CN107050061A - 抑制白色念珠菌生长的组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抑制白色念珠菌生长的组合物及其制备方法与应用，组合物包括第一组分和第二组分；其中，第一组分包括：灰色链霉菌和球孢链霉菌发酵得到的发酵产物；第二组分按重量份计，包括：15～20份维生素B2、8～12份聚六亚甲基双胍盐酸盐、3～5份柠檬酸、0.5～1份甘草甜素和1～2份苯甲酸钠；第一组分和第二组分的质量比为10:(1～2)。本发明提供的抑制白色念珠菌生长的组合物，通过采用灰色链霉菌和球孢链霉菌进行共同发酵，将得到的发酵产物作为组分之一，制备得到的组合物具有抑制白色念珠菌生长的功效，且抑制效果显著；制备方法简单，生产成本低，质量稳定。

Description

抑制白色念珠菌生长的组合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及抑菌技术领域，具体涉及一种抑制白色念珠菌生长的组合物及其制备方法与应用。
背景技术
白色念珠菌(Candida albicans)，是一种真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。白色念珠菌是一种常见的条件致病菌，通常在人体粘膜表面造成局部感染，在免疫缺陷病人中白色念珠菌往往可造成系统性感染。由于HIV的感染以及肿瘤病人和器官移植病人数量的增加，白色念珠菌的感染日益成为重要的临床问题。研究表明在癌症病人中，白色念珠菌是最常见的造成感染的真菌，同时，具有抗药性菌株的出现和传播也进一步增加了治疗的难度。例如，氟康唑、伊曲康唑等三唑类药物是临床上治疗念珠菌病的常用药物，但是，此类药物的长期使用导致耐药株广泛出现。Wroblewska等从临床上分离了851株白色念珠菌，其中37.2％对氟康唑耐药、47.6％对伊曲康唑耐药。因此，开发新型的抑制白色念珠菌生长的物质成为了一个日渐迫切的课题。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种抑制白色念珠菌生长的组合物及其制备方法与应用，以采用灰色链霉菌和球孢链霉菌进行共同发酵，将得到的发酵产物作为组合物的组分之一，制备得到的组合物具有抑制白色念珠菌生长的功效，且抑制效果显著；制备方法简单，生产成本低，质量稳定。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种抑制白色念珠菌生长的组合物，组合物包括第一组分和第二组分；其中，第一组分包括：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)发酵得到的发酵产物；第二组分按重量份计，包括：15～20份维生素B2、8～12份聚六亚甲基双胍盐酸盐、3～5份柠檬酸、0.5～1份甘草甜素和1～2份苯甲酸钠。需要说明的是，本发明采用的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)的菌种可以通过商购得到，如可通过国内外菌种培养公司购买，也可通过生物材料中心，如国内的CGMCC和CCTCC购买得到。在本发明中，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC NO:4.1321，球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC NO:4.1240。中国普通微生物菌种保藏管理中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
在本发明的进一步实施方式中，第一组分中，发酵的方法包括如下步骤：S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，在36～38℃发酵8～10h；S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，然后在22～25℃发酵2～4h；S103：将S102得到的产物在26～29℃发酵4～6天，收集发酵液，然后进行分离纯化，得到发酵产物。需要说明的是，活化后的灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)，优选为处于对数生长期的对应菌种。
在本发明的进一步实施方式中，S101中，发酵培养基中，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的接种含量为(5～10)×106cfu/mL，球孢链霉菌(Streptomycesglobisporus)的接种含量为(1～5)×105cfu/mL。需要说明的是，S101中，接种含量是指接种时的菌种含量，体积对应的为发酵培养基的原始体积；如球孢链霉菌的接种含量为(1～5)×105cfu/mL，是指对应于每mL的原始发酵培养基(而非对应于每mL的S101得到的产物)，接种的球孢链霉菌的含量为(1～5)×105cfu。
在本发明的进一步实施方式中，S101的发酵过程中，通气量为0.1～0.2v/v·min，搅拌转速为120～150rpm；S102的发酵过程中，通气量为0.02～0.04v/v·min，搅拌转速为300～350rpm；S103的发酵过程中，通气量为0.3～0.5v/v·min，搅拌转速为200～220rpm。需要说明的是，发酵生产中，通气量是指，每分钟内通过单位体积培养液的气体体积比(v/v·min)，如内装3m3培养液的发酵罐，若每分钟通入1.5m3的气体，则通气量为0.5v/v·min；本发明中，气体为无菌空气。
在本发明的进一步实施方式中，S101中，发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水。
在本发明的进一步实施方式中，S103中，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.0～7.2，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，其中，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:(60～100)；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用6～8倍柱体积的体积分数为10％～30％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物。
在本发明的进一步实施方式中，第一组分和第二组分的质量比为10:(1～2)。
在本发明的进一步实施方式中，组分还包括第三组分，第三组分和第一组分的质量比为10:(3～5)；第三组分的制备方法包括如下步骤：将苏叶、艾叶和紫草叶混合均匀，然后在酒精度为15％～25％的米酒中浸泡10～15h；将浸泡得到的混合物在60～70℃加热100～120min，过滤，收集滤液；将滤液进行脱色处理，然后浓缩成在80℃测定相对密度为1.2～1.3的浸膏，得到第三组分；其中，苏叶、艾叶和紫草叶的总质量与米酒的质量的比值为(1～2):10。需要说明的是，本发明采用的苏叶、艾叶和紫草叶，优选为收集的刚采摘的紫苏、艾草和紫草的叶子。
第二方面，本发明提供了上述抑制白色念珠菌生长的组合物的制备方法，包括如下步骤：将所有的组分混合均匀后均质分散35min～50min，均质分散的搅拌转速为500rpm～600rpm，得到组合物。
第三方面，本发明提供了上述抑制白色念珠菌生长的组合物在制备抑制白色念珠菌生长的产品中的应用。此处的产品包括用于抑制白色念珠菌生长的产品，比如药物。本发明提供的组合物可根据需要进一步制备成药学上可接受的剂型。此外，以上述组合物为活性成分制成的药物也属于本发明的保护范围。通过将上述组合物，直接制备或者加入药学上可接受的辅料后制备，可制成任何药学上可接受的剂型。以外用制剂为例包括：溶液剂、贴剂、酒剂、酊剂、凝胶剂、搽剂、气雾剂、喷雾剂、软膏剂、栓剂和涂膜剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明采用灰色链霉菌和球孢链霉菌进行共同发酵，将得到的发酵产物作为组合物的组分之一，制备得到的组合物具有抑制白色念珠菌生长的功效，且抑制效果显著；(2)本发明制备得到的抑制白色念珠菌生长的组合物，还可以有效抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阴道加特纳菌、白假丝酵母菌、表皮葡萄球菌、普通变形杆菌和藤黄微球菌等常见的易感染菌种，抗菌谱广，有利于对该组合物的进一步研究与开发；(3)本发明制备得到的抑制白色念珠菌生长的组合物，可以提高感染白色念珠菌患者的生活质量和用药依从性，减少患者的痛苦，且安全无毒副作用；(4)本发明提供的制备方法简单，生产成本低，质量稳定。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明实施例和对比例采用的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC NO:4.1321，球孢链霉菌(Streptomycesglobisporus)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC NO:4.1240；中国普通微生物菌种保藏管理中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明提供一种抑制白色念珠菌生长的组合物，组合物包括第一组分和第二组分，第一组分和第二组分的质量比为10:(1～2)；
其中，第一组分包括：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)发酵得到的发酵产物；
发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在36～38℃发酵8～10h，发酵过程中：通气量为0.1～0.2v/v·min，搅拌转速为120～150rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在22～25℃发酵2～4h，发酵过程中：通气量为0.02～0.04v/v·min，搅拌转速为300～350rpm；
S103：将S102得到的产物在26～29℃发酵4～6天，发酵过程中：通气量为0.3～0.5v/v·min，搅拌转速为200～220rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.0～7.2，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:(60～100)；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用6～8倍柱体积的体积分数为10％～30％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物；
第二组分按重量份计，包括：15～20份维生素B2、8～12份聚六亚甲基双胍盐酸盐、3～5份柠檬酸、0.5～1份甘草甜素和1～2份苯甲酸钠。
优选地，组分还包括第三组分，第三组分和第一组分的质量比为(3～5):10；第三组分的制备方法包括如下步骤：将苏叶、艾叶和紫草叶混合均匀，然后在酒精度为15％～25％的米酒中浸泡10～15h；将浸泡得到的混合物在60～70℃加热100～120min，过滤，收集滤液；将滤液进行脱色处理，然后浓缩成在80℃测定相对密度为1.2～1.3的浸膏，得到第三组分；其中，苏叶、艾叶和紫草叶的总质量与米酒的质量的比值为(1～2):10。
另外，本发明还提供了上述抑制白色念珠菌生长的组合物的制备方法，包括如下步骤：
将所有的组分混合均匀后均质分散35min～50min，均质分散的搅拌转速为500rpm～600rpm，得到组合物。
下面结合具体实施例对本发明提供的抑制白色念珠菌生长的组合物及其制备方法作进一步说明。
实施例一
本实施例提供一种抑制白色念珠菌生长的组合物，包括第一组分和第二组分，第一组分和第二组分的质量比为10:1；
其中，第一组分包括：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)发酵得到的发酵产物；
发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在36℃发酵8h，发酵过程中：通气量为0.1v/v·min，搅拌转速为120rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在22℃发酵2h，发酵过程中：通气量为0.02v/v·min，搅拌转速为300rpm；
S103：将S102得到的产物在26℃发酵4天，发酵过程中：通气量为0.3v/v·min，搅拌转速为200rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.0，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:60；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用6倍柱体积的体积分数为10％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物；
第二组分按重量份计，包括：15份维生素B2、8份聚六亚甲基双胍盐酸盐、3份柠檬酸、0.5份甘草甜素和1份苯甲酸钠。
按上述的原料，采用本发明提供的抑制白色念珠菌生长的组合物的制备方法，制备抑制白色念珠菌生长的组合物：
将所有的组分混合均匀后均质分散35min，均质分散的搅拌转速为500rpm，得到组合物。
实施例二
本实施例提供一种抑制白色念珠菌生长的组合物，包括第一组分和第二组分，第一组分和第二组分的质量比为10:2；
其中，第一组分包括：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)发酵得到的发酵产物；
发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在38℃发酵10h，发酵过程中：通气量为0.2v/v·min，搅拌转速为150rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在25℃发酵4h，发酵过程中：通气量为0.04v/v·min，搅拌转速为350rpm；
S103：将S102得到的产物在29℃发酵6天，发酵过程中：通气量为0.5v/v·min，搅拌转速为220rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.2，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:100；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用8倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物；
第二组分按重量份计，包括：20份维生素B2、12份聚六亚甲基双胍盐酸盐、5份柠檬酸、1份甘草甜素和2份苯甲酸钠。
按上述的原料，采用本发明提供的抑制白色念珠菌生长的组合物的制备方法，制备抑制白色念珠菌生长的组合物：
将所有的组分混合均匀后均质分散50min，均质分散的搅拌转速为600rpm，得到组合物。
实施例三
本实施例提供一种抑制白色念珠菌生长的组合物，包括第一组分和第二组分，第一组分和第二组分的质量比为10:1.5；
其中，第一组分包括：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)发酵得到的发酵产物；
发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在37℃发酵9h，发酵过程中：通气量为0.15v/v·min，搅拌转速为135rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在24℃发酵3h，发酵过程中：通气量为0.03v/v·min，搅拌转速为325rpm；
S103：将S102得到的产物在28℃发酵5天，发酵过程中：通气量为0.4v/v·min，搅拌转速为210rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.1，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:80；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用7倍柱体积的体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物；
第二组分按重量份计，包括：18份维生素B2、10份聚六亚甲基双胍盐酸盐、4份柠檬酸、0.8份甘草甜素和1.5份苯甲酸钠。
按上述的原料，采用本发明提供的抑制白色念珠菌生长的组合物的制备方法，制备抑制白色念珠菌生长的组合物：
将所有的组分混合均匀后均质分散40min，均质分散的搅拌转速为550rpm，得到组合物。
实施例四
本实施例提供一种抑制白色念珠菌生长的组合物，包括第一组分、第二组分和第三组分，第一组分、第二组分和第三组分的质量比为10:1:3；
其中，第一组分包括：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)发酵得到的发酵产物；
发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在36℃发酵8h，发酵过程中：通气量为0.1v/v·min，搅拌转速为120rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在22℃发酵2h，发酵过程中：通气量为0.02v/v·min，搅拌转速为300rpm；
S103：将S102得到的产物在26℃发酵4天，发酵过程中：通气量为0.3v/v·min，搅拌转速为200rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.0，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:60；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用6倍柱体积的体积分数为10％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物；
第二组分按重量份计，包括：15份维生素B2、8份聚六亚甲基双胍盐酸盐、3份柠檬酸、0.5份甘草甜素和1份苯甲酸钠。
第三组分的制备方法包括如下步骤：将苏叶、艾叶和紫草叶混合均匀，然后在酒精度为15％的米酒中浸泡10h；将浸泡得到的混合物在60℃加热100min，过滤，收集滤液；将滤液进行脱色处理，然后浓缩成在80℃测定相对密度为1.2的浸膏，得到第三组分；其中，苏叶、艾叶和紫草叶的总质量与米酒的质量的比值为1:10。
按上述的原料，采用本发明提供的抑制白色念珠菌生长的组合物的制备方法，制备抑制白色念珠菌生长的组合物：
将所有的组分混合均匀后均质分散35min，均质分散的搅拌转速为500rpm，得到组合物。
实施例五
本实施例提供一种抑制白色念珠菌生长的组合物，包括第一组分、第二组分和第三组分，第一组分、第二组分和第三组分的质量比为10:2:(3～5)；
其中，第一组分包括：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)发酵得到的发酵产物；
发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在38℃发酵10h，发酵过程中：通气量为0.2v/v·min，搅拌转速为150rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在25℃发酵4h，发酵过程中：通气量为0.04v/v·min，搅拌转速为350rpm；
S103：将S102得到的产物在29℃发酵6天，发酵过程中：通气量为0.5v/v·min，搅拌转速为220rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.2，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:100；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用8倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物；
第二组分按重量份计，包括：20份维生素B2、12份聚六亚甲基双胍盐酸盐、5份柠檬酸、1份甘草甜素和2份苯甲酸钠。
第三组分的制备方法包括如下步骤：将苏叶、艾叶和紫草叶混合均匀，然后在酒精度为25％的米酒中浸泡15h；将浸泡得到的混合物在70℃加热120min，过滤，收集滤液；将滤液进行脱色处理，然后浓缩成在80℃测定相对密度为1.3的浸膏，得到第三组分；其中，苏叶、艾叶和紫草叶的总质量与米酒的质量的比值为2:10。
按上述的原料，采用本发明提供的抑制白色念珠菌生长的组合物的制备方法，制备抑制白色念珠菌生长的组合物：
将所有的组分混合均匀后均质分散50min，均质分散的搅拌转速为600rpm，得到组合物。
实施例六
本实施例提供一种抑制白色念珠菌生长的组合物，包括第一组分、第二组分和第三组分，第一组分、第二组分和第三组分的质量比为10:1.5:(3～5)；
其中，第一组分包括：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)发酵得到的发酵产物；
发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在37℃发酵9h，发酵过程中：通气量为0.15v/v·min，搅拌转速为135rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在24℃发酵3h，发酵过程中：通气量为0.03v/v·min，搅拌转速为325rpm；
S103：将S102得到的产物在28℃发酵5天，发酵过程中：通气量为0.4v/v·min，搅拌转速为210rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.1，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:80；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用7倍柱体积的体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物；
第二组分按重量份计，包括：18份维生素B2、10份聚六亚甲基双胍盐酸盐、4份柠檬酸、0.8份甘草甜素和1.5份苯甲酸钠。
第三组分的制备方法包括如下步骤：将苏叶、艾叶和紫草叶混合均匀，然后在酒精度为20％的米酒中浸泡12h；将浸泡得到的混合物在65℃加热110min，过滤，收集滤液；将滤液进行脱色处理，然后浓缩成在80℃测定相对密度为1.25的浸膏，得到第三组分；其中，苏叶、艾叶和紫草叶的总质量与米酒的质量的比值为1.5:10。
按上述的原料，采用本发明提供的抑制白色念珠菌生长的组合物的制备方法，制备抑制白色念珠菌生长的组合物：
将所有的组分混合均匀后均质分散40min，均质分散的搅拌转速为550rpm，得到组合物。
对比例一
本对比例提供一种组合物，除第一组分的发酵方法不同，其他均同实施例六；其中发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)同时接种至发酵培养基中，灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)的接种含量为(5～10)×106cfu/mL，球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)的接种含量为(1～5)×105cfu/mL，在37℃发酵9h，发酵过程中：通气量为0.15v/v·min，搅拌转速为135rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将S101得到的产物在24℃发酵3h，发酵过程中：通气量为0.03v/v·min，搅拌转速为325rpm；
S103：将S102得到的产物在28℃发酵5天，发酵过程中：通气量为0.4v/v·min，搅拌转速为210rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.1，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:80；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用7倍柱体积的体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物。
对比例二
本对比例提供一种组合物，除第一组分的发酵方法不同，其他均同实施例六；其中发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在37℃发酵9h，发酵过程中：通气量为0.15v/v·min，搅拌转速为135rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在37℃继续发酵3h，发酵过程中：通气量为0.03v/v·min，搅拌转速为325rpm；
S103：将S102得到的产物在28℃发酵5天，发酵过程中：通气量为0.4v/v·min，搅拌转速为210rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.1，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:80；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用7倍柱体积的体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物。
对比例三
本对比例提供一种组合物，除第一组分的发酵方法不同，其他均同实施例六；其中发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在37℃发酵9h，发酵过程中：通气量为0.15v/v·min，搅拌转速为135rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在24℃发酵3h，发酵过程中：通气量为0.15v/v·min，搅拌转速为325rpm；
S103：将S102得到的产物在28℃发酵5天，发酵过程中：通气量为0.15v/v·min，搅拌转速为210rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.1，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:80；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用7倍柱体积的体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物。
对比例四
本对比例提供一种组合物，除第一组分的发酵方法不同，其他均同实施例六；其中发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，接种含量为(5～10)×106cfu/mL，在37℃发酵9h，发酵过程中：通气量为0.03v/v·min，搅拌转速为135rpm；发酵培养基的PH值为7.2，发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至S101得到的产物中，接种含量为(1～5)×105cfu/mL(对应发酵培养基原始体积)，然后在24℃发酵3h，发酵过程中：通气量为0.03v/v·min，搅拌转速为325rpm；
S103：将S102得到的产物在28℃发酵5天，发酵过程中：通气量为0.03v/v·min，搅拌转速为210rpm；收集发酵液，然后进行分离纯化，分离纯化具体包括：将发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.1，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，大孔吸附树脂与滤液的质量比为1:80；将色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用7倍柱体积的体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到发酵产物。
将本发明实施例一至实施例六制备得到的抑制白色念珠菌生长的组合物，通过功能学试验来系统评价其效果，并以对比例一至对比例四制备得到的组合物作为对照。
1、抑制白色念珠菌实验
试验方法：参照《卫生部药政局新药临床前研究指导原则》中“抗菌药体外抗菌实验原则”和《微生物检验技术》，采用连续二倍梯度液体稀释法测定组合物对于白色念珠菌ATCC 10231(美国典型菌种保藏中心)的最小抑菌浓度(MIC)。将实施例一至实施例六、对比例一至对比例四制备得到的组合物水剂冷冻干燥得到干粉，然后用MB培养基分别依次梯度稀释，并加入白色念珠菌的菌液，使每管最终菌液浓度约为1×107CFU/mL，组合物浓度每管分别为256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL。同时以不含组合物和菌液的空白MB培养基作为阴性对照。置37℃培养48小时，观察结果，试验重复三次，且每次设立三个平行样。
试验结果：具体实验结果如表1所示。
表1 不同组合物对白色念珠菌菌株的MIC(单位：μg/mL)
组别 实施例一 实施例二 实施例三 实施例四 实施例五
MIC 0.5 0.5 0.5 0.0625 0.0625
组别 实施例六 对比例一 对比例二 对比例三 对比例四
MIC 0.0625 8 4 4 2
2、对其他菌种抑制实验
试验方法：参照《卫生部药政局新药临床前研究指导原则》中“抗菌药体外抗菌实验原则”和《微生物检验技术》，采用连续二倍梯度液体稀释法测定组合物对于大肠埃希氏菌ATCC8739(美国典型菌种保藏中心)、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、阴道加特纳菌ATCC14018、白假丝酵母菌CMCC85021(中国医学微生物菌种保藏管理中心)、表皮葡萄球菌ATCC26069、普通变形杆菌CMCC49010和藤黄微球菌CMCC28006的最小抑菌浓度(MIC)。将实施例一至实施例六、对比例一至对比例四制备得到的组合物水剂冷冻干燥得到干粉，然后用MHB培养基分别依次梯度稀释，并加入对应菌种的菌液，使每管最终菌液浓度约为1×107CFU/mL，组合物浓度每管分别为256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL。同时以不含组合物和菌液的空白MHB培养基作为阴性对照。置37℃培养48小时，观察结果，试验重复三次，且每次设立三个平行样。
试验结果：具体实验结果如表2所示。
表2 不同组合物对其他菌种的MIC(单位：μg/mL)
3、组合物对于治疗大鼠白色念珠菌性阴道炎的效果试验
试验方法：(1)大鼠白色念珠菌性阴道炎模型建造：a.造模大鼠双侧卵巢切除：取体重80～100g性成熟未交配雌性健康Wistar大鼠若干，7％水合氯醛腹腔麻醉(0.5mL/100g)，无菌条件下摘除双侧卵巢。术后肌肉注射青霉素10万U/只，每天一次，连续3天，防治感染。b.制造假动情期，造成免疫功能低下：术后第7天开始灌胃给予戊酸雌二醇，每天800μg/100g，连续4天。c.感染过程：白念菌细胞(临床分离阴道病菌株SA-40)用MH肉汤培养基以200rpm速度振摇，30℃培养5小时。生长数目用紫外分光光度计检测。在对动物接种前，用生理盐水稀释至4×107CFU/100μL，50μL/只接种。造模大鼠取头朝下位，将菌液注入阴道内，原位停留1～2min，防止菌液溢出。感染后造模动物隔日灌胃给予戊酸雌二醇(1200μg/100g)一次，以保持假动情期和全身免疫功能低下状态，增加白色念球菌在阴道内的易感性。感染4天后(手术后第15天)，可见造模大鼠外阴红肿，伴少量白色分泌物，用无菌棉签蘸取分泌物，涂于沙氏培养基表面，30℃培养24小时，肉眼观察可见大小不等的白色菌落，分泌物镜检可见假菌丝和成群孢子，所取大鼠全部呈阳性，造模成功。
(2)组合物的使用：取80只白色念珠菌性阴道炎大鼠分为八组，每组10只。将实施例三、实施例六、对比例一至对比例四制备得到的组合物水剂冷冻干燥得到干粉，其中6组分别灌胃实施例三、实施例六或对比例一、二、三、四制备得到的组合物干粉；再取一组作为阳性对照组，灌胃咪康唑；另一组灌胃等量的生理盐水。阳性对照药物、组合物干粉和生理盐水的剂量均为25μg/100g，每日上午、下午各给药一次，期间持续隔日灌胃给予戊酸雌二醇(1200μg/100g)一次。
(3)病理学检测：包括病原体检查，即取大鼠阴道分泌物进行检查；病理组织学检查：动物处死后立即采取阴道组织置中性福尔马林，进行组织包埋、切片、染色。
试验结果：大鼠阴道液菌体培养结果：所有组分别于给组合物或药前，给组合物或药后2天、4天、8天、12天取阴道液，并且取阴道炎模型组、生理盐水组相同时间点的阴道液作为对照。取时注入100μL生理盐水灌洗，每管灌洗液取5μL，用生理盐水稀释至100μL接种培养，计算白色念珠菌菌落数。将每个时间点的模型组对应的菌落数作为100％，换算得到其他组别的对应时间点的白色念珠菌含量百分比。具体结果如下表3所示。
表3 不同组别阴道液中白色念珠菌含量比较
切片染色结果：最后一天接菌后，取大鼠阴道组织浸入中性福尔马林中，24小时后进行切片及HE染色。HE染色结果显示：实施例六组的免疫细胞数明显少于实施例三组，且实施例三组的免疫细胞数明显少于咪康唑组和对比例组，说明实施例三、实施例六制备得到的组合物对阴道炎有较好的抗炎作用，且优于阳性对照药咪康唑。
毒性试验：选体重为18～22g的小白鼠40只(雌雄各20只)，分为4组，每组雌雄各5只，分别灌胃本发明实施例一至实施例六制备得到的抑制白色念珠菌生长的组合物，给药剂量均为0.5mL/kg，连续给药30天。给药期间及停药后1周时，观察白鼠生长状态和活动饮食，鉴定血液学、血液生化学、脏器组织结构以及尿常规等。结果发现所有小白鼠均健康生存，无任何毒副作用；解剖观察血象、肝功能、各脏器组织状态，与正常小白鼠比较无差异。实验证明，本发明提供的抑制白色念珠菌生长的组合物无毒副作用，可以安全使用。
4、组合物治疗外阴阴道白色念珠菌感染的临床试验效果
试验方法：入选病例120例，有VVC症状，包括瘙痒症、烧灼感或分泌物等临床表现，用棉签在阴道穹隆上方取得的分泌物进行镜检有假菌丝存在。将120例患者随机分为6组，每组20人，每组分别使用泡洗外阴部。将本发明实施例三、实施例六或对比例一、二、三、四制备得到的组合物20mL分别溶解于2L的55～60℃的温水中，患者于每天睡前采用含对应组的组合物温水泡洗外阴一次，每次清洗2min，连续用药一周。治疗期间禁止性生活，不得使用其它的阴道药物处理。在治疗的最后阶段，即第7天，患者继续接受观察、阴道分泌物培养以及CBC(全血细胞计数)和肝肾功能检测。
疗效评定标准：(1)临床痊愈：患者的瘙痒、红斑、腐蚀、灼烧感等症状消失，阴道分泌物中不含白色念珠菌，恢复正常；(2)显效：患者的瘙痒、红斑、腐蚀、灼烧感等症状基本或大部分消失，阴道分泌物中白色念珠菌数目显著减少；(3)有效：患者的瘙痒、红斑、腐蚀、灼烧感等症状有改善，阴道分泌物中白色念珠菌数目有所减少；(4)无效：症状无任何改善。
试验结果：评定的疗效结果具体如下表4所示。
表4 组合物对外阴阴道白色念珠菌感染患者的疗效
组别 治愈(例) 显效(例) 有效(例) 无效(例)
实施例三 15 4 1 0
实施例六 20 0 0 0
对比例一 0 5 10 5
对比例二 0 10 7 3
对比例三 2 12 5 1
对比例四 3 9 8 0
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明采用灰色链霉菌和球孢链霉菌进行共同发酵，将得到的发酵产物作为组合物的组分之一，制备得到的组合物具有抑制白色念珠菌生长的功效，且抑制效果显著；(2)本发明制备得到的抑制白色念珠菌生长的组合物，还可以有效抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阴道加特纳菌、白假丝酵母菌、表皮葡萄球菌、普通变形杆菌和藤黄微球菌等常见的易感染菌种，抗菌谱广，有利于对该组合物的进一步研究与开发；(3)本发明制备得到的抑制白色念珠菌生长的组合物，可以提高感染白色念珠菌患者的生活质量和用药依从性，减少患者的痛苦，且安全无毒副作用；(4)本发明提供的制备方法简单，生产成本低，质量稳定。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种抑制白色念珠菌生长的组合物，其特征在于，所述组合物包括第一组分和第二组分；
其中，所述第一组分包括：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)发酵得到的发酵产物；
所述第二组分按重量份计，包括：15～20份维生素B2、8～12份聚六亚甲基双胍盐酸盐、3～5份柠檬酸、0.5～1份甘草甜素和1～2份苯甲酸钠。
2.根据权利要求1所述的抑制白色念珠菌生长的组合物，其特征在于：
所述第一组分中，所述发酵的方法包括如下步骤：
S101：将活化后的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)接种至发酵培养基中，在36～38℃发酵8～10h；
S102：将活化后的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)接种至所述S101得到的产物中，然后在22～25℃发酵2～4h；
S103：将所述S102得到的产物在26～29℃发酵4～6天，收集发酵液，然后进行分离纯化，得到发酵产物。
3.根据权利要求2所述的抑制白色念珠菌生长的组合物，其特征在于：
所述S101中，所述发酵培养基中，所述灰色链霉菌(Streptomyces grise us)的接种含量为(5～10)×106cfu/mL，所述球孢链霉菌(Streptomyces globis porus)的接种含量为(1～5)×105cfu/mL。
4.根据权利要求2所述的抑制白色念珠菌生长的组合物，其特征在于：
所述S101的发酵过程中，通气量为0.1～0.2v/v·min，搅拌转速为120～150rpm；所述S102的发酵过程中，通气量为0.02～0.04v/v·min，搅拌转速为300～350rpm；所述S103的发酵过程中，通气量为0.3～0.5v/v·min，搅拌转速为200～220rpm。
5.根据权利要求2所述的抑制白色念珠菌生长的组合物，其特征在于：
所述S101中，所述发酵培养基的PH值为7.2，所述发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖2g/L、淀粉5g/L、蛋白胨0.1g/L、酵母膏0.4g/L、花生饼粉2g/L、黄豆饼粉10g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硝酸铵0.2g/L，余量为水。
6.根据权利要求2所述的抑制白色念珠菌生长的组合物，其特征在于：
所述S103中，所述分离纯化具体包括：将所述发酵液过滤，收集滤液；调节pH值至7.0～7.2，然后采用填装有AB-8大孔吸附树脂的色谱柱吸附分离，其中，所述大孔吸附树脂与所述滤液的质量比为1:(60～100)；将所述色谱柱用水洗脱至流出液无色，然后用6～8倍柱体积的体积分数为10％～30％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，得到所述发酵产物。
7.根据权利要求1所述的抑制白色念珠菌生长的组合物，其特征在于：
所述第一组分和所述第二组分的质量比为10:(1～2)。
8.根据权利要求1-7任一项所述的抑制白色念珠菌生长的组合物，其特征在于：
所述组分还包括第三组分，所述第三组分和所述第一组分的质量比为(3～5):10；
所述第三组分的制备方法包括如下步骤：将苏叶、艾叶和紫草叶混合均匀，然后在酒精度为15％～25％的米酒中浸泡10～15h；将所述浸泡得到的混合物在60～70℃加热100～120min，过滤，收集滤液；将所述滤液进行脱色处理，然后浓缩成在80℃测定相对密度为1.2～1.3的浸膏，得到第三组分；其中，所述苏叶、艾叶和紫草叶的总质量与所述米酒的质量的比值为(1～2):10。
9.权利要求1-8任一项所述的抑制白色念珠菌生长的组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所有的组分混合均匀后均质分散35min～50min，所述均质分散的搅拌转速为500rpm～600rpm，得到所述组合物。
10.权利要求1-8任一项所述的抑制白色念珠菌生长的组合物在制备抑制白色念珠菌生长的产品中的应用。
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