CN107698553B

CN107698553B - 含氯化合物及制备方法和用途

Info

Publication number: CN107698553B
Application number: CN201710886336.6A
Authority: CN
Inventors: 赵博; 夏雪奎; 张立新; 刘昌衡; 齐君; 贾晓鹏; 赵佩佩; 赵丽娅; 王歆竹
Original assignee: Biology Institute of Shandong Academy of Sciences
Current assignee: Biology Institute of Shandong Academy of Sciences
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2037-09-27
Also published as: CN107698553A

Abstract

一种含氯化合物的制备方法及其抑制甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的用途。本发明中含氯化合物的制备方法包括以下步骤：菌株活化、种子培养、发酵培养、发酵产物萃取、硅胶色谱纯化、凝胶色谱纯化、C₁₈柱色谱纯化、化合物结构鉴定、抑菌活性试验。本发明中含氯化合物为一种新结构化合物，其对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同时具有明显的抑制效果，有潜力开发成新型抗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物，有助于解决金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同时引起的感染。

Description

含氯化合物及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种化合物，尤其涉及一种新结构含氯化合物的制备方法及该化合物在抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方面的用途。

背景技术

抗生素的发现从曾经致命的感染中拯救了数百万人的生命，然而随着抗生素在人类医疗和动物养殖中广泛大量使用，极少数菌株发生基因突变，在抗生素环境中存活繁殖并成为优势菌群，从而产生了越来越多能够耐受抗生素的致病菌，即耐药菌。现有的抗生素正逐渐失去效力。据世界卫生组织，全球每年约有70万人死于耐药菌感染，大部分发生在发展中国家，到2025年，这个数字可能上升到1000万。针对这一问题，中国于2016年发布了《遏制细菌耐药国家行动计划（2016-2020年）》，强调在加强抗生素管理的同时重点研发新型抗生素药物。自然界中的生物多样性，特别是微生物多样性是新型抗生素发现的天然宝库，据估计源于微生物的小分子化合物（<1000 Da）可达10⁹种。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）是临床感染的主要致病菌之一，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌能产生多种细胞毒素，引起食物中毒以及多种化脓性感染。自从20世纪50年代发现对金黄色葡萄球菌具有良好抑制作用的抗生素甲氧西林（methicillin），金黄色葡萄球菌引起的感染得到有效控制。然而仅在20世纪60年代就首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA）。至20世纪80年代，MRSA散布至世界各地，成为临床常见病原菌之一。近年来，MRSA检出率呈上升趋势，可导致中毒休克综合症和化脓性感染等疾病，对普通抗菌药物治疗无效，病死率高。目前MRSA已出现多重耐药，对人类健康威胁日益严重，给临床治疗带来严峻挑战。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种新结构含氯化合物的制备方法及其抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的用途。

一种含氯化合物，其特征是，它的结构式如下：

。

含氯化合物的物理性状是：白色晶体，分子式为C₂₂H₂₁ClO₆，不饱和度12；核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱的数据是：

电喷雾高分辨质谱中分子离子峰m/z为417.1120，M:M+2 = 3:1，符合含氯原子分子谱图特征，其核磁碳谱、氢谱核磁谱图数据如下：

核磁氢谱：¹H NMR：δ1.61 (s, CH₃-6’), 1.71 (s, CH₃-7’), 2.18 (s, CH₃-7’),2.50 (s, H-1’), 3.30 (d, J=6.8, H-3’), 3.43(s, CH₃-9’), 5.00 (t, J=6.7), 6.82(s, H-6’), 9.71(d, J=2.0, H-4’)。

核磁碳谱：¹³C NMR：148.5(C-1), 120.4(C-2), 162.3(C-3), 114.6(C-4),160.0(C-4a), 148.7(C-5a), 105.0(C-6), 151.7(C-7), 126.0(C-8), 129.7(C-9),135.0(C-9a), 162.4(C-11), 111.8(C-11a), 19.8(C-1’), 193.5(C-2’), 25.3(C-3’),122.3(C-4’), 131.5(C-5’), 25.9(C-6’), 18.2(C-7’), 12.8(C-8’), 49.1(C-9’)。

本发明所提供的含氯化合物的结构确定：利用高分辨核磁波谱数据结合高分辨质谱，经SciFinder等专业数据库检索，确定为新结构化合物。

本发明还提供一种制备如上所述含氯化合物的制备方法，其特征是：它包括如下步骤：种子活化与发酵培养步骤，发酵产物萃取步骤得到浸膏，分离纯化步骤获得含氯化合物；含氯化合物为菌种保藏号14344的巴西毛壳菌Chaetomium Brasiliense发酵产生；含氯化合物是以大米培养基在室温下通过简易的静置固态发酵产生。

本方案的具体特点还有，种子活化与发酵培养：将菌种保藏号14344的巴西毛壳菌Chaetomium Brasiliense菌株接入PDA培养基（马铃薯200克，葡萄糖20克，自来水1000毫升，121摄氏度20分钟灭菌），装液量50毫升/250毫升三角瓶，200转/分、25摄氏度条件下培养72小时活化。种子培养液转接入固体大米培养基（大米200克，自来水200毫升），培养基分装于50个1000毫升三角瓶，每瓶装有约400毫升大米培养基，121摄氏度20分钟灭菌。冷却后每瓶接种1毫升种子液，25摄氏度静置培养4周。

发酵产物萃取步骤是指收集发酵产物，发酵产物与乙酸乙酯体积比1:1，浸泡萃取三次，每次萃取时间24小时。合并萃取液，真空旋转干燥，获得约20克浸膏。

发酵产物萃取步骤是指超声辅助发酵产物萃取：具体内容是：收集发酵产物，发酵产物与乙酸乙酯体积比1:1，浸泡萃取三次，每次萃取时间24小时；浸泡萃取过程中，将萃取容器放入超声发生器进行超声辅助萃取；超声萃取条件为：超声时间间隔为超声启动1分钟，停止5分钟，每次萃取超声辅助总时间4小时；超声功率为30瓦；合并萃取液，真空旋转干燥，获得约31克浸膏。

分离纯化步骤包括：柱层析分离和液相色谱分离；具体内容是：所得浸膏首先经硅胶柱层析分离。再以两倍柱体积石油醚、石油醚：乙酸乙酯=80:20、石油醚：乙酸乙酯=60:40、石油醚：乙酸乙酯=40:60、石油醚：乙酸乙酯=20:80、乙酸乙酯、乙酸乙酯：甲醇=90:10、乙酸乙酯：甲醇=70:30、乙酸乙酯：甲醇=50:50、乙酸乙酯：甲醇=20:80、甲醇分别进行梯度洗脱得到洗脱液。洗脱液真空旋转干燥，得硅胶层析产物。硅胶层析产物经凝胶柱分离。所用凝胶为葡聚糖凝胶LH-20，干燥粒径为18-111微米，甲醇中最大膨胀粒径为163微米。硅胶层析产物与等质量凝胶均匀混合，均匀分布于凝胶柱填料顶部。以氯仿：乙酸乙酯：甲醇=2:1:1为溶剂进行等梯度洗脱，洗脱流速为2毫升/分钟。洗脱液采用分部收集器收集，自然挥发干燥，得凝胶层析产物。

所得凝胶层析产物经高效液相色谱分离。色谱柱为YMC-Triart C18（250×10毫米I.D.，s-5微米，12纳米），流动相为甲醇：水=90:10，流速为2毫升/分钟，检测器为紫外检测器。收集化合物色谱峰，经真空冷冻旋转干燥，获得纯化的含氯化合物。

液相色谱一步法纯化含氯化合物；将发酵产物萃取步骤所得浸膏经甲醇复溶，过滤除杂。所得溶液直接进行高效液相色谱分离纯化。色谱柱为YMC-Triart C18（250×10毫米I.D.，s-5微米，12纳米）。流动相为甲醇和水，甲醇：水=90:10。流动相程序为：30%甲醇维持5分钟；10分钟内30%甲醇升至40%甲醇并维持15分钟；30分钟内40%甲醇升至70%甲醇并维持20分钟；5分钟内70%甲醇升至100%甲醇并维持10分钟。全程总流速为2毫升/分钟，得到含氯化合物。

本发明还提供一种含氯化合物的应用，在同时抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明中的含氯化合物，其生产菌为一株从土壤样品中分离获得的巴西毛壳菌（Chaetomium brasiliense swschbr），菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No.14344。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏中心邮编100101，保藏日期2017年06月22日。该生物材料的分类命名及拉丁文名称: 巴西毛壳菌，Chaetomium brasiliense。

针对常规萃取方法提取率低、微生物发酵液中产物复杂、目标产物难以高效分离的问题，本发明尝试多种辅助萃取技术，发现超声萃取可有效提高本发明中含氯化合物的提取率，并通过液相色谱条件的不断探索和优化，对常规柱层析色谱分离方法进行简化和改进，成功建立起从本生产菌株发酵萃取液中一步法分离此含氯化合物的方法。

本发明具有以下有益效果，实验结果显示本发明所提供的含氯化合物对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同时显示出良好的抑制活性，对两种病原菌的最低抑菌浓度均达到6.25微克/毫升，有潜力开发成治疗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌混合感染的药物。

具体实施方式

实施例1：菌株的获得：菌株的分离和纯化：

一株分离自海岸泥土样品的巴西毛壳菌（Chaetomium brasiliense）。将采集自渤海湾的泥土样品用无菌水稀释至适当倍数，涂布PDA平板（马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂粉20克，自来水1000毫升，121摄氏度20分钟灭菌）。室温培养1周后，挑取若干生长良好的单菌落，其中一株经鉴定为巴西毛壳菌Chaetomium brasiliense。本菌株在PDA平板上生长1周，菌落中心白色，菌落外周灰白色，菌落直径约3厘米，菌落边缘较整齐，从菌落中心至四周呈放射状裂纹。菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No.14344。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏中心邮编100101，保藏日期2017年06月22日。该生物材料的分类命名及拉丁文名称: 巴西毛壳菌，Chaetomium brasiliense。

实施例2：乙酸乙酯萃取法制备含氯化合物

种子活化与发酵培养步骤：将保藏编号为14344的巴西毛壳菌Chaetomium Brasiliense菌株接入PDA培养基（马铃薯200克，葡萄糖20克，自来水1000毫升，121摄氏度20分钟灭菌），装液量50毫升/250毫升三角瓶，200转/分、25摄氏度条件下培养72小时活化。种子培养液转接入固体大米培养基（大米200克，自来水200毫升），培养基分装于50个1000毫升三角瓶，每瓶装有约400毫升大米培养基，121摄氏度20分钟灭菌。冷却后每瓶接种1毫升种子液，25摄氏度静置培养4周。

发酵产物萃取步骤是指收集发酵产物，发酵产物与乙酸乙酯体积比为1:1，浸泡萃取三次，每次萃取时间24小时。合并萃取液，真空旋转干燥，获得约20克浸膏。

所得凝胶层析产物经高效液相色谱分离。色谱柱为YMC-Triart C18（250×10毫米I.D.，s-5微米，12纳米），流动相为甲醇：水=90:10，流速为2毫升/分钟，检测器为紫外检测器。收集含氯化合物色谱峰，经真空冷冻旋转干燥，最终获得纯化的含氯化合物。

实施例3：超声辅助乙酸乙酯萃取法制备含氯化合物

发酵产物萃取步骤是指超声辅助发酵产物萃取：具体内容是：收集发酵产物，发酵产物与乙酸乙酯体积比为1:1，浸泡萃取三次，每次萃取时间24小时；浸泡萃取过程中，将萃取容器放入超声发生器（型号：KQ-400KDE）进行超声辅助萃取；超声萃取条件为：超声时间间隔为超声启动1分钟，停止5分钟，每次萃取超声辅助总时间4小时；超声功率为30瓦；合并萃取液，真空旋转干燥，获得约31克浸膏。经检测其中目标产物含氯化合物与常规乙酸乙酯萃取没有显著区别。

实施例4：液相色谱一步法纯化含氯化合物

将发酵产物萃取步骤所得浸膏经甲醇复溶，过滤除杂。所得溶液不经柱层析分离，直接进行高效液相色谱分离纯化。色谱柱为YMC-Triart C18（250×10毫米I.D.，s-5微米，12纳米）。流动相为甲醇和水，甲醇：水=90:10。流动相程序为：30%甲醇维持5分钟；10分钟内30%甲醇升至40%甲醇并维持15分钟；30分钟内40%甲醇升至70%甲醇并维持20分钟；5分钟内70%甲醇升至100%甲醇并维持10分钟。全程总流速为2毫升/分钟，得到含氯化合物。

采用此分离程序，目标含氯化合物与其它发酵产物分离度较高，产物色谱峰经波谱检测基本不含其它杂质，因此可在发酵萃取液中直接分离出目标含氯化合物，简化了分离步骤，避免了柱层析过程中造成的目标产物损失。

实施例5：含氯化合物结构表征：

含氯化合物经核磁、液质检测，谱图分析后确定其结构。其性状为白色晶体，分子式为C₂₂H₂₁ClO₆（不饱和度12），电喷雾高分辨质谱中分子离子峰m/z为417.1120，M:M+2 = 3:1，符合含氯原子分子谱图特征，其核磁碳谱、氢谱数据如下：

核磁氢谱：¹H NMR：δ1.61 (s, CH₃-6’), 1.71 (s, CH₃-7’), 2.18 (s, CH₃-7’),2.50 (s, H-1’), 3.30 (d, J=6.8, H-3’), 3.43(s, CH₃-9’), 5.00 (t, J=6.7), 6.82(s, H-6’), 9.71(d, J=2.0, H-4’);

实施例6：含氯化合物在抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。

含氯化合物抑菌活性实验：对照抗生素：万古霉素、甲氧西林。制备抗生素贮存液时，将抗生素溶解于无菌水中制成1024微克/毫升原液，然后依照不同梯度稀释。

待测化合物：分离自Chaetomium brasiliense的含氯化合物。

病原菌：金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌。

实验方法：酶标板中加入200微升LB肉汤培养基（蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，蒸馏水1000毫升），分别加入100微升以倍半稀释法制备的不同浓度的含氯化合物溶液，接种100微升菌液。设置空白对照组（LB肉汤培养基200微升）和阴性对照组（LB肉汤培养基及菌液各100微升）。置于37摄氏度温箱中培养。16-30小时后，使用酶标仪在600纳米波长处测定孔板吸光度值，平行测定三次。当待测孔吸光度值低于阴性对照孔的10%，判定为抑菌活性阳性，据此确定抑菌活性阳性时最低的待测化合物浓度，即为其最低抑菌浓度（微克/毫升）。

实验结果：如表1所示，本发明含氯化合物对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同时显示出较好的抑制活性，最低抑菌浓度均达到6.25微克/毫升。本发明含氯化合物对白色念珠菌和铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度都高于100微克/毫升，不显示抑菌活性。本发明含氯化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度接近万古霉素（1.25微克/毫升，万古霉素为目前临床常用针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗生素），且显著低于甲氧西林（>50微克/毫升）。因此，本发明所提供的新型含氯化合物有潜力开发为治疗甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌混合感染的新型药物。

表1 本发明含氯化合物抑菌活性试验

Claims

1.一种含氯化合物，其特征是，它的结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的含氯化合物，其特征是含氯化合物的物理性状是：白色晶体，分子式为C₂₂H₂₁ClO₆，不饱和度12；核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱的数据是：

电喷雾高分辨质谱中分子离子峰m/z为417.1120，M:M+2 = 3:1，符合含氯原子分子谱图特征，其核磁碳谱、氢谱数据如下：

核磁氢谱，¹H NMR：δ1.61 (s, CH₃-6’), 1.71 (s, CH₃-7’), 2.18 (s, CH₃-7’), 2.50(s, H-1’), 3.30 (d, J=6.8, H-3’), 3.43(s, CH₃-9’), 5.00 (t, J=6.7), 6.82 (s,H-6’), 9.71(d, J=2.0, H-4’);

核磁碳谱，¹³C NMR：148.5(C-1), 120.4(C-2), 162.3(C-3), 114.6(C-4), 160.0(C-4a), 148.7(C-5a), 105.0(C-6), 151.7(C-7), 126.0(C-8), 129.7(C-9), 135.0(C-9a), 162.4(C-11), 111.8(C-11a), 19.8(C-1’), 193.5(C-2’), 25.3(C-3’), 122.3(C-4’), 131.5(C-5’), 25.9(C-6’), 18.2(C-7’), 12.8(C-8’), 49.1(C-9’) 。

3.根据权利要求1所述的含氯化合物的制备方法，其特征是：它包括如下步骤：

种子活化与发酵培养步骤，发酵产物萃取步骤得到浸膏，分离纯化步骤获得含氯化合物；含氯化合物为菌种保藏号14344的巴西毛壳菌Chaetomium Brasiliense发酵产生；含氯化合物是以大米培养基在室温下通过简易的静置固态发酵产生。

4.根据权利要求3所述的含氯化合物的制备方法，其特征是：种子活化与发酵培养：将菌种保藏号14344的巴西毛壳菌Chaetomium Brasiliense菌株接入PDA培养基，PDA培养基包括：马铃薯200克，葡萄糖20克，自来水1000毫升，121摄氏度20分钟灭菌；装液量50毫升/250毫升三角瓶，200转/分、25摄氏度条件下培养72小时活化；种子培养液转接入固体大米培养基，固体大米培养基即大米200克，自来水200毫升；培养基分装于50个1000毫升三角瓶，每瓶装有约400毫升大米培养基，121摄氏度20分钟灭菌；冷却后每瓶接种1毫升种子液，25摄氏度静置培养4周。

5.根据权利要求3所述的含氯化合物的制备方法，其特征是：发酵产物萃取步骤是指收集发酵产物，发酵产物与乙酸乙酯体积比1:1，浸泡萃取三次，每次萃取时间24小时；合并萃取液，真空旋转干燥，获得约20克浸膏。

6.根据权利要求3所述的含氯化合物的制备方法，其特征是：发酵产物萃取步骤是指超声辅助发酵产物萃取：具体内容是：收集发酵产物，发酵产物与乙酸乙酯体积比1:1，浸泡萃取三次，每次萃取时间24小时；浸泡萃取过程中，将萃取容器放入超声发生器进行超声辅助萃取；超声萃取条件为：超声时间间隔为超声启动1分钟，停止5分钟，每次萃取超声辅助总时间4小时；超声功率为30瓦；合并萃取液，真空旋转干燥，获得约31克浸膏。

7.根据权利要求3或5或6所述的含氯化合物的制备方法，其特征是：分离纯化步骤包括：柱层析分离和液相色谱分离；具体内容是：所得浸膏首先经硅胶柱层析分离；再以两倍柱体积石油醚、石油醚：乙酸乙酯=80:20、石油醚：乙酸乙酯=60:40、石油醚：乙酸乙酯=40:60、石油醚：乙酸乙酯=20:80、乙酸乙酯、乙酸乙酯：甲醇=90:10、乙酸乙酯：甲醇=70:30、乙酸乙酯：甲醇=50:50、乙酸乙酯：甲醇=20:80、甲醇分别进行梯度洗脱得到洗脱液；洗脱液真空旋转干燥，得硅胶层析产物；硅胶层析产物经凝胶柱分离；所用凝胶为葡聚糖凝胶LH-20，干燥粒径为18-111微米，甲醇中最大膨胀粒径为163微米；硅胶层析产物与等质量凝胶均匀混合，均匀分布于凝胶柱填料顶部；以氯仿：乙酸乙酯：甲醇=2:1:1为溶剂进行等梯度洗脱，洗脱流速为2毫升/分钟；洗脱液采用分部收集器收集，自然挥发干燥，得凝胶层析产物；

所得凝胶层析产物经高效液相色谱分离；色谱柱为YMC-Triart C18：250×10毫米I.D.，s-5微米，12纳米；流动相为甲醇：水=90:10，流速为2毫升/分钟，检测器为紫外检测器；收集化合物色谱峰，经真空冷冻旋转干燥，获得含氯化合物。

8.根据权利要求3或5或6所述的含氯化合物的制备方法，其特征是：液相色谱一步法纯化含氯化合物；将发酵产物萃取步骤所得浸膏经甲醇复溶，过滤除杂；所得溶液直接进行高效液相色谱分离纯化；色谱柱为YMC-Triart C18，250×10毫米I.D.，s-5微米，12纳米；流动相为甲醇和水，甲醇：水=90:10；流动相程序为：30%甲醇维持5分钟；10分钟内30%甲醇升至40%甲醇并维持15分钟；30分钟内40%甲醇升至70%甲醇并维持20分钟；5分钟内70%甲醇升至100%甲醇并维持10分钟；全程总流速为2毫升/分钟，得到含氯化合物。

9.一种根据权利要求1所述的含氯化合物的应用，其特征是含氯化合物在制备同时抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。