CN109385380A - 一种放线菌素类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种放线菌素类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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CN109385380A CN201811245839.6A CN201811245839A CN109385380A CN 109385380 A CN109385380 A CN 109385380A CN 201811245839 A CN201811245839 A CN 201811245839A CN 109385380 A CN109385380 A CN 109385380A
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Abstract

本发明公开了一种放线菌素类化合物及其制备方法与应用，用于生产放线菌素类化合物的链霉菌为Streptomyces sp.S011，于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.15910。放线菌素类化合物的化学结构式如(I)所示：本发明所提供的生产生产放线菌素类化合物的方法是发酵链霉菌S011，可通过工业化发酵实现放线菌素D及放线菌素类化合物(去甲基放线菌素B)的大量生产，其中，去甲基放线菌素B为新化合物，两个化合物具有良好的抗菌和细胞毒活性，应用前景显著。

Description

一种放线菌素类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物学和有机化学技术领域，具体地说，涉及一种放线菌素类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
虽然抗菌药物在克服病原菌对人类的感染和威胁方面发挥了巨大的作用，但是随着抗菌药物的大量使用，耐药菌不断出现，更有甚者为超级耐药菌。目前，抗生素从应用于临床至耐药菌株出现的时间间隔越来越短，病原菌耐药性发展的速度远远超过抗菌药物开发上市的速度，而从传统原材料(如植物和土壤微生物)中挖掘具有新的抗菌机制的化合物越来越困难。因此，寻找具有新作用机制的抗菌活性成分迫在眉睫，从新的原材料中寻找具有抗菌活性的成分(尤其是抗耐药菌成分)，逐渐成为研究开发抗菌药物的重点。
剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen系百合科龙血树属常绿乔木或灌木，目前人们主要通过破坏树皮获取树脂进而提取要药血竭，而长期以来只利用野生资源，未经栽培，加之产区植被不断破坏，现为国家3级保护濒危植物。虽然近年来对剑叶龙血树的植物形态、药材性状、生药学和理化特征等研究较为深入，但关于剑叶龙血树内生菌代谢产物的研究鲜有报道。
内生菌(endophyte)是指那些生活史的一定或全部阶段生活在健康植物组织内但不会引起宿主植物产生浸染现象或明显病害症状的一类微生物。研究表明，植物内生菌分布广泛，几乎所有植物组织里都能发现内生菌的存在。植物内生菌尤其是药用植物内生菌作为重要的微生物资源，具有多种重要生物学功能，不仅对植物生长发育具有积极的调控作用，且其代谢产物具有与宿主结构相同或相似的化合物如紫杉醇、鬼臼素、喜树碱和姜黄素等，以及其他抗菌、抗肿瘤、杀虫、抗病毒及酶抑制等结构多样的活性次生代谢产物。内生真菌还可产生具有特殊结构或者新颖的生物活性的化合物。可见，植物内生真菌是一个尚未被完全开发的庞大的资源宝库，从药用植物中分离得到内生真菌并从中挖掘生物活性物质，利用生物转化及工业发酵生产新型药物及药用植物替代成分，为解决传统原材料挖掘新天然产物难度大，药用植物资源生长缓慢及资源紧缺等难题提供新的思路。
癌症是一种非常古老的疾病，伴随着整个人类发展的历史，严重威胁着人类的健康与生命。放线菌素D已经成为较为理想的抗肿瘤药物，广泛应用于恶性肿瘤的治疗中。但是放线菌素D较强的毒性限制了该类药物的应用范围，且药理学研究表明放线菌素D在体内代谢缓慢，在宿主细胞核内产生积累，也会直接导致积累毒性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种放线菌素类化合物及其制备方法与应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一株剑叶龙血树内生链霉菌(Streptomyces sp.)S011，于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCCNo.15910。
本发明还公开了一种上述的剑叶龙血树内生链霉菌S011在生产放线菌素中的应用。
可选地，所述的放线菌素为放线菌素类化合物。
本发明还公开了一种放线菌素类化合物，该化合物为去甲基放线菌素 B，命名为：L-缬氨酸-N,N'-[(9,11-二甲基-5H-恶唑并[4,5-b]-吩恶嗪-4,6- 双取代)二羰基]二[L-苏氨酰-D-缬氨酰-L-脯氨酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基] 内酯；其化学结构式如(I)：
本发明还公开了一种放线菌素类化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、菌株发酵：将权利要求1所述的链霉菌S011的孢子接种于增菌培养基上，28℃恒温培养3-5天，即得菌种；将灭菌后的PDA培养基趁热倒入灭菌后的培养皿中，25mL/平板，凝固后倒置备用；用灭菌的竹签挑取菌体，接种到PDA培养基上发酵，28℃下恒温培养11天；
步骤2、分离纯化：发酵11天后，将琼脂切块于玻璃容器中，用乙酸乙酯、甲醇和冰乙酸的混合液浸泡过夜后超声提取，过滤后提取液减压浓缩回收溶剂，室温吹干至无酸味，称取质量，样品备用；样品用等体积含 10％甲醇的乙酸乙酯和水萃取多次直至乙酸乙酯相基本无色，分离乙酸乙酯相，经无水硫酸钠干燥后减压浓缩回收溶剂，得菌株EA提取物，EA经 95％甲醇-石油醚分配法脱脂，得M相和PE相；将M相样品浓缩后经葡聚糖凝胶柱层析，将所得第一个组分进行反相硅胶柱层析，以甲醇：水(V： V)＝10：90～100：0梯度洗脱，60：40-80：20组分经HPLC制备，乙腈：水(V：V)＝40：60洗脱得权利要求4所述的放线菌素类化合物。
可选地，所述的增菌培养基的组分如下：麦芽提取物5g，酵母提取物 4g，葡萄糖4g，微量盐溶液1mL，复合维生素微量，琼脂15g，水1000 mL，pH7.2；发酵用的PDA培养基组分如下：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水补至1000mL，pH自然，其中，土豆需要去皮切块煮沸30min，取滤液用。
可选地，乙酸乙酯、甲醇和冰乙酸的混合液中的乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸的体积比为80:15:5。
可选地，步骤2中M相采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，洗脱液为甲醇，20秒/滴。
可选地，步骤2中第一个组分采用反相硅胶RP-18柱层析。
本发明还公开了一种上述的放线菌素类化合物在制备抗肿瘤和抑制耐药菌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明提供的两个化合物对多种病原菌具有广谱抗菌活性，对五株肿瘤细胞的体外抑制作用较强，两化合物的体外细胞毒活性显著高于阳性对照顺铂，比紫杉醇的稍弱，可为开发新的抗菌和抗肿瘤药物提供实验基础。
2)本发明链霉菌S011生长迅速，所用培养基配方单一，成本较低，设备简单易操作，发酵周期短，可通过工业化发酵实现新的放线菌素类化合物(去甲基放线菌素B)的大量生产，从根本上解决药源问题，也可为该化合物的合成及相关研究提供前体。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明两个化合物的抗菌活性；其中，a－d为临床分离的 MRSA，e.鲍曼不动杆菌，f.枯草芽孢杆菌；8代表放线菌素D，6代表去甲基放线菌素B，以下同；
图2是本发明化合物6的化学结构；
图3是本发明化合物8的化学结构；
图4是本发明化合物6的核磁共振氢谱(1H－NMR)；
图5是本发明化合物6的核磁共振碳谱(13C－NMR)；
图6是本发明化合物6的异核单量子相关谱(HSQC)；
图7是本发明化合物6的异核远程相关谱(HMBC)；
图8是本发明化合物6的H-H相关谱(COSY)；
图9是本发明化合物6的旋转坐标系NOE谱(ROESY)；
图10是本发明化合物6的电喷雾质谱(ESI－MS)；
图11是本发明化合物8的核磁共振氢谱(1H－NMR)；
图12是本发明化合物8的核磁共振碳谱(13C－NMR)；
图13是本发明化合物8的异核单量子相关谱(HSQC)；
图14是本发明化合物8的异核远程相关谱(HMBC)；
图15是本发明化合物8的H-H相关谱(COSY)；
图16是本发明化合物8的旋转坐标系NOE谱(ROESY)；
图17是本发明化合物8的电喷雾质谱(ESI－MS)。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
PDA培养基：马铃薯200g，去皮切块加入少量水煮20min，三层纱布过滤，取滤液用水定容至1L，加入20g葡萄糖，15g琼脂，121℃高压灭菌 30min。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂 15g，水1000mL，121℃高压灭菌30min。
SAB固体培养基：液体沙氏培养基50g，水1000mL，琼脂15g，pH 5.6， 121℃高压灭菌30min。
ISP2：酵母提取物4g，葡萄糖4g，麦芽提取物10g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.2-7.6，121℃高压灭菌30min。
增菌培养基：麦芽提取物5g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，微量盐溶液1mL，复合维生素B微量，琼脂15g，水1000mL，pH 7.2。
实施例1链霉菌S011的分离与鉴定
一、菌的分离
健康的植物样本经流水冲洗后室温风干48h，160W超声清洗5min 去除植物表面的土壤以及有机物残渣。并按下述流程进行植物样本的表面消毒：70％乙醇浸泡5min、2％次氯酸钠浸泡5min、10％碳酸氢钠浸泡10 min，以上每次操作后都用无菌水清洗样本三次。表面消毒后的植物样品在无菌环境下干燥后80℃处理30min，然后用无菌粉碎机把植物样品粉碎并涂抹到分离培养基表面，28℃培养分离菌株。待放线菌长出后，挑取单克隆至增菌培养基上纯化培养，最后将获得的单克隆转接至ISP2斜面上培养并短期保藏，命名为S011，同时保藏甘油管和牛奶管至-80℃。
二、菌的鉴定
(1)形态、培养特征：菌株S011在增菌培养基上生长良好，产孢，孢子呈奶白色，菌落圆形，微凸，边缘整齐。
(2)16S rRNA基因的扩增与系统发育分析：将菌株进行基因组提取, 利用细菌16SrRNA基因通用引物PA：5’-CAG AGT TTG ATC CTG GCT-3’，PB：5’-AGG AGG TGA TCC AGCCGC A-3’进行PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸3min；72℃总延伸6min。得到的PCR产物经0.8％琼脂糖胶回收后测序，所得序列如下SEQ ID NO.1所示。将得到的序列经 EzBioCloud中的EzTaxon在线比对服务进行相关标准菌株的相似性搜索，即将S011鉴定为链霉菌属(Streptomyces)，于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为： CGMCCNo.15910。
实施例2应用链霉菌S011生产放线菌素D及放线菌素类化合物(去甲基放线菌素B)
一、菌株发酵
(1)种子培养：将链霉菌S011的孢子接种于增菌培养基上，28℃恒温培养3-5天，即得菌种。
(2)发酵培养：将灭菌后的PDA培养基趁热倒入灭菌后的培养皿中， 25mL/平板，凝固后倒置备用。用灭菌的竹签挑取菌体，接种到PDA培养基上，28℃下恒温培养11天。
二、有效成分的分离纯化
(1)发酵11天后，将琼脂切块于玻璃容器中，用体积比乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝80:15:5浸泡过夜后超声提取，过滤后提取液减压浓缩回收溶剂，室温吹干至无酸味，称取质量，样品备用。
(2)样品用等体积含10％甲醇的乙酸乙酯和水萃取多次直至乙酸乙酯相基本无色，分离乙酸乙酯相，经无水硫酸钠干燥后减压浓缩回收溶剂，得菌株EA提取物，将其经95％甲醇-石油醚分配法脱脂，得M相和PE 相。
(3)将M相上样于葡聚糖凝胶Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇进行洗脱，20s/d；将所得第一个组分于RP-18柱层析，以甲醇：水 (V:V)＝10:90～100:0梯度洗脱，60:40-80:20组分经HPLC制备，40％乙腈－水洗脱得化合物6，50％乙腈－水洗脱得化合物8。
三、化合物结构鉴定
(1)化合物8的鉴定
该化合物为橙红色粉末，易溶于氯仿、丙酮、甲醇，如图11-图17所示，根据EI-MS给出准分子离子峰为m/z＝1278[M+Na]+，确定其相对分子质量为1255。分子式为C62H86N12O16，不饱和度为20。1H-NMR(500MHz，CDCl3)给出的信号中，可以看到δH：8.18(1H,d,J＝5.97Hz,NH),8.02(1H,d, J＝5.97Hz,NH),7.74(1H,d,J＝6.49Hz,NH),7.63(1H,d,J＝7.7Hz,NH),7.36(1H, dd,J＝0.76,7.75Hz,H),7.14(1H,d,J＝6.92Hz,NH),8.02(1H,d,J＝5.97Hz,NH)。 UV在204.5，235，440.5处的特征吸收，提示分子中存在吩噁嗪酮生色团。13C-NMR在δ166.3-173.7范围内出现12个酰胺羰基信号，在δ34.9-39.3范围内出现4个N-CH3信号。对比文献后发现该化合物数据与Actinomycin D 一致，故该化合物8的结构鉴定为ActinomycinD，此化合物的结构应如图 3所示。
2、化合物6的鉴定
该化合物为橙红色粉末，易溶于氯仿、丙酮、甲醇，根据高分别率 ESI-MS给出准分子离子峰为m/z＝1265.7[M-H]－，确定其相对分子质量为 1266.7，分子式为C63H86N12O16，不饱和度为21。根据质谱及分离时情况，推测该化合物与Hsp8一样为放线菌素类化合物。根据13C-NMR、1H-1HRosy 等谱图(图4-图10)，并对比化合物8和现有技术，发现化合物6与放线菌素B相比仅少了一个甲基信号，此化合物的结构应如图2所示，该化合物为去甲基放线菌素B，命名为：L-缬氨酸-N,N'－[(9,11-二甲基-5H-恶唑并[4,5-b]-吩恶嗪-4,6-双取代)二羰基]二[L-苏氨酰-D-缬氨酰-L-脯氨酰-N- 甲基甘氨酰-N-甲基]内酯。
实施例3化合物6和8的生物活性应用
1、体外抗菌活性测定
采用牛津杯扩散法对6和8进行抗菌活性测定，以50ug为测定剂量，指示菌选取11株常见病原菌：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、克雷伯氏菌、白色念珠菌、耻垢分支杆菌，5株白色念珠菌耐药株和5株MRSA。其中白色念珠菌及其5株临床耐药菌用SAB培养基在28℃下培养；其余病原细菌用LB培养基在37℃下培养。具体操作如下：
1.1将6和8用丙酮溶解，制成1mg/mL的样品溶液备用。
1.2用灭菌后的竹签挑取少量指示菌，接种于相应的液体培养基中，在合适的温度下200r/min恒温培养12-24h，用相应培养液将各菌液分别稀释至1×106-7CFU/mL备用。
1.3采用牛津杯扩散法进行抑菌实验。分别取稀释的指示菌菌液0.2 mL均匀涂布在相应的固体培养基平板上，即病原细菌分别涂布于LB培养基上，病原真菌涂布于沙氏培养基上。在每个涂布指示菌平板的合适位置放置4个牛津杯，每个牛津杯中用加入步骤1中所配溶液50uL。并将平板放置在相应的培养条件下培养(病原细菌平板37℃、黑暗培养12h，病原真菌28℃、黑暗培养24h)，分别测定抑菌圈直径，平行实验重复3 次。结果如表1和图1所示。
表1化合物抗菌活性筛选结果(抑菌圈直径：mm)
(注：A-D均为阳性对照，A为万古霉素，B为青霉素，C为盐酸小檗碱，D为氯霉素；P.M.1为大肠杆菌，P.M.2为金黄色葡萄球菌，P.M.3 为枯草芽孢杆菌，P.M.4为克雷伯氏菌，P.M.5为白色葡萄球菌，P.M.6为鲍曼不动杆菌，P.M.7为粪肠球菌，P.M.8为耻垢分支杆菌，P.M.9－13为白念耐药株，P.M.14－18为MRSA临床耐药株。“0”表示样品在实验剂量下对指示菌无抑制活性，“-”表示未进行抑菌活性实验。)
2、化合物细胞毒活性
用MTS法测定了6和8对人早幼粒白血病细胞株HL-60、人肝癌细胞株SMMC-7721、人肺癌细胞株A-549、人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株SW480等5株肿瘤细胞的抑制作用。
结果表明，6和8对5株肿瘤细胞具有明显的体外抑制作用，具体结果如表2所示：
表2化合物对肿瘤细胞株的IC50值(μM)
本发明从剑叶龙血树内生菌S011中分离的到的两个化合物6和8对多种病原菌(包括临床耐药菌)及5株肿瘤细胞有较好的体外抑制作用，其中6是首次发现的的新化合物，8为Actinomycin D，首次从剑叶龙血树内生放线菌中分离得到，本发明增加了放线菌素D体外抑制临床耐药菌的实验，丰富了其抗菌谱，其中5株为白色念珠菌临床耐药株，5株MRSA临床耐药株。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 云南中医学院
<120> 一种放线菌素类化合物及其制备方法与应用
<130> 2018
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 689
<212> DNA
<213> 链霉菌属(Streptomyces)
<400> 1
gtggggatta gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggcaa tctgccctgc actctgggac 60
aagccctgga aacggggtct aataccggat actgaccttc acgggcatct gtgaaggtcg 120
aaagctccgg cggtgcagga tgagcccgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct 180
caccaaggcg acgacgggta gccggcctga gagggcgacc ggccacactg ggactgagac 240
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg 300
atgcagcgac gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga 360
agaagcgaaa gtgacggtac ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc 420
ggtaatacgt agggcgcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg 480
cttgtcacgt cggttgtgaa agcccggggc ttaaccccgg gtctgcagtc gatacgggca 540
ggctagagtt cggtagggga gatcggaatt cctggtgtag cggtgaaatg cgcagatatc 600
aggaggaaca ccggtggcga aggcggatct ctgggccgat actgacgctg aggagcgaaa 660
gcgtggggag cgaacaggat tagataccc 689
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cagagtttga tcctggct 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
aggaggtgat ccagccgca 19

Claims (10)

1.一株剑叶龙血树内生链霉菌(Streptomyces sp.)S011，其特征在于，分离自云南西双版纳剑叶龙血树茎组织，于2018年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.15910。
2.权利要求1所述剑叶龙血树内生链霉菌S011在生产放线菌素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的放线菌素为放线菌素类化合物。
4.一种放线菌素类化合物，其特征在于，该化合物为去甲基放线菌素B，命名为：L-缬氨酸-N,N'-[(9,11-二甲基-5H-恶唑并[4,5-b]-吩恶嗪-4,6-双取代)二羰基]二[L-苏氨酰-D-缬氨酰-L-脯氨酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基]内酯；其化学结构式如(I)
。
5.一种放线菌素类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、菌株发酵：将权利要求1所述的链霉菌S011的孢子接种于增菌培养基上，28℃恒温培养3-5天，即得菌种；将灭菌后的PDA培养基趁热倒入灭菌后的培养皿中，25mL/平板，凝固后倒置备用；用灭菌的竹签挑取菌体，接种到PDA培养基上发酵，28℃下恒温培养11天；
步骤2、分离纯化：发酵11天后，将琼脂切块于玻璃容器中，用乙酸乙酯、甲醇和冰乙酸的混合液浸泡过夜后超声提取，过滤后提取液减压浓缩回收溶剂，室温吹干至无酸味，称取质量，样品备用；样品用等体积含10％甲醇的乙酸乙酯和水萃取多次直至乙酸乙酯相基本无色，分离乙酸乙酯相，经无水硫酸钠干燥后减压浓缩回收溶剂，得菌株EA提取物，EA经95％甲醇-石油醚分配法脱脂，得M相和PE相；将M相样品浓缩后经葡聚糖凝胶柱层析，将所得第一个组分进行反相硅胶柱层析，以甲醇：水(V：V)＝10：90～100：0梯度洗脱，60：40-80：20组分经HPLC制备，乙腈：水(V：V)＝40：60洗脱得权利要求4所述的放线菌素类化合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的增菌培养基的组分如下：麦芽提取物5g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，微量盐溶液1mL，复合维生素微量，琼脂15g，水1000mL，pH7.2；发酵用的PDA培养基组分如下：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水补至1000mL，pH自然，其中，土豆需要去皮切块煮沸30min，取滤液用。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，乙酸乙酯、甲醇和冰乙酸的混合液中的乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸的体积比为80:15:5。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中M相采用葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析，洗脱液为甲醇，20秒/滴。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中第一个组分采用反相硅胶RP-18柱层析。
10.权利要求4所述的放线菌素类化合物在制备抗肿瘤和抑制耐药菌药物中的应用。
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