CN105837590B

CN105837590B - 具有抗白色念珠菌活性的化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105837590B
Application number: CN201510024135.6A
Authority: CN
Inventors: 杨甲月; 杨志钧; 罗敏玉; 殷瑜; 杨天; 戈梅
Original assignee: Shanghai Health Creation Center For Biopharmaceutical R&d Co ltd
Current assignee: Shanghai Health Creation Center For Biopharmaceutical R&d Co ltd
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2019-08-13
Anticipated expiration: 2035-01-16
Also published as: CN105837590A

Abstract

本发明公开了具有抗白色念珠菌活性的化合物及其制备方法和应用，所述化合物的结构式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：

Description

具有抗白色念珠菌活性的化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及具有抗白色念珠菌活性的化合物及其制备方法和应用。

背景技术

白色念珠菌是常见的深部感染的条件致病性真菌。近年来，随着放疗、化疗、免疫抑制剂及广谱抗菌素的广泛应用，极易造成免疫功能低下者体内环境平衡紊乱、菌群失调，使白色念珠菌感染呈上升趋势，已经成为了主要的真菌感染疾病之一。目前，用于临床治疗的白色念珠菌抗生素和化学合成药物极为有限，且毒副作用较大、价格昂贵，在临床上应用受到限制。微生物是许多重要药物的重要来源之一，也是许多药物的先导化合物重要来源。因此，从微生物中寻找新的抗感染的药物是一个主要的方向。

发明内容

目前关于Streptomyces lavenduligriseus代谢产物的研究报道较少，本申请的发明人从自然环境中分离获得了一株熏衣草灰色链霉菌(Streptomyceslavenduligriseus)HCCB11368菌株(保藏号CGMCC No.10249)，并从该链霉菌中分离鉴定到了新型的具有抗白色念珠菌活性的化合物，具有制备抗白色念珠菌感染的临床药物的应用前景。

因此，本发明的第一个目的在于提供具有抗白色念珠菌活性的化合物。

本发明的第二个目的在于提供所述化合物的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供所述化合物的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种熏衣草灰色链霉菌(Streptomyceslavenduligriseus)。

本发明的第五个目的在于提供一种药物组合物或抗白色念珠菌感染的药物。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

根据本发明的第一个方面，具有抗白色念珠菌活性的化合物，所述化合物的结构式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：

或

根据本发明的第二个方面，所述的具有抗白色念珠菌活性的化合物的制备方法，其特征在于，通过发酵熏衣草灰色链霉菌(Streptomyces lavenduligriseus)菌株CGMCCNo.10249，并对发酵产物进行分离纯化而得到。

根据本发明，所述发酵的条件如下：

种子培养基的组成如下：葡萄糖20g/L，甘油20g/L，可溶性淀粉20g/L，黄豆饼粉30g/L，KH₂PO₄0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；

发酵培养基的组成如下：葡萄糖8g/L，黄豆饼粉22g/L，玉米淀粉40g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，KH₂PO₄0.2g/L，NaCl 2g/L；

发酵温度为26～28℃，发酵时间为5～7天。

根据本发明，所述分离纯化包括以下步骤：

A)将发酵产物用有机溶剂萃取，减压蒸馏得到萃取物；

B)将步骤A)中所述萃取物用硅胶柱进行层析分离，并用洗脱溶剂进行梯度洗脱分离；

C)将步骤B)中所述梯度洗脱分离的产物用半制备液相进行色谱分离，并用洗脱溶剂进行梯度洗脱分离。

根据本发明，所述步骤A)中所述有机溶剂为甲醇和/或正丁醇，所述步骤B)中所述洗脱溶剂为氯仿和甲醇，所述步骤C)中所述洗脱溶剂为甲醇和水。

根据本发明，所述步骤B)中所述硅胶柱为200～300目的硅胶柱。

根据本发明的第三个方面，所述的具有抗白色念珠菌活性的化合物可用于制备抗白色念珠菌感染的药物。

根据本发明的第四个方面，一种熏衣草灰色链霉菌(Streptomyceslavenduligriseus)菌株，保藏编号为CGMCC No.10249。

根据本发明的第五个方面，一种药物组合物或抗白色念珠菌感染的药物，含有所述的具有抗白色念珠菌活性的化合物中的一种或两种。

根据本发明，所述药物组合物或抗白色念珠菌感染的药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明不仅提供了新的化合物，而且该化合物可用于制备抗白色念珠菌感染的药物，因而具有广泛的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明化合物1的质谱图。

图2为本发明化合物1的H谱图。

图3为本发明化合物1的C谱图。

图4为本发明化合物1的HSQC谱图。

图5为本发明化合物1的COSY谱图。

图6为本发明化合物1的HMBC谱图。

图7为本发明化合物2的质谱图。

图8为本发明化合物2的H谱图。

图9为本发明化合物2的C谱图。

图10为本发明化合物2的HSQC谱图。

图11为本发明化合物2的COSY谱图。

图12为本发明化合物2的HMBC谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本申请的发明人通过自然筛选的方法获得了一株熏衣草灰色链霉菌(Streptomyces lavenduligriseus)菌株，命名为HCCB11368，于2014年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.10249。

以下实施例中，所述种子培养基的组成如下：葡萄糖20g/L，甘油20g/L，可溶性淀粉20g/L，黄豆饼粉30g/L，KH₂PO₄0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；所述发酵培养基的组成如下：葡萄糖8g/L，黄豆饼粉22g/L，玉米淀粉40g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，KH₂PO₄0.2g/L，NaCl2g/L；所述改良的马丁培养基(Martin Broth，MB)的组成如下：蛋白胨5g/L，酵母浸出粉2g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH6.4。

实施例1、化合物的制备

1.1、发酵

将熏衣草灰色链霉菌(Streptomyces lavenduligriseus)CGMCC No.10249接种于种子培养基中，于28℃、220r/min下摇床培养2天，再将培养好的种子以8％的接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，于26～28℃下培养5～7天。

1.2、分离纯化

将实施例1.1中获得的发酵产物用甲醇提取，减压蒸馏得到提取物。将获得的提取物用正丁醇进行萃取，减压蒸馏得到萃取物。将获得的萃取物再用200～300目的硅胶柱进行硅胶柱层析分离，采用氯仿和甲醇为洗脱溶剂进行梯度洗脱，其中，甲醇所占百分比分别为0％、10％、20％、30％、40％、50％和100％，分别进行减压浓缩获得馏分1～7。将馏分5(40％甲醇)进一步进行半制备液相色谱分离，层析柱为YMC-ODS C-18(10μm，20mm×250mm)，采用甲醇和水为洗脱溶剂进行梯度洗脱分离，0～60min采用38～50％的甲醇洗脱，流速8ml/min，收集39.5～41.3min馏分为化合物1，收集46.6～48.2min的馏分为化合物2。

实施例2、化合物1的结构鉴定

将实施例1.2中所获得的化合物1经正离子电喷雾质谱检测，其图谱如图1所示，显示其准分子离子峰为：m/z 671.4010[M+H]⁺，分子式为C₃₅H₅₈O₁₂，采用Bruker Avance II-400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图2)、碳谱(图3)及相关二维谱(HMQC谱、H-HCOSY谱、HMBC谱，图4～6)，其核磁数据如表1所示。

表1、化合物1的NMR数据表(CD₃OD_,，400MHz)

Position	δ<sub>H</sub>	δ<sub>C</sub>	HMBC
				1		173.0
2	2.44,t(11.9)	59.6	2’,4
				3	4.23,t(13.1)	72.7	2,4
4a	1.46-1.50,m	42.5
				4b	1.37-1.40,m
5	4.06-4.10,m	72.3
				6	1.61-1.68,m	44.7
7	4.06-4.10,m	73.0
				8	1.46-1.50,m	45.1
9	4.06-4.10,m	73.5
				10	1.75-1.83,m	44.0
11	4.06-4.10,m	68.9
				12a	1.75-1.83,m	42.8

12b	1.61-1.68,m
				13	3.76	73.1	15
14a	1.75-1.83,m	40.1	15,16
				14b	1.37-1.40,m
15	3.65,dd(17.4,7.3)	76.8	16,17
				16		75.0
17	3.68,d(5.0)	82.3
				18	5.92,dd(22.2,5.0)	130.2
19	6.20-6.42,m	132.8
				20	6.20-6.42,m	133.8
21	6.20-6.42,m	134.5
				22	6.20-6.42,m	134.4
23	6.20-6.42,m	133.4
				24	6.20-6.42,m	134.0
25	5.67,dd(22.6,12.0)	135.0
				26	3.89-3.94,m	76.0
27	4.77-4.84,m	73.9
				28	1.29,d(9.4)	18.0
29	0.99,s	14.2	15,16,17
				1’	3.89-3.94,m	72.8
2’a	1.46-1.50,m	35.8
				2’b	1.37-1.40,m
3’a	1.46-1.50,m	26.1
				3b’	1.37-1.40,m
4’	1.29-1.35,m	32.9
				5’	1.29-1.35,m	23.7
6’	0.90,t(9.2)	14.1

通过上述检测解析，确定了化合物1的所有碳原子和氢原子的归属，得到了化合物1的结构如式(Ⅰ)所示：

上述式(Ⅰ)所示的化合物为一种新化合物，其化学名称为：(2E,4E,6E,8E)-10,15,17,19,21,23,25,27-八羟基-14(1-羟己基)-11,28-二甲基-12,29-二氧杂二环[26.1.0]二十九-2,4,6,8-四烯-13-酮，即(2E,4E,6E,8E)-10,15,17,19,21,23,25,27-octahydroxy-14-(1-hydroxyhexyl)-11,28-di methyl-12,29-dioxabicyclo[26.1.0]nonacosa-2,4,6,8-tetraen-13-one。

实施例3、化合物2的结构鉴定

将实施例1.2中所获得的化合物2经正离子电喷雾质谱检测，其图谱如图7所示，显示其准分子离子峰为：m/z 751.4241[M+Na]⁺，分子式为C₃₈H₆₄O₁₃，采用Bruker Avance II-400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图8)、碳谱(图9)及相关二维谱(HMQC谱、H-HCOSY谱、HMBC谱，图10～12)，其核磁数据如表2所示。

表2、化合物2的NMR数据表(CD₃OD_,，400MHz)

Position	δ<sub>H</sub>	δ<sub>C</sub>	HMBC
				1		173.0
2	2.73	60.4	2’,4
				3	4.36	73.2	2,4
4	1.68	41.3
				5	4.18	73.9
6a	1.73	45.3
				6b	1.80
7	4.18	73.8
				8	1.64	45.3
9	4.18	74.1

10a	1.46	45.2
				10b	1.53
11	4.18	71.1
				12a	1.52	44.2
12b	1.89
				13	3.39	67.2	15
14a	1.94	41.3	15,16
				14b	2.08
15	3.98	84.3	16,17
				16		138.2
17	6.25	130.7
				18	6.67	128.9
19	6.47-6.56	135.3
				20	6.47-6.56	134.2
21	6.47-6.56	135.0
				22	6.47-6.56	133.7
23	6.47-6.56	134.3
				24	6.62	132.0
25	6.18	134.4
				26	4.26	73.3
27	5.01	75.2
				28	1.46	18.0
29	1.91	10.8	15,16,17
				30	3.42-3.57	70.7	15,32
31	3.90	72.3
				32	3.65-3.75	64.6	30
1’	4.02	72.5
				2’a	1.56	36.2
2’b	1.67
				3’a	1.53	26.1

3b’	1.70
			4’	1.48	32.9
5’	1.50	23.7
			6’	1.09	14.4

通过上述检测解析，确定了化合物2的所有碳原子和氢原子的归属，得到了化合物2的结构如式(Ⅱ)所示：

上述式(II)所示的化合物为一种新化合物，其化学名称为：(17E,19E,21E,23E,25E)-16-(2,3-二羟基丙氧基)-4,6,8,10,12,14,27-七羟基-3-(1-羟己基)-17,28-二甲基氧杂环二十八-17,19,21,23,25-五烯-2-酮，即(17E,19E,21E,23E,25E)-16-(2,3-dihydroxypropoxy)-4,6,8,10,12,14,27-heptahydrox y-3-(1-hydroxyhexyl)-17,28-dimethyloxacyclooctacosa-17,19,21,23,25-pentaen-2-o ne。

实施例4、化合物1和2的生物活性检测

在美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)准则下，使用常量稀释液体培养法(macrondilution broth procedure)测定化合物对于白色念珠菌ATCC 10231的最小抑菌浓度(MIC)，具体过程如下。

采用白色念珠菌生长方法，用接种环挑取待检菌落接种于4～5mL灭菌的改良的马丁培养基中，于37℃下培养48h。将菌液用生理盐水或MB培养基稀释备用。

将实施例1.2中获得的化合物用MB培养基分别依次梯度稀释，并加入上述稀释的菌液，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/mL，化合物浓度每管分别为256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。同时以不含化合物和菌液的空白MB培养基作为阴性对照，以含有同样浓度的两性霉素B作为阳性对照。

将上述接种好的稀释管于37℃培养2天，次日以肉眼观察，药物最低浓度管无白色念珠菌生长者，即为受试菌的MIC，实验重复3次。结果如表3所示。

表3、化合物1和2对白色念珠菌的抑制活性

由表3的结果可知，本发明分离鉴定获得的化合物1和2均具有抗白色念珠菌的活性，因而可以用于制备抗白色念珠菌感染的药物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.具有抗白色念珠菌活性的化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：

2.如权利要求1所述的具有抗白色念珠菌活性的化合物的制备方法，其特征在于，通过发酵熏衣草灰色链霉菌(Streptomyces lavenduligriseus)菌株CGMCC No.10249，并对发酵产物进行分离纯化而得到。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件如下：

种子培养基的组成如下：葡萄糖20g/L，甘油20g/L，可溶性淀粉20g/L，黄豆饼粉30g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；

发酵培养基的组成如下：葡萄糖8g/L，黄豆饼粉22g/L，玉米淀粉40g/L，MgSO₄·7H₂O1g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，NaCl 2g/L；

发酵温度为26～28℃，发酵时间为5～7天。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化包括以下步骤：

A)将发酵产物用有机溶剂萃取，减压蒸馏得到萃取物；

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)中所述有机溶剂为甲醇和/或正丁醇，所述步骤B)中所述洗脱溶剂为氯仿和甲醇，所述步骤C)中所述洗脱溶剂为甲醇和水。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中所述硅胶柱为200～300目的硅胶柱。

7.一种熏衣草灰色链霉菌(Streptomyces lavenduligriseus)菌株，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.10249。

8.一种药物组合物或抗白色念珠菌感染的药物，其特征在于，含有如权利要求1所述的具有抗白色念珠菌活性的化合物中的一种或两种。

9.如权利要求8所述的药物组合物或抗白色念珠菌感染的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。