KR20060125156A - 펜타마이신의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펜타마이신 정제 방법에 관한 것으로 균배양 발효액에 알코올을 첨가하여 여과하는 정제 방법, 여과 후 나온 균체에서 알코올을 사용하여 추출하는 정제 방법, 정제액을 HP20, HP20SS 및 HZ-802 등의 합성흡착수지로 정제하는 정제 방법, 정제액을 최종 결정화하는 정제 방법으로 이루어진다.

본 발명의 펜타마이신 정제 방법은 상온에서 합성흡착수지를 이용하여 간단하게 고순도의 펜타마이신을 제조함을 특징으로 한다.

펜타마이신의 구조

펜타마이신, 펜타마이신 정제 방법

Description

펜타마이신의 제조방법{Method for purifying pentamycin}

전 세계 항생제는 연간 250억달러 규모의 시장을 이루고 있고, 이중 약 10%가 항진균제로 추산되고 있다. 펜타마이신은 항진균 역가를 갖는 polyene macrolide 계열의 항생제로 Streptomyces griseofuscus 또는 Streptomyces pentaticus에서 생산되는 것으로 보고되어 있다. Polyene macrolide는 현재 가장 강력한 항진균 역가를 보이는 항생제로 알려져 있지만, 앞으로 전망이 넓다.

하지만 최근, 인체면역결핍바이러스(HIV)감염, 항암 요법 또는 장기이식 과정 중에 면역억제제의 사용이 증가함에 따라 균상종의 감염(fungal infection)이 심하게 대두되어 있고, 따라서 예전 보다 강력하고 안전한 항진균제가 요구되고 있는 실정이다. 이러한 문제의 해결 방안으로 polyene macrolide 계열 항생제가 다시 기대를 모으고 있다.

현재 유사계열의 항생제인 nystatin, amphotericin, candicidin을 중심으로 활발한 연구가 진행되고 있으나 펜타마이신의 경우 이미 질 칸디다증(vaginal candidiasis) 등의 치료제로 사용되어 왔고, 새로운 적응증에 대한 가능성이 있음에도 불구하고 다른 polyene macrolide 에 비해 연구가 미진한 실정이다.

펜타마이신은 이미 우리나라 식약청에 등재된 항생제로 칸디다감염증에 이용 할 수 있는 것으로 알려져 있고 새로운 적응증이 개발되고 있으나 현재까지 알려진 정제 방법은 알코올로 추출하고 농축하여 결정화하는 방법으로 고순도의 펜타마이신을 생산하기 어려운 실정이다. 지금까지 HP20, HP20SS 및 HZ802 등의 합성흡착수지와 아세톤 및 알코올을 사용하는 정제법이 없다. 따라서 앞으로 지속적으로 사용량이 증가되어 고부가 가치 창출이 예상되는 펜타마이신의 일반적인 정제 방법인 합성흡착수지 및 유기용제를 사용하는 연구가 시급한 실정이다

본 발명자들은 펜타마이신을 간단한 정제 방법으로 고순도로 제조할 수 있는 개발을 목적으로 고순도 제조법을 제시하게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 펜타마이신을 고순도로 제조할 수 있는 정제 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 합성흡착수지와 유기용매, 물 등을 사용하여 고순도로 펜타마이신을 제조하는 제조방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

발효액에 알코올을 첨가하여 여과하고, 여과 후 나온 균체 등을 알코올로 추출한 액 또는 불순물을 함유한 펜타마이신 용액을 HP20, HP20SS 및 HZ-802 등의 합성흡착수지를 충진한 칼럼에 정제액을 흡착시킨 후 아세톤과 같은 케톤을 함유한 유기용매로 세척하고 다시 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올과 같은 알코올류의 용액으로 용리한다. 이 때 알코올류 및 케톤을 함유한 유기용매 농도를 달리하여 순도가 높고 정제 수율이 높은 새로운 정제법을 발명하였다.

각 단계의 정제액은 HPLC로 분석하여 순도와 수율을 확인하였으며, HPLC 분석은 60%메탄올, 40%인산염완충액(K₂HPO₄2g +KH₂PO₄8g/1L H₂O)의 용매조건으로 컬럼은 25℃에서 C₁₈(Symmetry)을 사용하였으며, 0.9ml/min의 유속, 338nm 의 파장에서 분석하였다.

이하, Streptomyces pentaticus를 배지에 접종하여 생산된 배양액으로 실시 예를 들어 본 발명을 상세히 설명하였으며, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

<실시 예 1>

배양이 완료된 발효액에 잔존하는 불순물을 제거할 목적으로 여과 시 메탄올 농도에 따른 여과액의 불순물 제거율과 역가 손실률을 분석한 결과는

메탄올 5% 발효액의 경우 불순물 제거율은 12% 이며 손실률은 1% 이었다.

메탄올 10% 발효액의 경우 불순물 제거율은 15% 이며 손실률은 2% 이었다.

메탄올 15% 발효액의 경우 불순물 제거율은 19% 이며 손실률은 3% 이었다.

메탄올 20% 발효액의 경우 불순물 제거율은 45% 이며 손실률은 4% 이었다.

메탄올 30% 발효액의 경우 불순물 제거율은 52% 이며 손실률은 5% 이었다.

메탄올 40% 발효액의 경우 불순물 제거율은 55% 이며 손실률은 35% 이었다.

메탄올 50% 발효액의 경우 불순물 제거율은 62% 이며 손실률은 58% 이었다.

이 결과로부터 불순물 제거율 및 손실률을 비교해 볼 때 20% ~ 30% 메탄올을 함유한 발효액으로 여과함으로써 불순물을 제거할 수 있었고, 손실률도 적었다.

<실시 예 2>

추출 시 순도와 수율을 개선할 목적으로 메탄올 농도를 다르게 하여 여과 후 나온 균체를 추출한 추출액의 분석결과는

메탄올 40% 용액을 사용한 경우 순도는 51% 이며 수율은 18% 이었다.

메탄올 50% 용액을 사용한 경우 순도는 53% 이며 수율은 45% 이었다.

메탄올 60% 용액을 사용한 경우 순도는 58% 이며 수율은 75% 이었다.

메탄올 70% 용액을 사용한 경우 순도는 69% 이며 수율은 88% 이었다.

메탄올 80% 용액을 사용한 경우 순도는 71% 이며 수율은 90% 이었다.

메탄올 90% 용액을 사용한 경우 순도는 55% 이며 수율은 92% 이었다.

메탄올 100% 용액을 사용한 경우 순도는 52% 이며 수율은 93% 이었다.

이 결과로부터 추출액의 순도와 수율을 비교해 볼 때 70% ~80% 메탄올을 함유한 수용액으로 추출함으로써 다른 용매농도와 비교하여 우수하였다.

<실시 예 3>

발효액 배양 시 포함되어 있는 불순물 및 적색 계통의 color 물질을 제거할 목적으로 추출액을 메탄올 농도를 다르게 하여 합성흡착수지에 통과한 액의 분석결과는

메탄올 40% 용액의 경우 순도는 2% 이며 수율은 0% 이었다.

메탄올 50% 용액의 경우 순도는 5% 이며 수율은 2% 이었다.

메탄올 55% 용액의 경우 순도는 8% 이며 수율은 3% 이었다.

메탄올 60% 용액의 경우 순도는 35% 이며 수율은 35% 이었다.

메탄올 65% 용액의 경우 순도는 55% 이며 수율은 55% 이었다.

메탄올 70% 용액의 경우 순도는 78% 이며 수율은 75% 이었다.

메탄올 75% 용액의 경우 순도는 82% 이며 수율은 88% 이었다.

메탄올 80% 용액의 경우 순도는 69% 이며 수율은 93% 이었다.

메탄올 90% 용액의 경우 순도는 67% 이며 수율은 98% 이었다.

합성흡착수지에 55% 메탄올 미만에서 흡착하고 70% ~ 75% 메탄올에서 용리하여 다량의 불순물을 제거하여 순도를 향상 시킬 수 있었으며 수율 또한 개선할 수 있었고, 펜타마이신 물질 특성상 열에 불안정하므로 55% 메탄올 미만에서 흡착하여 80% 이상의 메탄올로 용리하여 농축함으로써 열을 가하여 농축하는 것보다 효과적으로 정제할 수 있어서 합성흡착수지에 1차적으로 70% ~ 75% 메탄올로 통과시켜 순도를 향상 시키고 2차로 메탄올 55% 에 재흡착하여 80% 이상의 메탄올로 용리하여 열을 가하는 별도의 농축 공정 없이 결정화공정에 적합한 농도로 조제할 수 있었다.

<실시 예 4>

발효액 배양 시 포함되어 있는 불순물을 제거할 목적으로 추출액을 합성흡착수지에 흡착한 후 아세톤 농도를 다르게 하여 통과한 액의 분석결과는

아세톤 10% 용액의 경우 불순물 제거율은 15% 이며 손실률은 5% 이었다.

아세톤 20% 용액의 경우 불순물 제거율은 55% 이며 손실률은 3% 이었다.

아세톤 30% 용액의 경우 불순물 제거율은 62% 이며 손실률은 3% 이었다.

아세톤 40% 용액의 경우 불순물 제거율은 68% 이며 손실률은 2% 이었다.

아세톤 50% 용액의 경우 불순물 제거율은 32% 이며 손실률은 35% 이었다.

아세톤 60% 용액의 경우 불순물 제거율은 25% 이며 손실률은 37% 이었다.

아세톤 70% 용액의 경우 불순물 제거율은 19% 이며 손실률은 42% 이었다.

이 결과로부터 발효 추출액이 합성흡착수지에 흡착된 상태에서 20% ~ 40% 아세톤을 함유한 수용액을 통과함으로써 다량의 불순물을 제거할 수 있었고, 손실률도 적었다.

<실시 예 5>

고순도의 펜타마이신을 제조할 목적으로 결정화 시 합성흡착수지 용리액에 열에 불안정한 물질 특성상 농축을 하지 않고 정제수를 첨가하여 메탄올 농도를 다르게 결정화한 분석결과는

메탄올 40% 용액의 경우 순도는 82% 이며 수율은 92%이었다.

메탄올 45% 용액의 경우 순도는 83% 이며 수율은 91%이었다.

메탄올 50% 용액의 경우 순도는 95% 이며 수율은 90%이었다.

메탄올 55% 용액의 경우 순도는 96% 이며 수율은 89%이었다.

메탄올 60% 용액의 경우 순도는 88% 이며 수율은 35%이었다.

메탄올 65% 용액의 경우 순도는 83% 이며 수율은 11%이었다.

이 결과로부터 합성흡착수지 용리액에 정제수를 첨가하여 50% ~ 55% 메탄올로 조절해 결정화함으로써 순도를 극대화함과 동시에 수율도 높일 수 있었다. 그리고 3차 정제 단계를 거쳐 합성흡착수지에서 용리된 정제액을 농축하여 결정화하는 농축법과 정제수를 첨가하여 결정화하는 정제수 첨가법을 비교 분석한 결과 [표 1]에서 나타내었듯이 정제수 첨가법이 농축법과 비교하여 결정의 수율은 비슷하나 순도 면에서는 훨씬 우수하였다.

	결정화 조건	순도(%)	수율(%)
감압 농축법	45± 5℃, 650mmHg, 3시간 농축	82	92
정제수 첨가법	상온(20± 5℃), 3시간 교반	95	91

본 발명에서와 같이 메탄올과 같은 알코올류 및 아세톤과 같은 케톤을 함유한 유기용매의 농도별 처리와 합성흡착수지 및 정제수를 첨가하여 최종 결정화할 경우 고순도 및 수율이 증가된 펜타마이신을 생산할 수 있으며 곧바로 산업적으로 이용할 수 있는 장점이 있다.

Claims (6)

1. 불순물을 함유한 펜타마이신 용액 또는 발효 추출액을 HP20, HP20SS 및 HZ-802 등의 합성흡착수지와 아세톤과 같은 케톤을 함유한 유기용매와 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올과 같은 알코올류의 농도를 달리하여 정제하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 20% ~ 30% 알코올을 함유한 발효액으로 여과함으로써 불순물을 제거하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 70% ~80% 알코올을 함유한 수용액으로 여과 후 나온 균체를 추출함으로써 순도 및 수율을 높이는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 합성흡착수지에 55% 이하 농도의 알코올 용액으로 흡착하고 70% ~ 75% 알코올에서 용리하여 순도 및 수율을 높이며, 55% 알코올 미만에서 흡착하여 80% 이상의 알코올로 용리하여 농축하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 합성흡착수지에 흡착시킨 후 20% ~ 40% 아세톤과 같은 케톤을 지닌 유기용매를 함유한 수용액을 통과함으로써 불순물을 제거하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 합성흡착수지의 용리액을 정제수를 첨가하여 50% ~ 55% 알코올로 조절하여 결정화함으로써 순도를 향상시키고 수율을 높이는 방법.