CN102477067A - 3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸及其制备方法和应用，其结构式为：

Description

3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新的化合物3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸及其制备方法和应用。

背景技术

上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司从采集自自然环境中的土壤样品中进行微生物分离，得到了一株可产达托霉素的新型小链霉菌(Streptomycesparvus)，于2010年7月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心正式保藏，保藏号为：CGMCC No.4027，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。目前已知的小链霉菌CGMCC No.4027的次级代谢产物仅限于达托霉素。

发明内容

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，在小链霉菌CGMCC No.4027的次级代谢产物中分离出一种新的化合物，因此，本发明的目的在于提供一种新型的化合物。

本发明的另一目的在于提供该化合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供该化合物的应用。

本发明提供的化合物，为3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸(3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine)具有如下结构：

本发明的化合物的制备方法，是由小链霉菌CGMCC No.4027在发酵培养基中发酵制得，其中，所述发酵培养基的碳源选自：糊精、可溶性淀粉、柠檬酸盐、甘油、葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、糖原、水杨苷、苦杏仁苷、丙酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠、苹果酸钠，含量为1.0～8.0％；

氮源选自：酵母粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉，含量为0.5～5.0％；

发酵温度为28～30℃，发酵时间为4～6天。

根据本发明，所述发酵在摇瓶中进行，转速为200-230rpm。

根据本发明，所述发酵在发酵罐中进行，搅拌转速为400-500rpm，通气量为7-9L/min。

根据本发明，所述发酵培养基含有糊精3.5～4.0％，葡萄糖0.5～1.0％，黄豆饼粉2.0～2.5％，硫酸亚铁铵0.05～0.15％。优选的，所述发酵培养基含有糊精3.6％，葡萄糖0.8％，黄豆饼粉2.2％，硫酸亚铁铵0.1％。

进一步的，所述制备方法还包括发酵后进行分离提取的步骤。

本发明提供的化合物，用于制备抑制革兰氏阳性菌的药物。其中，所述革兰氏阳性菌为藤黄微球菌或枯草芽孢杆菌。

附图说明

图1为HPLC分析图。

图2为正离子高分辨质谱图。

图3为正离子二级质谱图。

图4为氢谱谱图。

图5为碳谱谱图。

图6为H-H COSY谱图。

图7为HMBC谱谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明所用的菌种为小链霉菌(Streptomyces parvus)，已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.4027。

以下实施例中所述斜面培养基、所述种子培养基、所述发酵培养基的配方(w/v)如下：

斜面培养基：高氏一号培养基。

种子培养基：葡萄糖(2％)、甘油(2％)、可溶性淀粉(6％)、黄豆饼粉(5％)、磷酸二氢钾(0.02％)、七水合硫酸镁(0.04％)，其余为水。初始pH为7.3-7.5。

发酵培养基：黄豆饼粉(2.2％)、糊精(3.6％)、葡萄糖(0.8％)、六水合硫酸亚铁铵(Fe(NH₄)₂(SO₄)₂6H₂O)(0.1％)，其余为水。初始pH为7.3-7.5。

实施例1化合物的制备

1.1发酵

将菌株CGMCC No.4027从冻干管中接种到高氏一号斜面培养基上，于28℃-30℃培养四天后，转入装有经121℃高压灭菌30min的种子培养基的三角瓶中，置于摇床进行种子培养，其中，摇床转速为200-230rpm，温度为28-30℃，培养时间为46-50h。种子培养结束后再转入装有已灭菌的发酵培养基的三角瓶内，转种量5％，进行摇瓶发酵培养，摇床转速200-230rpm，温度28-30℃，培养6天后，发酵结束。

经种子培养后也可转入装有已灭菌的发酵培养基的5L玻璃发酵罐内。转种量为5％，在发酵罐内进行发酵，搅拌转速为400-500rpm，温度控制在28-30℃，通气量为7-9L/min，培养4-6天后结束发酵。

1.2分离提取

将经发酵后得到的发酵液置于4℃冰箱中过夜，沉淀蛋白。之后将发酵液于4℃、4000rpm离心30min。弃下层沉淀，上清液用大孔吸附树脂吸附，大孔吸附树脂可以采用XAD-1600，SP850，或JD-1，于静态或动态进行吸附皆可。吸附后用两倍柱体积的纯水，10％，30％，50％，75％，100％乙醇依次洗脱，粗品集中在50％乙醇洗脱液中。粗品液用旋转蒸发仪于40℃减压浓缩，再采用中压系统进行粗制。条件如下：粗品浓缩液用30％乙腈稀释10倍，12000rpm离心10min，上清为进样样品。上样量为15-25ml，采用中压柱(型号：Biotage Si 25+M 1603-2，USA)进行分离，柱温自然，流动相为30％乙腈500ml，等度洗脱。流速约3-5ml/min，样品集中于200-400ml的洗脱液中。洗脱液用旋转蒸发仪于40℃减压浓缩后采用DIONEXP680双元泵制备液相系统或制备型Agilent 1100 DAD单泵液相系统进行制备，收集到的制备液于40℃旋蒸浓缩至干获得目标化合物纯品，得到的纯品为淡黄色粉末，易溶于甲醇，乙醇，水，乙腈。不溶于氯仿。液相制备条件如下：

制备柱：YMC CombiPreP ODS-A 5μm 20×250mm

柱温：自然         检测器：DAD(210nm，223nm，254nm，280nm)

流动相(体积比)：25％乙腈+75％含0.1％TFA的水溶液

流速：8ml/min      进样量：60-700μl

等度洗脱

实施例2化合物的结构鉴定

将经制备液相系统制备收集的纯品上分析型Agilent 1100 DAD双元泵液相系统进行分析，条件如下：

分析用柱：菲罗门C18柱 5μm 4.6×250mm

柱温：30℃              检测器：VWD 210nm

流动相(体积比)：25％乙腈+75％含0.1％TFA的水溶液

流速：1ml/min           进样量：5μl

等度洗脱

如图1所示，目标化合物在此条件下出峰保留时间在8.6min左右，除去3min左右的两个溶剂峰，纯度＞95％。

经高分辨质谱检测(图谱如图2所示)，目标化合物精确分子量为407.2522，分子式为C₂₁H₃₃N₃O₅。进一步，经二维质谱(图3)检测，结合目标化合物的氢谱(图4)、碳谱(图5)及COSY谱(图6)、HMBC谱(图7)及核磁数据(表1)对其结构进行分析。

表1 NMR核磁数据

通过解析，确定了所有碳原子和氢原子的归属，得到了小链霉菌的次级代谢产物的结构如下：

实施例3化合物的抑菌活性

藤黄微球菌CMCC28001和枯草芽孢杆菌CMCC63501菌悬液(5×10⁷/ml)各加100μl于25ml细菌琼脂培养基，倒平板，待培养基凝固后，将加有样品的纸敏片置于表面。其中样品浓度1.9mg/ml，加样量60μl，纸片直径0.68cm。

37℃培养12-20h后，藤黄微球菌抑菌圈直径0.92cm，枯草芽孢杆菌抑菌圈直径1.04cm，显示该化合物对藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌都有抗菌活性。

Claims (9)

1.一种化合物，其结构式为：

2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，由小链霉菌CGMCCNo.4027在发酵培养基中发酵制得，其中：

所述发酵培养基的碳源选自：糊精、可溶性淀粉、柠檬酸盐、甘油、葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、糖原、水杨苷、苦杏仁苷、丙酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠、苹果酸钠，含量为1.0～8.0％；

氮源选自：酵母粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉，含量为0.5～5.0％；

发酵温度为28～30℃，发酵时间为4～6天。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵在摇瓶中进行，转速为200～230rpm。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵在发酵罐中进行，搅拌转速为400～500rpm，通气量为7～9L/min。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基含有糊精3.5～4.0％，葡萄糖0.5～1.0％，黄豆饼粉2.0～2.5％，硫酸亚铁铵0.05～0.15％。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基含有糊精3.6％，葡萄糖0.8％，黄豆饼粉2.2％，硫酸亚铁铵0.1％。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括发酵后进行分离提取的步骤。

8.如权利要求1所述的化合物的应用，其特征在于，用于制备抑制革兰氏阳性菌的药物。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为藤黄微球菌或枯草芽孢杆菌。

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