CN102558302A

CN102558302A - 一种分离纯化普那霉素的方法

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Publication number: CN102558302A
Application number: CN2011104196648A
Authority: CN
Inventors: 王云娜
Original assignee: BEIJING KELANG HONGDA TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: BEIJING KELANG HONGDA TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了一种分离纯化普那霉素的方法，属于生物技术领域。该方法的主要步骤为：吸附树脂洗脱、纳滤浓缩、溶媒结晶、浓缩干燥后获得普那霉素成品，经检测其纯度达到98％以上，产品收率高于68％。本发明采用上述分离纯化获得普那霉素，能耗低，设备结构简洁紧凑，方法易行，操作安全方便，易于实现自动化生产。

Description

一种分离纯化普那霉素的方法

一、技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及到一种分离纯化普那霉素的方法。

二、背景技术

近年来，临床上分离的病原菌的种类及药敏类型均发生了很大的变化，MRSA、VRE、PPSP等耐药菌引起的严重感染使可选用药物相对减少，故很有必要寻找新的有效的治疗药物。普那霉素又名原始霉素，是由始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)产生的一类能抗多重耐药菌的链阳性菌素类抗生素，其由两类化学性质不同的物质组成，分别是属于B族链阳性菌素的普那霉素I(PIA、PIB、PIC)和属于A族链阳性菌素的普那霉素II(PIIA、PIIB)，二者组合比例大约是30％的普那霉素I和70％的普那霉素II。

1、普那霉素的功能及应用

(1)抗菌活性

试验表明普那霉素在体内、外对众多革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌及厌氧菌都具有较强的杀菌作用，对甲氧西林、红霉素耐药或敏感的金葡球菌、溶血葡球菌、表葡球菌、肺炎链球菌等皆具有很强的抗菌活性。体外试验表明，普那霉素与万古霉素存在协同作用，且体内试验显示普那霉素对红霉素耐药或敏感的MRSA的疗效同万古霉素相当。此外，普那霉素还可有效预防红霉素耐药或敏感的链球菌引起的心膜炎。

另外，普那霉素具有较长的抗生素后效应。Videau等通过小鼠的体内、体外试验发现，在普那霉素作用之后的15～20h内，细菌的生长繁殖仍表现出明显的受抑制状态。

(2)临床应用

普那霉素对很多种感染具有较好的疗效，如皮肤和软组织感染、传染性肺炎、医院获得性肺炎(作为联合治疗的一部分)、心内膜炎、菌血症及脓毒血症等。美国FDA专家小组推荐普那霉素用于皮肤及软组织感染治疗、医院获得性肺炎以及万古霉素耐药屎肠球菌(VREF)感染的急重症病人。据统计，普那霉素对于万古霉素耐药VRE感染引发的菌血症病人的临床治疗有效率达70％；而对MRSA引起的皮肤软组织感染、医院获得性肺炎、菌血症的临床有效率约为70％-75％。与万古霉素相似，普那霉素亦对严重骨关节感染有显著疗效。在以上所有应用普那霉素治疗的病例中很少出现治疗引起的耐药菌。普那霉素可作为万古霉素的替代药物，在治疗多重耐药革兰氏阳性菌引起的感染中发挥其应有的作用。

2、普那霉素提取技术研究现状

自从1964年罗纳-普朗克罗瑞公司就普那霉素的传统发酵生产方法申请了专利以来，普那霉素的研究开发工作一直未受到人们足够的重视。直到20世纪90年代，由于临床上MRSA、VRE以及多重耐药的“超级细菌”的出现，甚至连治疗多重耐药菌的最后一道防线-万古霉素都显得“捉襟见肘”时，普那霉素这类链阳性菌素类抗生素又开始重新受到人们的关注。但大部分研究工作集中在与普那霉素生物合成相关的酶及基因克隆、普那霉素水溶性衍生物的开发、抗菌活性及临床应用等方面，而在普那霉素发酵、提取等生产工艺方面的研究则明显不足。

普那霉素关于分离纯化的研究报道较少。迄今为止，文献和专利中已经报道过的分离纯化方法主要包括有机溶剂萃取、双水相萃取和高速逆流色谱法。罗纳-普朗克罗瑞公司的专利最早报道了采用有机溶剂从发酵液中提取普那霉素的方法：发酵液酸化处理后再经过二氯乙烷逆流离心提取、减压干燥、石油醚沉淀、干燥等纯化步骤后得到普那霉素成品，其中普那霉素的含量约为80％左右。Paquet等用“葡聚糖-聚乙二醇(PEG)”双水相系统从始旋链霉菌发酵液中萃取分离普那霉素，并以PEG与PEG脂肪酸酯混合液替代PEG相，使分离效果得到了显著提高。Drogue等用“氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水”作为溶剂系统，对普那霉素粗品采用高速逆流色谱法纯化条件进行了初步的研究。研究表明，以氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝2∶2∶3∶2(v∶v)作为溶剂系统，PIIA和PIIB组分的分离度能达到2.21，但该溶剂系统对PIA和PIIB组分的选择性较差。考虑到PI组分的酸碱性质，他们又在上述溶剂系统中加入甲酸来调节pH值以增强其对PIA组分的选择性，研究发现以氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸＝2.4∶1.6∶3∶2∶0.4(v∶v)作为溶剂系统，只需30min即可分离PIA和PIIB组分，且二者的分离度也可接近2。

表1文献中报道的普那霉素分离纯化方法的优缺点比较

目前文献中所报道的分离纯化方法均不能在制备阶段获得足够纯的产品，不能以足够稳定和可重现的质量进行批量生产。由于天然普那霉素的工业批量产品经纯化后还含有高达20％左右的杂质，这就无法满足一些国家在药品注册方面的法规要求，所以普那霉素的销售被严格限制在诸如法国、比利时等少数欧洲国家，导致了不少地区失去了对“超级细菌”引起的严重感染的有效治疗。Shanna等通过对以“普那霉素”和“维吉尼霉素”为代表的链阳性菌素的分离纯化方法的研究发现，大多数分离纯化步骤本身极易导致产物中环形结构的打开或者A组成分的脱水，从而导致有效组分的降解，因此对链阳性菌素各组分的分离和纯化出于分析的目的是可以达到的，但对产品的生产来说，其纯化步骤还是个瓶颈。

三、发明内容

本发明的目的是提出提取纯化普那霉素的一种工艺，依此法可以有效提高普那霉素的产量和产品纯度，提高产率，降低生产成本。

一种普那霉素分离纯化的方法，主要通过如下技术方案实现：

(1)吸附树脂洗脱

发酵获得的溶液过筛分离，树脂用两倍体积的20％乙醇-80％的酸液洗涤后装柱，分别采用pH 4.0的乙醇-酸液洗脱，分段收集洗脱液，合并高浓度洗脱液。

(2)纳滤浓缩

大孔吸附树脂洗脱液用等体积乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠脱水后，进行纳滤浓缩。

(3)溶媒结晶

普那霉素浓缩液冷库静置12h，抽滤，得到普那霉素湿粉，干燥，得淡黄色普那霉素精粉。

四、本发明的优点

(1)因普那霉素发酵液稳定性较差，在室温下放置发酵单位下降较快，对提取收率有较大影响，本发明采用原位分离技术大大减少了发酵液的处理时间，提高了产品收率(大于68％)。

(2)由于树脂脱色提纯后得到的解析液中产品的浓度较低，本发明采用纳滤浓缩纯化技术对该解析液进行处理，不仅可以减少小分子杂质含量，还可以在无相变的条件下对解析液浓缩，当解析液浓缩到一定的程度，即可用溶媒结晶法得到纯度较高的普那霉素(大于98％)。

(3)本发明采用的分离纯化方法具有能耗低(仅为传统蒸发浓缩能耗的1/5左右)，设备结构简洁紧凑、操作方便、适合实现自动化生产的特点。

五、具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。

实施例一

发酵获得的溶液30目筛分离，SP207树脂用两倍体积的20％乙醇-80％的酸液洗涤后装柱，装柱量为柱体积的2/3，分别采用pH 4.0的40％乙醇-60％酸液和90％乙醇-10％酸液洗脱，洗脱速度为1BV/h，分段收集洗脱液，HPLC在线监测，合并高浓度洗脱液，备用。

大孔吸附树脂洗脱液用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠脱水后，采用装有LNG-NF-112型号纳滤膜的分离设备进行纳滤浓缩，操作参数为：操作压强差为1.2MPa-1.5MPa，循环流速为0.18m/s，操作温度为40℃，此步操作后洗脱液中普那霉素的浓度可由1％提高到10％。

普那霉素浓缩液冷库静置12h，抽滤，得到普那霉素湿粉，干燥，得淡黄色普那霉素精粉，经检测产品纯度为98.2％，产品收率68.3％。

实施例二

发酵获得的溶液40目筛分离，XAD-16树脂用两倍体积的20％乙醇-80％的酸液洗涤后装柱，装柱量为柱体积的1/2，分别采用pH 4.0的40％乙醇-60％酸液和90％乙醇-10％酸液洗脱，洗脱速度为1BV/h，分段收集洗脱液，HPLC在线监测，合并高浓度洗脱液，备用。

大孔吸附树脂洗脱液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠脱水后，采用装有LNG-NF-112型号纳滤膜的分离设备进行纳滤浓缩，操作参数为：操作压强差为1.2MPa-1.5MPa，循环流速为0.20m/s，操作温度为40℃，此步操作后洗脱液中普那霉素的浓度可由1％提高到10.2％。

普那霉素浓缩液冷库静置12h，抽滤，得到普那霉素湿粉，干燥，得淡黄色普那霉素精粉，经检测产品纯度为98.5％，产品收率68.1％。

实施例三

发酵获得的溶液50目筛分离，JD-1树脂用两倍体积的20％乙醇-80％的酸液洗涤后装柱，装柱量为柱体积的2/3，分别采用pH 4.0的40％乙醇-60％酸液和90％乙醇-10％酸液洗脱，洗脱速度为1BV/h，分段收集洗脱液，HPLC在线监测，合并高浓度洗脱液，备用。

大孔吸附树脂洗脱液用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠脱水后，采用装有LNG-NF-112型号纳滤膜的分离设备进行纳滤浓缩，最作参数为：操作压强差为1.2MPa-1.5MPa，循环流速为0.19m/s，操作温度为40℃，此步操作后洗脱液中普那霉素的浓度可由1％提高到10％。

普那霉素浓缩液冷库静置12h，抽滤，得到普那霉素湿粉，干燥，得淡黄色普那霉素精粉，经检测产品纯度为98.1％，产品收率68.8％。

实施例四

发酵获得的溶液30目筛分离，JD-1树脂用两倍体积的20％乙醇-80％的酸液洗涤后装柱，装柱量为柱体积的1/2，分别采用pH 4.0的40％乙醇-60％酸液和90％乙醇-10％酸液洗脱，洗脱速度为1BV/h，分段收集洗脱液，HPLC在线监测，合并高浓度洗脱液，备用。

大孔吸附树脂洗脱液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠脱水后，采用装有LNG-NF-112型号纳滤膜的分离设备进行纳滤浓缩，操作参数为：操作压强差为1.2MPa-1.5MPa，循环流速为0.18m/s，操作温度为40℃，此步操作后洗脱液中普那霉素的浓度可由1％提高到10％。

普那霉素浓缩液冷库静置12h，抽滤，得到普那霉素湿粉，干燥，得淡黄色普那霉素精粉，经检测产品纯度为98.8％，产品收率68.2％。

Claims

1.一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于发酵液经吸附树脂洗脱、纳滤浓缩、溶媒结晶、浓缩、干燥后获得普那霉素成品。

2.如权利要求1所述的一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于吸附树脂洗脱具体工艺为：将发酵液过筛分离，树脂用两倍体积的20％乙醇-80％的酸液洗涤后装柱，分别采用pH值4.0的乙醇-酸液洗脱，分段收集洗脱液，合并高浓度洗脱液。

3.如权利要求1所述的一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于纳滤浓缩具体工艺为：大孔吸附树脂洗脱液用等体积乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠脱水后，进行纳滤浓缩。

4.如权利要求1所述的一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于溶媒结晶具体工艺为：普那霉素浓缩液冷库静置12h，抽滤，得到普那霉素湿粉，干燥，得淡黄色普那霉素精粉。

5.如权利要求2所述的一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于发酵液过筛目数为30-50目。

6.如权利要求2所述的一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于吸附树脂可以为SP207、XAD-16、JD-1。

7.如权利要求2所述的一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于装柱量为柱体积的1/2-2/3。

8.如权利要求2所述的一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于乙醇-酸液洗脱浓度分别为40％乙醇-60％酸液和90％乙醇-10％酸液。

9.如权利要求3所述的一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于乙酸乙酯萃取次数为2-3次。

10.如权利要求3所述的一种分离纯化普那霉素的方法，其特征在于纳滤浓缩的操作参数为：操作压强差为1.0MPa-1.6MPa，循环流速为0.18-0.20m/s，操作温度为40℃左右。