CN102304555B

CN102304555B - 抗生素lobophorin A和lobophorin B的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102304555B
Application number: CN 201110276796
Authority: CN
Inventors: 章卫民; 陈玉婵; 李冬利; 陶美华
Original assignee: Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-09-16
Also published as: CN102304555A

Abstract

本发明公开一种抗生素lobophorin A和lobophorin B的制备方法及其应用。本发明从链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1127的发酵培养物中制备分离得到了lobophorin A和lobophorin B，为制备lobophorin A和lobophorin B提供了一种新的途径。lobophorin A和lobophorin B对苏云金芽胞杆菌具有抗菌活性，MIC值分别为8μg/ml和2μg/ml，为开发抗菌新药提供了候选化合物。lobophorin B具有较强的抗肿瘤活性，对SF-268、MCF-7和NCI-H460肿瘤细胞的IC₅₀值分别为18.3μM、5.84μM和26.6μM，为开发抗肿瘤新药提供了候选化合物。

Description

抗生素lobophorin A和lobophorin B的制备方法及其应用

技术领域：

本发明属于工业微生物领域，具体涉及抗生素lobophorin A和lobophorin B的制备方法及其在制备抗菌药物中的应用以及抗生素lobophorin B在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

Spirotetronate类抗生素是一类具有抗菌和抗肿瘤活性的天然产物，比如antlermicin，chlorothricin、kijanimicin、decatromicins、saccharocarcins、tetrocarcins和versipelostatins。lobophorinA，其结构如式(I)所示；lobophorin B，其结构如式(II)所示，两个化合物都被文献Bioorg Med Chem Lett，1999，9，2003-2006报道过。前人已经从与海藻共生的放线菌中分离得到，并显示出抗炎活性，但是未检测到抗菌和抗肿瘤活性(Jiang，Z.D.；Jensen，P.R.&Fenical，W.Lobophorins A and B，new antiinflammatory macrolides produced by a tropical marinebacterium.Bioorg.Med.Chem.Lett.，1999，9，2003-2006.)。

式(I) 式(II)

发明内容：

本发明的第一个目的是提供抗生素lobophorin A和lobophorin B的制备方法。

本发明的抗生素lobophorin A和lobophorin B的制备方法，其特征在于，是从链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1127的发酵培养物中制备分离得到的。

所述的抗生素lobophorin A和lobophorin B的制备方法，优选，其具体步骤如下：

a)制备链霉菌SCSIO 1127的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；

b)将浸膏A和浸膏B合并，经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇作为流动相，从体积比100∶0～0∶100梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比50∶1梯度洗脱下来的馏分Fr.1，氯仿-甲醇体积比25∶1梯度洗脱下来的馏分Fr.2。

c)馏分Fr.1经LH-20凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，后经中压制备层析，以甲醇/水作为流动相，从体积分数15％-95％线性梯度洗脱，收集甲醇/水体积分数为90％梯度下的馏分，得到lobophorin B；

d)馏分Fr.2经LH-20凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，后经中压制备层析，以甲醇/水作为流动相，从体积分数10％-60％线性梯度洗脱，收集甲醇/水体积分数60％梯度下的馏分，得到lobophorin A。

所述的a)步骤的制备链霉菌SCSIO 1127的发酵培养物优选通过以下方法制备：将活化的链霉菌SCSIO 1127接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养48h制得种子液，将种子液以10％的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养144h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：豆粉3g，酵母提取粉3g，海藻糖10g，脯氨酸1g，牛肉浸膏3g，甘油6ml，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，CaCO₃ 2g，粗海盐30g，余量为水，pH 7.4。经本方法制备的链霉菌SCSIO1127的发酵培养物中lobophorin A和lobophorin B的含量比较高。

本发明人通过实验发现，lobophorin A和lobophorin B对苏云金芽胞杆菌具有抗菌活性，MIC值分别为8μg/ml和2μg/ml，为开发抗菌新药提供了候选化合物。因此本发明的第二个目的是提供化合物lobophorin A和lobophorin B在制备抗菌药物中的应用。

本发明人通过实验发现，lobophorin B具有较强的抗肿瘤活性，对SF-268、MCF-7和NCI-H460肿瘤细胞的IC₅₀值分别为18.3μM、5.84μM和26.6μM，为开发抗肿瘤新药提供了候选化合物。因此本发明的第三个目的是提供化合物lobophorin B在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明从链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1127的发酵培养物中制备分离得到了lobophorin A和lobophorin B，为制备lobophorin A和lobophorin B提供了一种新的途径。

本发明的链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1127，于2011年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2011178。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、链霉菌SCSIO 1127的规模发酵

a)种子培养基和发酵培养基配方为：

每升种子培养基和发酵培养基的配制方法为：豆粉3g，酵母提取粉3g，海藻糖10g，脯氨酸1g，牛肉浸膏3g，甘油6ml，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，CaCO₃ 2g，粗海盐30g，余量为水，pH 7.4，121℃，灭菌30min，备用。

b)发酵培养：

种子培养：将在平板上活化的链霉菌SCSIO 1127接入种子培养基(700mL)中，28℃，200rpm，培养48h制得种子液；

规模发酵培养：将种子液以10％的接种量接入到发酵培养基中(4.5L)，28℃，200rpm，培养144h，而制得链霉菌SCSIO 1127的发酵培养物。

二、抗生素lobophorin A和lobophorin B的分离

a)发酵液的萃取

将上述规模发酵的链霉菌SCSIO 1127的发酵培养物，经离心使发酵液和菌丝体分离，发酵液用两倍体积的丁酮萃取4次，减压蒸馏得发酵液提取物，即为浸膏A；菌丝体用3倍体积丙酮浸提3次，减压蒸馏回收丙酮后剩余的水混合液用其两倍体积丁酮萃取4次，浓缩获得菌丝体提取物，即为浸膏B。将浸膏A与浸膏B合并得到粗浸膏5.3g。

b)lobophorin A和lobophorinB的分离

粗浸膏经硅胶柱层析(300-400目，50g)，以氯仿-甲醇作为流动相，从体积比100∶0～0∶100梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比50∶1梯度洗脱下来的馏分Fr.1，氯仿-甲醇体积比25∶1梯度洗脱下来的馏分Fr.2。

馏分Fr.1经LH-20凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，后经中压制备层析(YMC*GEL ODS-A球型填料，120A孔径，50μm粒径，20×2.5cm)，以甲醇/水作为流动相，从体积分数15％-95％线性梯度洗脱160min，流速为15ml/min，收集甲醇/水体积分数为90％梯度下的馏分，得到化合物2(210.6mg)。

馏分Fr.2经LH-20凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，后经中压制备层析(YMC*GEL ODS-A球型填料，120A孔径，50μm粒径，20×2.5cm)，以甲醇/水作为流动相，从体积分数10％-60％线性梯度洗脱160min，流速为15ml/min，收集甲醇/水体积分数60％梯度下的馏分，得到化合物1(56.2mg)。

通过结构分析，对本发明从链霉菌SCSIO 1127的发酵培养物中制备的化合物1和化合物2的鉴定结果如下：

化合物1：白色固体，ESI-MS data(m/z 1157.8[M+H]⁺and m/z 1155.9[M-H]^-)，¹H NMR(CD₃OD，500MHz)δ：5.74(1H，d，J＝10.0Hz)，5.42(1H，s)，5.38(1H，m)，5.26(1H，d，J＝9.5Hz)，5.21(1H，d，J＝3.5Hz)，5.16(1H，d，J＝10.0Hz)，4.97(1H，dd，J＝2.0，9.5Hz)，4.78(1H，d，J＝4.0Hz)，4.74(1H，dd，J＝2.3，9.8Hz)，4.31(1H，m)，4.21(1H，m)，4.21(1H，m)，4.21(1H，m)，4.03(1H，m)，4.03(1H，m)，3.82(1H，m)，3.69(1H，m)，3.69(1H，d，J＝10.0Hz)，3.68(3H，s)，3.45(1H，m)，3.43(1H，m)，3.42(2H，m)，3.40(3H，s)，3.29(1H，dd，J＝3.5，9.5Hz)，3.28(1H，m)，2.87(1H，dd，J＝3.0，9.5Hz)，2.51(1H，t，J＝7.3Hz)，2.41(1H，d，J＝14.5Hz)，2.41(1H，m)，2.31(1H，dd，J＝7.0，14.0Hz)，2.31(1H，m)，2.29(1H，m)，2.23(1H，m)，2.14(1H，m)，2.11(1H，m)，2.08(1H，m)，2.03(1H，m)，1.76(1H，m)，1.69(1H，m)，1.64(1H，m)，1.62(1H，m)，1.59(2H，m)，1.50(3H，s)，1.48(1H，m)，1.39(6H，s)，1.31(3H，d，J＝7.5Hz)，1.25(3H，d，J＝6.0Hz)，1.23(1H，m)，1.23(3H，d，J＝6.0Hz)，1.22(3H，d，J＝6.0Hz)，1.17(3H，s)，1.14(3H，d，J＝7.0Hz)，1.13(3H，d，J＝6.0Hz)，0.68(3H，d，J＝6.5Hz)；¹³C NMR(CD₃OD，125MHz)δ：201.7s，198.8s，176.1s，158.6s，140.3s，136.9s，136.2s，128.0d，125.2d，123.0d，121.8d，120.2d，99.3d，98.2d，98.0s，97.8d，91.7d，85.3d，83.8s，82.4d，81.9d，79.5d，72.0d，68.2d，67.9d，67.6d，66.6d，64.5d，64.0t，63.0d，62.2d，57.1d，55.6q，53.2s，51.3q，51.1d，50.0s，44.2d，41.9t，40.1d，38.8d，37.4t，35.2t，34.7d，34.4t，34.4t，31.3t，31.3d，29.5t，27.9d，26.7q，21.8q，19.3q，17.2q，16.8q，16.6q，16.2q，14.2q，14.1q，13.5q，13.3q.该化合物的核磁数据与文献(Bioorg MedChem Lett，1999，9，2003-2006)报道的lobophorin A基本一致，因此将化合物1鉴定为lobophorin A。

化合物2：白色固体，ESI-MS data(m/z 1210.3[M+Na]⁺and m/z 1186.1[M-H]^-)，¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ：5.70(1H，d，J＝10.5Hz)，5.50(1H，s)，5.36(1H，m)，5.15(1H，brs)，5.12(1H，d，J＝10.0Hz)，5.11(1H，d，J＝4.0Hz)，4.90(1H，dd，J＝2.0，9.5Hz)，4.73(1H，d，J＝4.0Hz)，4.43(1H，dd，J＝1.5，10.0Hz)，4.37(1H，d，J＝10.0Hz)，4.24(1H，m)，4.21(1H，m)，4.21(1H，brs)，4.20(2H，m)，4.00(1H，m)，3.99(1H，m)，3.99(1H，m)，3.74(1H，m)，3.70(3H，s)，3.60(1H，d，J＝10.0Hz)，3.48(1H，m)，3.45(1H，m)，3.42(1H，dd，J＝5.5，11.0Hz)，3.40(3H，s)，3.30(1H，m)，3.23(1H，dd，J＝2.8，9.3Hz)，2.83(1H，dd，J＝3.0，9.5Hz)，2.76(1H，d，J＝14.5Hz)，2.67(1H，t，J＝7.5Hz)，2.36(1H，dd，J＝2.5，14.0Hz)，2.31(1H，m)，2.28(1H，m)，2.19(1H，m)，2.14(1H，m)，2.09(1H，m)，2.06(1H，m)，1.98(1H，t，J＝9.0Hz)，1.90(1H，m)，1.83(1H，d，J＝14.0Hz)，1.68(1H，m)，1.63(1H，m)，1.60(3H，s)，1.57(1H，m)，1.56(3H，s)，1.55(1H，m)，1.55(1H，m)，1.48(1H，d，J＝8.5Hz)，1.39(3H，s)，1.31(3H，d，J＝7.0Hz)，1.31(3H，s)，1.24(3H，d，J＝5.5Hz)，1.23(3H，d，J＝6.0Hz)，1.22(1H，m)，1.19(3H，d，J＝6.5Hz)，1.14(3H，d，J＝6.0Hz)，1.08(3H，d，J＝7.0Hz)，0.63(3H，d，J＝4.5Hz)；¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)δ：206.3s，201.7s，167.2s，157.5s，141.4s，137.1s，135.8s，126.4d，126.0d，123.4d，121.5d，119.2d，101.8s，98.3d，98.0d，96.7d，91.1d，91.0s，84.0d，83.3s，82.2d，82.2d，78.2d，71.6d，69.1d，68.4d，66.5d，65.4d，65.0d，65.0t，64.0d，62.1d，57.4q，53.7d，53.2d，52.7q，51.0s，43.1d，41.7t，40.2d，38.5d，36.8t，35.7t，35.4t，34.4d，34.2t，31.3d，30.9t，30.0t，28.0d，25.3q，22.3q，20.2q，18.3q，18.0q，17.8q，17.0q，15.1q，15.1q，14.2q，13.8q.该化合物的核磁数据(表1)与文献(BioorgMed Chem Lett，1999，9，2003-2006)报道的lobophorin B基本一致，因此将化合物2鉴定为lobophorin B。

三、lobophorin A和lobophorin B的抗菌活性测定

采用金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213，苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringensis，粪肠球菌Enterococcus faecalis ATCC 29212三种细菌作为指示菌，进行MIC值测定。

金黄色葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌使用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基培养，粪肠球菌使用脑心浸出液培养基(Brain heart infusion broth)培养。MIC的测定参照the NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards方法，使用微量肉汤稀释法(broth microdilutionmethod)测定化合物对各个指示菌的MIC值。

抗菌药物贮存液制备：精密称取各样品(lobophorin A和lobophorin B)，用经过0.22μm微孔滤膜过滤的DMSO作溶剂，配置成5.12mg/ml。配制好的抗菌药物贮存液保存于4℃冰箱中。

MIC板制备：无菌操作，将2倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔透明聚苯乙烯微孔板中，每孔10μl，第1至第11孔加化合物，第12孔加10μl DMSO作为生长对照。每处理设置3个重复。

指示菌制备：用生长法制备浓度相当于5×10⁸CFU/ml的菌悬液，经肉汤1∶1000稀释后，每孔加入90μl菌悬液，使每孔使终体积为100μl，第1孔至第11孔化合物样品的终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。密封后置37℃培养箱中，孵育16-20h观察结果。

结果判断：以肉眼观察，在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，结果见表1。结果显示lobophorin A和lobophorin B对苏云金芽胞杆菌具有抗菌活性，MIC值分别为8μg/ml和2μg/ml，为开发抗菌新药提供了候选化合物。

四、lobophorin A和lobophorin B的抗肿瘤活性测定

以人乳腺癌细胞株(MCF-7 Cells)、人大细胞肺癌细胞株(NCI-H460)、人胶质瘤细胞株(SF-268)作为受试细胞株，对lobophorin A和lobophorin B进行细胞毒活性测试，实验方法参考文献[Wu，Z.C.；Li，D.L.；Chen，Y.C.；Zhang，W.M.，A new isofuranonaphthalenone andbenzopyrans from the endophytic fungus Nodulisporium sp.A4 from Aquilaria sinensis.Helv.Chim.Acta 2010，93，(5)，920-924.]

其结果如表1所示，结果表明lobophorin B具有较强的抗肿瘤活性，对SF-268、MCF-7和NCI-H460的IC₅₀值分别为18.3μM、5.84μM和26.6μM，为开发抗肿瘤新药提供了候选化合物。

表1：lobophorin A和lobophorin B的抑菌活性和抗肿瘤活性

^a无活性

Claims

1.抗生素lobophorin A和lobophorin B在制备抗菌药物中的应用。