴素含量95.5 %且抗菌活性至少1，024 mcg/mg。同時，如 • 圖2所示，商用鹽酸萬古黴素之萬古黴素含量約93 %，且 與本發明純化之萬古黴素相比，商用萬古黴素含許多有色 雜質。 依據本發明實施例所使用方法得到的鹽酸萬古黴素所 含純度至少95%，且顯著降低有色雜質的含量。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神 和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護 φ 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者爲準。 . 【圖式簡單說明】 爲讓本發明之上述和其他目的、特徵和優點能更明顯 ' 易懂’下文特舉較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說 明如下然並非用以限制本發明。 圖1描述一實施例運用本發明方法之所純化之鹽酸萬 古黴素的高壓液態層析儀測試（HPLC)結果。 圖2描述從日本禮來藥廠購得之鹽酸萬古黴素的高 13 127057各3知制。° 壓液態層析儀測試（HPLC)結果(使用歐洲抗生素標準）。 【主要元件符號說明】

Claims (1)

127057534pif.doc 十、申請專利範圍： 1· 一種從含有萬古黴素的微生物發酵培養液中純化鹽 酸萬古黴素的方法，包括： 將含有萬古黴素的微生物發酵培養液通過一酸鹼値 (pH)介於1-3之強酸陽離子交換樹脂後再以酸鹼値（pH) 介於9-11濃度介於0·〇5到Ο·2 N的氨水溶液洗提出萬古黴 素；

調整洗液酸鹼値（pH)介於3-5 ;再將前述溶液通過 一弱鹼陰離子交換樹脂並繼續通過氧化鋁，之後再水洗弱 鹼陰離子交換樹脂與氧化鋁以便洗提出萬古黴素；最後再 將粗萬古黴素去色； 將洗液通過厭水性吸收樹脂且使用碳數C1-4的醇類 水溶液洗提出萬古黴素1 ;以及

公告本 _________________________ 並加入鹽酸以調整洗液的酸鹼値（pH)介於2-5並加 入一水溶性有機溶劑，且前述水溶性有機溶劑選自由含有 碳數C1-4的醇類、乙腈（acetonitrile)、丙酮與甲基異丁酮 (methyl isobutyl ketone )戶斤組成之族群做爲洗液洗提析 出鹽酸萬古黴素結晶。 2. 如申請專利範圍第1項所述之從含有萬古黴素的微 生物發酵培養液中純化鹽酸萬古黴素的方法，其中所述之 微生物爲東方土壤絲菌or/⑼(ATCC 19795)〇 3. 如申請.專利範圍第1項所述之從含有萬古黴素的微 生物發酵培養液中純化鹽酸萬古黴素的方法，其中所述之 15 I27〇5fc,〇c 強酸陽離子交換樹脂爲DOWEX 50WX2-100 (歸孔爲 50-100 mesh，一^ 種砸樹脂（sulfone resin )，可向 D〇w Chemical購得）。 4·如申請專利範圍第1項所述之從含有萬古黴素的微[ 、 生物發酵培養液中純化鹽酸萬古黴素的方法，其中所述之 弱鹼陰離子交換樹脂爲DCA11【一種多孔徑丙烯酸樹脂 a (porous acrylic resin)，可由Mitsubishi購得】。 5. 如申請專利範圍第1項所述之從含有萬古黴素自勺Μ ® 生物發酵培養液中純化鹽酸萬古黴素的方法，其中所$$ 用以洗提出萬古黴素且用以加入水溶性有機溶劑之含有碳 數C1-4的醇類，該含有碳數C1-4的醇類選自由甲醇、乙醇、 與異丙醇所組成的族群。 6. 如申請專利範圍第1項所述之從含有萬古黴素的微 生物發酵培養液中純化鹽酸萬古黴素的方法，其中所述之 厭水性吸收樹脂是Amberchrom CG-161M (可從Rohm & Haas購得）。 % 7.如申請專利範圍第1項所述之從含有萬古黴素的微 . 生物發酵培養液中純化鹽酸萬古黴素的方法，其中更包括 混合由活性碳去色的洗液，再經過濾產生的混合物。 8.如申請專利範圍第1項所述之從含有萬古黴素的微 生物發酵培養液中純化鹽酸萬古黴素的方法，其中更包括 濃縮洗液以獲得使用有碳數C1-4的醇類之水溶液洗提出的 萬古黴素。 16