CN102272320B - 纯化万古霉素湿体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了纯化万古霉素湿体的方法，包括：将从含有万古霉素的微生物发酵液中获得的湿体溶解到水溶性溶剂中，使浓度为大约1到40g/L，再进行反渗透过滤；将滤出的万古霉素进行冷冻干燥处理。所述的纯化万古霉素湿体的方法提供了高纯度的万古霉素，同时避免了其在干燥步骤中的稳定性降低。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用反渗透纯化万古霉素湿体的方法，尤其是，本发明涉及一种纯化万古霉素湿体的方法，能避免制备万古霉素过程中进行干燥步骤时，由较差的温度稳定性引起的纯度降低。
背景技术
万古霉素的由下面的化学式I表示，它是由放线菌属的微生物，即东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orienatalis)(ATCC 19795)菌株产生的。万古霉素也可以通过将-O-万古糖胺--O-葡萄糖(-O-vancosamin--O-glucosyl-)与七肽进行化学键接制备。此外，万古霉素是分子量约1449的糖肽类抗生素，通过与末端为D-ala-D-ala的粘肽前体结合，从而抑制细胞壁合成的机理，来实现其抗生素活性。通常，万古霉素对抑制如下菌群有很好的药理学作用：革兰氏阳性菌例如链球菌属、葡萄球菌属、梭状芽胞杆菌，以及对青霉素或头孢霉素有抗生素抗性的革兰氏阳性菌。
【化学式I】
另外，众所周知，万古霉素在抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的治疗方面非常有效，该菌对手术病人、老年和低免疫力病人是致命的。该万古霉素盐，尤其是盐酸万古霉素当前已经用作口服(液体或者胶囊)或注射制剂。
至今，已经知道多种分离纯化万古霉素的技术方法，其中典型的例子如下：
美国专利号7,018,814和韩国专利号554481公开的一种纯化盐酸万古霉素的方法，包括：(a)将含有万古霉素的微生物发酵液在pH 1-3的条件下，通过强酸阳离子交换树脂，以pH 9-11且浓度为0.05-0.2N的氢氧化铵水溶液作为洗脱剂；(b)将得到的溶液pH调至3-5，将其连续通过弱碱性的阴离子交换树脂和氧化铝柱，随后用水冲洗，去除色素；(c)将得到的溶液通过疏水吸附树脂，用C1-C4醇的水溶液作为洗脱剂；(d)通过在得到的溶液中加入盐酸，将pH调到2-5，再加入包括C1-C4醇、乙腈、丙酮或者甲基异丁基甲酮的水溶性有机溶剂以使盐酸万古霉素结晶。
根据上述专利所述，通过分离纯化含有万古霉素的微生物发酵液中的结晶步骤来获得结晶体，过滤结晶体，取过滤沉淀物(结晶体)进行真空干燥(比如在40℃或更低的温度进行真空干燥)以获得盐酸万古霉素。
美国专利No.5,853,720公开了一种纯化万古霉素的方法，包括将微生物发酵液经过采用硅胶柱的制备色谱处理，再用乙醇将其从盐-水-乙醇混合溶液中沉淀出来。根据上述专利，在培养-精密过滤-离子交换树脂吸附后，从硅胶柱得到主要馏分(平均纯度：93％)和次要馏分(纯度90％或更低)。对于主要馏分，进行浓缩-过滤-浓缩和脱色，然后进行高温喷雾干燥(进气口温度：115-130℃，出气口温度：85±5℃)、真空干燥(45-50℃)，得到干燥的固体产物。另一方面，对于次要馏分，酸化后通过反渗透过程进行脱盐、浓缩，添加乙醇和氯化钠之后，用醇沉淀(结晶)，然后进行冷却和过滤，接着将得到的产物重新进入硅胶柱，进行与主要馏分相同的处理。就上述的纯化过程来看，包括了相对大量的步骤(至少7到11步)。尽管上述专利描述了在用硅胶柱处理后获得的万古霉素(盐)的纯度，但没有描述在随后的步骤中(尤其是反渗透过滤步骤和真空干燥步骤)纯度的改变。正如下文中所描述的，尽管通过上述过程能获得纯度为93％或更高的万古霉素，但在随后的干燥过程(尤其是高温喷雾干燥，45-50℃时进行的真空干燥)中纯度会下降。因此难以获得符合欧洲药品标准规定纯度的产物，即纯度93％或更高。
然而，根据相关技术，上述方法引起如下这样的问题，在1-2天的真空干燥中至少3.2％，至多5.6％的纯度降低，以及万古霉素稳定性的降低。另外，当真空干燥步骤在降低的25℃温度下进行时，同样的时间内，纯度变化仅仅小于1％，但得到的产物含有杂质，包括至少0.5％的乙醇以及高达4-10％的水分。
如上所述，万古霉素是对温度敏感的药物，因此45-50℃的真空干燥不能确保纯度方面的稳定性。另一方面，真空干燥温度降低到40℃或更低不能满足乙醇含量和含水量标准。因此，在传统的纯化过程中，将这样的真空干燥作为制备干燥产物的最后一步，对于高效生产稳定的高纯度的万古霉素是不合适的。并且，根据相关技术，上述专利仅强调分离和纯化过程，并没有特别描述由干燥步骤引起的稳定性和纯度降低问题。
同时，根据欧洲药品标准(欧洲药品6.0)，特别对于稳定的高纯度万古霉素，要求万古霉素具有93％或更高的纯度，含水量至多5％。按照国际协调会议(ICH)协调的三方指南(杂质：残余溶剂指南)还要求万古霉素的乙醇含量低于约0.5％。在这种情况下，迫切需要发展万古霉素纯化方法，避免由较差的温度稳定性引起的纯度下降，满足涉及药品的各种标准。
发明内容
技术问题
为了克服现有技术中的上述问题，我们进行了很多研究。最终，我们发展出了制备高纯度万古霉素的方法，其将万古霉素湿体通过反渗透过滤浓缩和冷冻干燥，确保干燥步骤中的稳定性，所述湿体经由从含有万古霉素的微生物发酵液中纯化万古霉素(尤其是万古霉素盐如盐酸万古霉素)的方法获得。
因此，本发明的目的是提供纯化万古霉素湿体的方法，该方法能够避免万古霉素纯化过程中，由于干燥步骤中的稳定性降低所导致的纯度下降。
该发明的另一目的是提供可以满足欧洲药品标准等各种标准需要的纯化万古霉素湿体的方法。
技术问题的解决方法
一方面，提供了纯化万古霉素湿体的方法，包括步骤：
a)将从含有万古霉素的微生物发酵液获得的湿体溶解到水溶性溶剂中，使浓度为约1到40g/L，然后进行反渗透过滤；
b)对所述过滤后的万古霉素进行冷冻干燥。
发明的有益效果
这里公开的纯化万古霉素湿体的方法，解决了传统的万古霉素纯化方法的干燥步骤中出现的关于稳定性降低的问题，提供了高纯度的万古霉素。因此，预计该方法具有高的工业适用性。
附图的简要说明
通过下面的详述，并结合相应的附图来看，会发现本发明上述的和其他方面的特点和优点会更加的明显。
图1a，图1b和图1c表示湿体、经反渗透过滤后获得的浓缩物和冷冻干燥产物的高效液相色谱法(HPLC)分析结果，每一个图表明了根据实施例1含有万古霉素的湿体进行纯化过程中万古霉素纯度的变化；
图2是表示根据实施例1-4含有万古霉素的湿体进行纯化过程中万古霉素纯度变化的图；
图3是表示根据比较实施例1含有万古霉素的湿体进行纯化过程中万古霉素纯度变化的图；并且
图4是表示根据比较实施例3含有万古霉素的湿体进行纯化过程中万古霉素纯度变化的图。
本发明的最佳实施方式
下文对实施例进行充分的描述。然而，本发明以许多不同的形式体现，不应该只局限于此处列出的实施例。当然，提供这些实施例，使得本发明公开更完整、更充分，使本领域技术人员更充分地理解本发明的范围。
此处在提及含有万古霉素的微生物发酵液时，所用的术语‘微生物’不限于特定的物种，而是指能够产生并在其培养物中积累万古霉素的微生物。这些微生物的具体例子在美国专利No.3,067,099和No.5,235,037和韩国专利No.554481中进行了描述，其中的教导全文引入本发明作为参考。例如，如上所述，含有万古霉素的微生物发酵液可以通过培养(或振荡培养)如下微生物获得：东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)，特别是东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)(ATT 19795)或是东方诺卡菌(Norcardiaorientalis)，特别是东方诺卡菌(Nocardia orientalis)NRRL 2452。
实施根据本发明的方法，纯化从含有万古霉素的微生物发酵液中获得的湿体。
此处所用的术语“湿体”指的是从含有万古霉素的微生物发酵液中获得后仍包含水分的万古霉素。所述湿体含水量约10-99％(w/v)，优选约30-50％(w/v)。具体的，术语“湿体”指的是纯化时或纯化后通过结晶(尤其在乙醇中结晶)、过滤获得的未干燥的晶体，其中，晶体分离自混有水溶性有机溶剂的结晶溶液。另外，所述湿体包括纯度约93％或者更高的万古霉素，优选约95％或者更高，固体含量约10-90％，优选约50-70％。
如上所述，传统的包括色谱法、结晶等的分离-纯化方法(具体的，以结晶为基础的分离方法)可以用于从含有万古霉素的微生物发酵液中获得万古霉素湿体。特别是如韩国专利公开号1998-39737A所描述的，对含有万古霉素的微生物发酵液以多步骤方式进行分离纯化，然后进行浓缩和在乙醇中结晶，来获得湿体。更特别地，对含有万古霉素的微生物发酵液以多步骤方式进行分离纯化，浓缩至约150-200g/L的浓度，在导电率约为15-25ms/cm且pH约2-4的条件下，加入体积比大约1.5-2的乙醇，在乙醇中进行结晶。用这种方法，可获得所述湿体。
此外，如韩国专利No.554481中所描述的，通过依次经过强酸性阳离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂、无水矾石疏水吸附树脂，含有万古霉素的微生物发酵液可以进行分离纯化来获得湿体。上述的专利中的教导全文引入这里作为参考。
反渗透过滤
根据本发明的一个具体实施方式，湿体会先溶解在水溶性溶剂中，浓度约1到40g/L，优选约15-30g/L。此处，水溶性溶剂的具体例子，可以包括水、C1-C4脂肪醇(比如甲醇、乙醇、异丙醇等)或它们的混合物，优选水，更优选净化水。如果在水溶性溶剂中的湿体的浓度太高，由于湿体中含有的有机溶剂如乙醇，将导致所述湿体的溶解需要极其长的时间。特别是，如果乙醇的含量高于水的含量，湿体不能完全溶解，因此在反渗透之前进行的预过滤相对复杂，并且没溶解的万古霉素会引起产量的下降。另一方面，如果湿体浓度过低，不管乙醇的含量高低，湿体会很容易溶解。然而，在这种情况下，预过滤和反渗透过滤需要更长的时间，导致整体的效率降低。因此，更好的是控制水溶性溶剂中的湿体浓度在上述范围内。
如上所述，湿体在水溶性溶剂中溶解到合适的浓度后，通过反渗透(过滤)步骤去除湿体中的杂质，同时万古霉素得到浓缩。根据优选的实施方式，在反渗透过滤之前预过滤，所述预过滤优选使用孔径大小约0.1-0.6μm，特别是大约0.45μm的无菌过滤器。该预过滤在反渗透过滤之前进行，因为它通过去除不溶性杂质使反渗透更容易进行，并提供了无菌的万古霉素。
进行反渗透步骤，也即反渗透过滤，从水和C1-C4脂肪醇混合物中除去盐，例如氯化铵、氯化钠或氯化钾，或者有机溶剂例如脂肪醇。用于反渗透过滤的滤膜通常由聚酰胺，聚砜，聚丙烯，氨基甲酸乙酯，或类似物制得。滤膜截留分子量优选约100-500，更优选约200-400。如果滤膜截留分子量过低，用相同的膜进行过滤就需要长的时间并且增加了所述的操作压力，导致分离万古霉素变得困难。另一方面，如果滤膜截留分子量过高，用相同的膜过滤会减少万古霉素或万古霉素盐的产量。因此，最好使用具有上文限定的截留分子量范围的滤膜。这些滤膜的具体例子包括NanomaxTM50 RO Spiral cartridge(可购自Millipore公司)，TFC-SRlOO-T(KOCK膜系统)，或是类似的膜。
所述反渗透过滤膜和系统的优选操作条件描述在下面的表1中，但本发明的范围不局限于此。
表1
【表1】
【表】
另外，在反渗透过滤膜和系统中可用的有机溶剂和盐的具体实施例在下面的表2中描述。
表2
【表2】
【表】
| 有机溶剂和盐 | 最大浓度(％)* |
| 氢氧化钠 | 10.5 |
| 过氧化氢 | 0.25 |
| 乙醇 | 96 |
| 甲醇 | 50 |
| 硫酸 | 2 |
| 磷酸 | 2 |
| 乙酸 | 5 |
| 草酸 | 5 |
| 柠檬酸 | 5 |
| 乙二醇 | 60 |
| 甘油 | 100 |
| 丙酮 | 5 |
| 甲基乙基酮 | 5 |
| 四氢呋喃 | 5 |
| 二恶烷 | 5 |
| DMF(二甲基甲酰胺) | 5 |
| DMSO(二甲基亚砜) | 5 |
| 盐酸 | 2 |
| 氨 | 10.5 |
| IPA(异丙醇) | 90 |
| 丁醇 | 90 |
*：相对于水的％浓度
根据本发明的优选实施方式，万古霉素通过反渗透过滤，浓缩到浓度大约50-200g/L，优选大约120-180g/L。浓缩之后，过高的浓度容易引起沉淀，从而增加了浑浊度，降低了纯度。另一方面，过低的浓度会增加进行冷冻干燥的样品的体积。因而需要长时间来进行样品的冷冻干燥。此外，这种过低的浓度会导致低的产率和低的效率。因此，最好调整反渗透过滤以提供上文限定的浓度范围。并且最好控制乙醇浓度低于约0.5％(w/v)，更好地是大约0.1-0.3％(w/v)。这是由于过低的乙醇含量会导致增加所需的反渗透过滤时间，以增加乙醇的去除，导致效率降低；而过高的乙醇含量为了冷冻干燥中减少含水量，会导致时间延长，导致效率降低。
根据本发明，经过反渗透过滤浓缩的万古霉素的纯度(优选95％或更高)与湿体的纯度相似。并且，过滤中损失在滤液里的万古霉素不到约1％.
冷冻干燥
然后，对经过反渗透过滤浓缩的万古霉素进行冷冻干燥。术语冷冻干燥通常被认为是干燥过程，其中物质进行冷冻，且水蒸气分压减小，使得固体水升华成气体。在热能供应存在下，以冰的形状存在的水不转化成液态，而是通过减小分压升华成水蒸气。根据本发明，冷冻干燥时的浓缩万古霉素的纯度基本上(优选纯度变化小于约1％)维持在约93％或者更高，优选约95％或更高，乙醇含量减少到低于约0.5％(w/v)，优选低于0.3％(w/v)左右，并且含水量减少到低于5％(w/v)左右，优选低于约4％(w/v)，更优选低于约3％(w/v)。
根据本发明中优选的实施方式的冷冻干燥步骤，浓缩的万古霉素在大约-4到-196℃下，优选大约-40到-150℃，更优选大约-70℃下冷冻干燥约3-48小时，优选约12-36小时。然后，操纵冷冻干燥系统经约12-48小时，优选约24-36小时，从约-60℃上升到约40℃，优选从约-40℃上升到约20℃逐渐提升系统温度。之后，以上的条件维持约6-24小时，优选约12-18小时。
在本文中，注意到用冷冻干燥代替现有技术中使用的传统的干燥步骤，尤其是喷雾干燥和/或真空干燥，可以维持高纯度的万古霉素的纯度稳定，以满足各种关于乙醇和含水量的标准。
发明实施例
在下文中，将参考实施例来更详细说明本发明。以下的实施例只是用于说明目的，无意于限定本发明公开的范围。
在下面的实施例中，使用的系统具有下文中描述的配置。
HPLC：安捷伦科技公司(Agilent Technologies)
层析柱：ODS(C18)，4.6X 250，5mm
分析条件
1.pH 3.2TEA缓冲液：4ml TEA(三乙胺)加到1996ml水中，用磷酸调节pH到3.2。
2.流动相
-流动相A：pH 3.2TEA缓冲液920ml，ACN(乙腈)70ml和THF(四氢呋喃)10ml的混合溶液。
-流动相B：pH 3.2TEA缓冲液700ml，ACN 290ml和THF 10ml的混合溶液。
3.梯度洗脱按照下面表3描述的方法进行。
表3
【表3】
【表】
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0-13 | 100 | 0 |
| 13-22 | 100→0 | 0→100 |
| 22-26 | 0 | 100 |
4.流速：1ml/min
5.吸收度：280nm
6.注射体积：20ml
预备实施例1：从含有万古霉素的微生物发酵液中收集湿体(1)
如韩国专利公开号No.1998-39737A中描述的，含有万古霉素的微生物发酵液以多步方式分离纯化，浓缩万古霉素到浓度180g/L，在其中加入氯化铵调节电导率到21ms/cm，再加入HCl调节pH到2.8。在这些条件下，再按体积比为1.8加入乙醇以在乙醇中进行结晶，从而产出湿体。湿体纯度为96.6％，固体含量为54％，乙醇和含水量为45％。
预备实施例2：从含有万古霉素的微生物发酵液中收集湿体(2)
如韩国专利公开号No.1998-39737A中描述的，含有万古霉素的微生物发酵液以多步方式分离纯化，浓缩万古霉素到浓度176g/L，在其中加入氯化铵调节电导率到23ms/cm，再加入HCl调节pH到2.5。在这些条件下，再按体积比为1.8加入乙醇以在乙醇中进行结晶，从而产出湿体。湿体纯度为96.2％，固体含量为55％，乙醇和含水量为40％。
预备实施例3：从含有万古霉素的微生物发酵液中收集湿体(3)
如韩国专利公开号No.1998-39737A中描述的，含有万古霉素的微生物发酵液以多步方式分离纯化，浓缩万古霉素到浓度190g/L，在其中加入氯化铵调节电导率到20ms/cm，再加入HCl调节pH到2.2。在这些条件下，再按体积比为1.8加入乙醇以在乙醇中进行结晶，从而产出湿体。湿体纯度为95.8％，固体含量为51％，乙醇和含水量为50％。
预备实施例4：从含万古霉素微生物发酵也中收集湿体(4)
如韩国专利公开号No.1998-39737A中描述的，含有万古霉素的微生物发酵液以多步方式分离纯化，浓缩万古霉素到浓度175g/L，在其中加入氯化铵调节电导率到22ms/cm，再加入HCl调节pH到2.5。在这些条件下，再按体积比为1.8加入乙醇以在乙醇中进行结晶，从而产出湿体。湿体纯度为96.2％，固体含量为42％，乙醇和含水量为55％。
实施例1
反渗透过滤
首先，将根据预备实施例1获得的190g湿体溶解到2L净化水中，然后通过0.45μm无菌过滤系统(可购自Whatman Ltd.，由硝酸纤维素制成，产品名：一次性过滤漏斗)过滤。然后，在其中加入净化水到最终溶液体积4L。接着，将得到的溶液加到反渗透系统(可购自Millipor公司，产品名：Helicon反渗透系统，膜：NanomaxTM 50膜)进样口中，然后，气压保持在8bar，进行浓缩。通过反渗透过滤浓缩溶液，直到获得约3L滤液后，加入2L净化水。然后，在相同的压力进一步浓缩溶液，直到获得2L滤液，然后再加入2L净化水，溶液再进一步浓缩到终体积约0.5L。然后，系统减压，获得的浓缩物恢复10分钟。
分析经恢复的浓缩物后，表明万古霉素纯度为96.4％，浓度为118g/L，乙醇含量为0.38％(w/v)。
冷冻干燥
将浓度为118g/L的万古霉素浓缩物倒入铁制容器中，液面低于容器1cm，再在-70℃下充分冻干一天。然后，含有冻干浓缩物的铁制容器放入到冷冻干燥系统(可购自Labconco，产品名称：冷冻干燥系统)中，搁板温度控制在-40℃，冷冻干燥42小时。分析冻干的万古霉素。
分析表明冷冻干燥后24小时万古霉素纯度没有变化(96.4％)，乙醇含量和含水量分别为0.25％(w/v)和3.4％(w/v)。
在这个实施例中，通过HPLC分析来观察从湿体中纯化万古霉素的过程中的纯度变化。结果如图1a-1c所示。
如图1a-1c所示，在湿体(图1a)、反渗透过滤后获得的浓缩物(图1b)和冷冻干燥产物(图1c)之间，万古霉素相应的峰面积没有实质上的改变。这说明以上的纯化方法抑制了万古霉素纯度的降低。
实施例2
反渗透过滤
首先，将根据预备实施例1获得的250g湿体溶解到2L净化水中，然后通过0.45μm无菌过滤系统(可购自Whatman Ltd.，由硝酸纤维素制成，产品名：一次性过滤漏斗)过滤。然后，在其中加入净化水到最终溶液体积5L。接着，将得到的溶液加到反渗透系统(可购自Millipor公司，产品名：Helicon反渗透系统，膜：NanomaxTM 50膜)进样口中，然后，气压保持在8bar，进行浓缩。浓缩溶液，直到获得约3L滤液，之后，加入3L净化水。然后，在相同的压力进一步浓缩溶液，直到获得3L滤液，然后再加入3L净化水，溶液再进一步浓缩到终体积约0.5L。然后，系统减压，获得的浓缩物恢复10分钟。
分析所述经恢复的浓缩物后，表明万古霉素纯度为96.4％，浓度为142g/L，乙醇含量0.24％(w/v)。
冷冻干燥
将浓度为142g/L的万古霉素浓缩物倒入铁制容器中，液面低于容器1cm，再在-70℃下充分冻干一天。然后，所述含有冻干浓缩物的铁制容器放入到冷冻干燥系统(可购自Labconco，产品名称：冷冻干燥系统)中，搁板温度控制在-40℃，冷冻干燥42小时。分析冻干的万古霉素。
分析表明冷冻干燥后24小时万古霉素纯度没有变化(96.4％)，乙醇含量和含水量分别为0.11％(w/v)和2.7％(w/v)。
实施例3
反渗透过滤
首先，将根据预备实施例2获得的290g湿体溶解到2L净化水中，然后通过0.45μm无菌过滤系统(可购自Whatman Ltd.，由硝酸纤维素制成，产品名：一次性过滤漏斗)过滤。然后，在其中加入净化水到最终溶液体积6L。接着，将得到的溶液加到反渗透系统(可购自Millipor公司，产品名：Helicon反渗透系统，膜：NanomaxTM 50膜)进样口中，然后，气压保持在8bar，进行浓缩。浓缩溶液，直到获得约3L滤液，之后，加入3L净化水。然后，在相同的压力进一步浓缩溶液，直到获得3L滤液，然后再加入3L净化水，溶液再进一步浓缩到终体积约0.5L。然后，系统减压，获得的浓缩物恢复10分钟。
分析所述经恢复的浓缩物后，表明万古霉素纯度为96.0％，浓度为176g/L，乙醇含量0.22％(w/v)。
冷冻干燥
将浓度为176g/L的万古霉素浓缩物倒入铁制容器中，液面低于容器1cm，再在-70℃下充分冻干一天。然后，所述含有冻干浓缩物的铁制容器放入到冷冻干燥系统(可购自Labconco，产品名称：冷冻干燥系统)中，搁板温度控制在-40℃，冷冻干燥42小时。分析冻干的万古霉素。
分析表明冷冻干燥后24小时万古霉素纯度(95.8％)发生了很小的变化，乙醇含量和含水量分别为0.18％(w/v)和3.0％(w/v)。
实施例4
反渗透过滤
首先，将根据预备实施例2中获得的274g湿体溶解到2L净化水中，然后通过0.45μm无菌过滤系统(可购自Whatman Ltd.，由硝酸纤维素制成，产品名：一次性过滤漏斗)过滤。然后，在其中加入净化水到最终溶液体积6L。接着，将得到的溶液加到反渗透系统(可购自Millipor公司，产品名：Helicon反渗透系统，膜：NanomaxTM 50膜)进样口中，然后，气压保持在8bar，进行浓缩。浓缩溶液，直到获得约3L滤液，之后，加入3L净化水。然后，在相同的压力进一步浓缩溶液，直到获得3L滤液，然后再加入3L净化水，溶液再进一步浓缩到终体积约0.5L。然后，系统减压，获得的浓缩物恢复10分钟。
分析所述经恢复的浓缩物后，表明万古霉素纯度为96.0％，浓度为162g/L，乙醇含量0.09％(w/v)。
冷冻干燥
将浓度为162g/L的万古霉素浓缩物倒入铁制容器中，液面低于容器1cm，再在-70℃下充分冻干一天。然后，所述含有冻干浓缩物的铁制容器放入到冷冻干燥系统(可购自Labconco，产品名称：冷冻干燥系统)中，搁板温度控制在-40℃，冷冻干燥42小时。分析冻干的万古霉素。
分析表明冷冻干燥后24小时万古霉素纯度(95.8％)发生了很小的变化，乙醇含量和含水量分别为0.08％(w/v)和3.1％(w/v)。
图2表示的是在纯化含有万古霉素的湿体的过程中万古霉素纯度的变化，对应于实施例1-4。可以从图2中看出，依照本发明的纯化过程中，万古霉素的纯度始终保持稳定，没有任何明显的降低。
比较实施例1
根据美国专利No.7,018,814和韩国专利No.554481获得干的万古霉素。换句话说，从预备实施例3获得的50g湿体在40℃真空干燥48小时。正如图3所示，真空干燥12小时后万古霉素纯度为93.0％；真空干燥18小时后92.8％；真空干燥24小时后91.9％；真空干燥36小时后90.6％；真空干燥42小时后90.3％；真空干燥48小时后90.2％。在2天的真空干燥过程中，乙醇含量和含水量分别为0.09％和2.9％。从以上的结果可以看出，实际上真空干燥可能不适合用于万古霉素的纯化，因为2天的真空干燥过程会导致万古霉素纯度降低至少约5％。
比较实施例2
除了在25℃进行5天真空干燥外，重复比较性实施例1。真空干燥后，万古霉素纯度为94.6％，乙醇含量0.6％(w/v)，含水量为8％(w/v)，这不能满足欧洲药品标准。
比较实施例3
按照如美国专利No.5,853,720所公开的方法获得干的万古霉素。换句话说，由预备实施例4获得的69.7g湿体溶解到净化水中，终体积为200ml，浓度调节到150g/L，然后用喷雾干燥器(可购自BUCHI，产品名：小型喷雾干燥器B-191)干燥。为了进行喷雾干燥，入口温度和出口温度分别被设定为130℃和85℃。样品进样速度为5ml/min。
喷雾干燥之后，万古霉素纯度为94.9％，含水量为8.6％(w/v)。回收喷雾干燥样品并在40℃真空干燥两天。如图4所示，真空干燥后12小时，万古霉素纯度为93.7％(C)，真空干燥后36小时，93.3％(D)，真空干燥后48小时，92.8％(E)。另外，真空干燥后48小时，含水量为4.6％(w/v)。因此，这种喷雾干燥和真空干燥引起纯度降低至少3％。而且，认为乙醇含量0.2％(w/v)，含水量约5％(w/v)左右，与标准值接近，限制了稳定的高纯度万古霉素的制备。
这里描述了示例性的实施方式，本领域技术人员应当理解此外所作的各种形式和细节的变化，未脱离通过权利要求书限定的本发明的精神和范围。
此外，为适应具体的情况或材料，可以对本发明的教导进行不脱离其实质范围的修饰。因此，意味着本发明不局限于作为预期的能够实现本发明的最佳方式出现的特定的示例性的实施方式，本发明包括落入权利要求范围的所有的实施方式。
Claims (5)
1.一种纯化万古霉素湿体的方法，湿体是从含有万古霉素的微生物发酵液中获得后仍包含水分的万古霉素，所述方法由以下步骤组成：
从含有万古霉素的微生物发酵液中获得湿体，其中所述湿体含水量为30-50％(w/v)且包含纯度为93％或者更高的万古霉素，
将所述湿体溶解到水溶性溶剂中，使浓度为1到40g/L，
进行无菌过滤和反渗透过滤，过滤后的万古霉素浓度为50到200g/L，从而得到95％或更高的纯度；并且
对所述过滤后的万古霉素进行冷冻干燥，
其中冷冻干燥后的万古霉素具有95％或更高的纯度，乙醇含量低于0.3％(w/v)，含水量低于5％(w/v)。
2.根据权利要求1所述的纯化万古霉素湿体的方法，其中所述的水溶性溶剂为水或C1-C4脂肪醇和水的混合物。
3.根据权利要求1所述的纯化万古霉素湿体的方法，其中所述的反渗透过滤使用100到500的截留分子量的膜。
4.根据权利要求1所述的纯化万古霉素湿体的方法，其中所述过滤后的万古霉素的乙醇含量低于0.5％(w/v)。
5.根据权利要求1所述的纯化万古霉素湿体的方法，其中所述冷冻干燥包括：
在-4℃到-196℃冷冻所述的过滤后的万古霉素3到48小时；并且
在冷冻干燥器中，从-60℃到40℃逐渐提升所述冷冻干燥器温度，冷冻干燥所述的冷冻后的万古霉素12到48小时。
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