CN101322746B - 二次发酵法天然药物制剂、制备方法及用途 - Google Patents
二次发酵法天然药物制剂、制备方法及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101322746B CN101322746B CN2008100583688A CN200810058368A CN101322746B CN 101322746 B CN101322746 B CN 101322746B CN 2008100583688 A CN2008100583688 A CN 2008100583688A CN 200810058368 A CN200810058368 A CN 200810058368A CN 101322746 B CN101322746 B CN 101322746B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- liquid formulation
- time
- test
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Abstract
本发明涉及一种采用中药为原料,通过生物二次发酵工程技术和生化技术制备的具有高效广谱抗菌活性,使用安全,药效稳定的多组份天然药物制剂,即通过发酵工程获得的天然抗菌药物。本发明采用中药为原料,通过对灵芝菌发酵,在发酵过程中,通过二次发酵工艺并采用中途中止二次发酵技术来获得具有高抗菌活性、具有生物活性的的发酵中间代谢产物,以此获得具有抗HIV及多种性病病原体、禽流感病毒的原液制剂,经与其它组份混合后制得高效广谱的天然抗菌药物制剂。该制剂并具有使用无毒副作用、无刺激性、无过敏反应,使用安全可靠的特点,可应用于治疗、预防多种性病致病菌、禽流感药物,以及多种消杀剂卫生用品,如超声波雾化剂、洗涤剂、空调清新剂和药用湿巾。
Description
技术领域:
本发明涉及一种采用中药为原料,通过生物二次发酵工程技术和生化技术制备的具有高效广谱抗菌活性,使用安全,药效稳定的多组份天然药物制剂,即通过发酵工程获得的天然抗菌药物。
背景技术:
相关技术领域国内外发展现状和趋势,跨入21世纪,传统医药在“回归自然”的世界潮流中再次焕发出强大的生命力,呈现现代化发展的广阔前景,使之与现代医药技术相结合,是步入国际市场的关键所在。采用中药为原料,经二次发酵工程获得的天然抗菌药物制剂工艺未见报道。
发明内容:
本发明的目的在于研制一种采用中药为原料,通过对灵芝菌发酵,在发酵过程中,通过二次发酵工艺并采用中途中止二次发酵技术来获得具有高抗菌活性、具有生物活性的的发酵中间代谢产物,以此获得具有抗HIV及多种性病病原体、禽流感病毒的原液制剂,经与其它组份混合后制得高效广谱的天然抗菌药物制剂。该制剂并具有使用无毒副作用、无刺激性、无过敏反应,使用安全可靠的特点,可应用于治疗、预防多种性病致病菌、禽流感药物,以及多种消杀剂卫生用品,如超声波雾化剂、洗涤剂、空调清新剂和药用湿巾。
本发明二次发酵法天然药物制剂的目的是这样:
天然药物制剂本质上包含有从发酵获得具有抗菌活性的中间代谢产物,中间代提谢产物与丙二醇、水混合后,再加入药用辅料,制成多种天然药物制剂。上述三种组份按其重量百分比配比为:A:具有生物活性的中间代谢产物原液25-10%;B:丙二醇5-10%;C:纯水70-80%其余为药用辅料。
二次发酵法天然药物制剂的制备方法,其制剂分别由龙胆草、桑白皮、木贼和三七四种中药材为原料,经二次发酵法获得高效广谱抗菌活性的中间代谢产物,再经生化技术处理,制成制剂。
工艺是:(1)第一次发酵:先将龙胆草、桑白皮、木贼和三七四种中药材原料分别制成发酵用培养液并分别接种进行第一次发酵,在28~35℃温度下发酵3-7天,获得的发酵液经灭菌、过滤和冷冻处理、待用;(2)第二次发酵:将上述四种发酵液按1∶0.5-3∶0.5-3∶1比例混合,制成二次发酵用培养液,接种后进行第二次发酵,在28~35℃温度下发酵2-4天,中止发酵灭菌过滤、冷冻,即获得具有抗菌活性的中间代谢产物,待用;(3)再经生化技术处理,并加入5-10%丙二醇稳定剂,制成原液制剂。
二次发酵法天然药物制剂的用途,特征在于将该原液制剂浓度稀释2倍后,在1~2分钟内,可将杀灭包括:疱疹病毒、淋球菌、阴道滴虫、梅毒螺旋体、衣原体和支原体多种性病致病菌和妇科性传播性疾病。
二次发酵法天然药物制剂的用途,特征在于将该原液制剂稀释500~800倍可杀灭艾滋病病毒、禽流感病毒性病。
二次发酵法天然药物制剂的用途,特征在于将含有0.01浓度的原液制剂制成洗涤剂、空调清新剂,用于杀灭多种致病菌的消杀卫生用品;用于餐饮业和家庭碗碟消毒,消杀肝炎病毒和肠道致病菌的感染传播。
二次发酵法天然药物制剂的用途,特征在于将含有0.01浓度的原液制剂制作为超声波雾化剂,用于医院病房及其它公共场所,预防致病菌的交叉感染;也可用于家禽养殖场、超市、预防禽流感病的感染传播。
二次发酵法天然药物制剂,特征在于该原液制剂对皮肤、粘膜无毒副作用,无刺激性和过敏反应,使用安全可靠,该制剂在保质期内,理化性质、指纹图谱无变化,抗菌效力稳定。
本发明具有高效广谱的抗菌特征,可将其制备成阴道栓剂、凝胶剂和喷雾剂,从不同角度,不同途径用于预防艾滋病和预防治疗多种性病。
1)、本发明阴道栓剂和凝胶剂,在两性接触过程中,不但可在阴道内有效杀灭患者携带的艾滋病病毒和多种性病致病菌,(包括疱疹病毒、淋球菌、阴道滴虫、梅毒螺旋体、衣原体和支原体等)的感染传播,还可用于治疗女性因性接触感染上述致病菌而引起的妇科性传播性疾病(如外阴、阴道、宫颈、子宫及附件的炎症,甚至引起宫颈糜烂、盆腔炎、盆腔脓肿、不孕症等)。
2)、本发明喷雾剂,可用于喷洒预防杀灭艾滋病病毒和多种性病致病菌携带者,在性接触过程中通过精液和分泌物对遗漏在皮肤、衣、被及用具上的致病菌的感染和传播;用于预防高风险行业人员如医院、监狱、戒毒所及艾滋病防治中心的人员通过血液途径感染艾滋病病毒,以及预防治疗禽流感。
根据本发明还可制成多种消杀剂卫生用品。
1)超声波雾化剂:将含有0.01浓度的超声波雾化剂用于医院病房及其它公共场所,可预防病人的交叉感染;超级致病菌(包括变异的金黄色葡萄球菌和棱状芽孢杆菌)等突发病的感染传播;也可用于家禽养殖场、出售禽类的菜市场和超市、预防禽流感等禽病的感染传播。
2)洗涤剂、药用纸巾:将含有0.01浓度的洗涤剂,用于餐饮业和家庭碗碟消毒,消杀肝炎等病毒和肠道致病菌的感染传播。妇科用洗剂和药用纸巾。
3)空调清新剂:空调设备是人们普遍使用的家用电气,由于空调中空气受微生物的污染,致使人们产生头晕,恶心、呕吐等“空调症”,严重影响使用。可用配件将含有0.01浓度的清新剂装入空调设备中,杀灭这些有害微生物的危害,使空调机送出的空气清新安全。
社会效益显著:被称为“世纪瘟疫”的艾滋病,是目前最主要的传染病之一,已从特殊人群向普通人群迅速蔓延,但目前尚无特效药物治疗:禽流感病毒是一类能引起人和禽类交叉感染的新型流行传染病;性病和肝炎也是长期困扰人类的主要传染病,因此研发该天然抗菌新药,和消杀剂卫生用品,用于预防艾滋病、性病、禽流感、肝炎感染传播非常必要。对社会稳定、经济发展和人类健康有着重要意义。根据本发明的药效、剂型,应用范围和特点。本发明不仅是中国,也是国际急需的药物,不但在中国有广阔的市场,也有实力参与国际市场竞争、开拓国际市场。
本发明药物制剂不但属于自主创新、自主研发、拥有自主知识产权的创新药物,也是国家鼓励支持的社会急需的天然创新药物新项目。符合国家“十一五”科技计划体系鼓励和优先支持有重点,对推动西部边陲地区科技创新建设,支撑经济社会持续快速稳定协调发展均具有重要意义。目前在市场尚无此类高效广谱使用安全和用途广泛的药物制剂上市。
附图说明:
图1为本发明的制作工艺流程图。
图2、3、4为本发明天然药物制剂的稳定性测试图。
具体实施方式:
实施例1
菌种制备:生产用菌种为灵芝菌Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)
性状:通常所称的灵芝指灵芝的子实体,在本发明中主要使用灵芝的菌丝体作为发酵用菌种。菌丝体培养特征及镜检:菌种接种于马铃薯培养基斜面,温度为24-26℃,培养时间120小时生长出无色或近白色絮状菌丝体,或做平板单菌落培养,菌落呈不规则无色或近白色絮状菌丝体,边缘呈辐射状。
将上述菌种接种在马铃薯培养液中,在24~35℃温度下,摇床培养180-220次/分钟,PH值自然,培养5-7天,制成菌悬液,作为第一次和第二次发酵用菌种(菌悬液)。
第一次发酵:分别称取100g龙胆草、桑白皮、木贼和三七四种中药原料,洗涤后在每一种原料中加入1000毫升纯化水,浸泡30分钟,煮沸30分钟,分别过滤、获得四种不同药物的发酵培养液,按5%接种量,接种灵芝菌种液,在24~35℃温度下发酵3-7天,获得四种发酵液,经灭菌、过滤和冷冻处理,待用;
第二次发酵:将上述四种发酵液按1∶0.5∶0.5∶1比例混合,制成二次发酵用培养液,接种后进行第二次发酵,在28~35℃温度下,摇床培养180-220次/分钟,PH值自然,发酵2-4天后中止发酵,灭菌、过滤和冷冻,即获得具有抗菌活性的中间代谢产物发酵液,待用;(注:如果不采用中止发酵,将其发酵至终点,其最终产物就不具备抗菌活性)
生化技术处理:配制使用药用丙二醇5%+纯化水75%+中间代谢产物发酵液20%,即制成药用原液制剂
实施例2:四种发酵液按1∶3∶3∶1比例混合,丙二醇用10%;纯化水用70%,其它与实施例1相同,不再重述。
实施例3:四种发酵液按1∶2.2∶2.2∶1比例混合;丙二醇8%;纯化水73%,其它与实施例1相同,不再重述。
实施例4(栓剂配制)取本发明发酵液原液制剂800ml加入20g丙三醇并搅拌均匀,将上述液体缓缓加入900ml明胶甘油基质中,充分搅匀,在50℃保温灌模,每粒重5克。
实施例5(凝胶剂配制)原料:本发明发酵液原液制剂500ml、海藻酸钠30g、枸橡胶钙0.5g、尼泊全甲酯2.0g甘油450ml和蒸馏水1000ml。按常规制作凝胶剂方式制作,再此不再重述。
本发明原液制剂检定规程(包括建立该药物的质量鉴定、生化、指纹图谱检测和药物效力检定标准)
一、生产用菌种为灵芝菌Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr)YK-006。
性状:通常所称的灵芝,指灵芝的子实体、子实体菌盖肾形或近半园形12cm×8cm,厚约1.8cm;菌盖中间色深、略带红竭色、盖缘向外渐淡呈黄褐色,有同心环带和环沟,并有纵皱纹,表面有油漆状光泽、菌肉淡褐色、木栓质、菌管淡褐色至褐色,菌管长约1cm,菌柄侧生为扁园柱形,粗2-4cm,长约15cm,表面与菌盖同色,有油漆状光泽、孢子呈淡褐色,卵形、顶端平截状、双层壁、外孢壁平滑,菌丝体近五色,有分枝,多弯曲、直径3-6μm,壁厚无隔膜,无锁状联合,菌落近园形边缘不规则,菌丝无色或近白絮状,边缘呈放射状。
培养特征及镜检:菌种接种于马铃薯培养基斜面,温度24-26℃,培养时间120小时后,生长出无色或近白色絮状菌丝体;或做平板单菌落培养,菌落呈不规则圆形五色或近白色絮状菌丝体、边缘呈辐射状;或做菌丝小培养,培养温度24-26℃,培养时间120小时后镜检菌丝体有分枝、生长良好整齐,无杂菌污染。
二、原液制备
培养基:生产用培养基为马铃薯培养基或其他适宜培养基。PH5.5~6.0,培养基中不应含有对人有害或其他过敏原物质。
生产用种子:启开工作种子批菌种,接种在马铃薯培养基上,于25±1℃恒温培养120小时后接种继代培养。第2、第3代的菌种适用于生产种子,用于生产。
三、菌种接种与第一次发酵培养
挑取生长良好的菌种,分别移种于主要含I龙胆草、II木贼、III桑白皮、IV三七等四种不同培养液中,摇床或发酵罐培养168小时后,结束培养。
发酵液的收集:将上述四种I、II、III、IV不同发酵液分别置入热压灭菌锅灭菌(0.15MPa、126℃,20分钟)取出冷却过滤,滤液冷贮24小时后备用。
四、第二次发酵培养
将上述四种I、II、III、IV不同发酵液,按1∶0.5∶0.5∶1比例配制成第二次发酵用培养液,备用。
挑取生长良好的菌种移种于二次发酵用培养液,经60-120小时培养后,加热中止其发酵。
二次发酵液的收集:将中止发酵液收集热压灭菌(0.15MPa,126℃、20分钟),冷却后过滤,滤液冷贮24小时后备用。
五、半成品
配制用药丙二醇5%+纯化水75%+二次发酵液20%混均,艰成半成品原液。
1.半成品原液的检定:PH为5.56-6.10。外观:振摇后为黄褐色均匀混悬液。气味:味苦稍带甜味、气清香。
2.高压液相色谱指纹图谱检定:按照高压液相色谱法的外标法,检测样品色谱图(指纹图谱)应与附表色谱图(指纹图谱)一致。三个“指标标成份”保留时间为
龙胆苦甙Gen Rt 6.98min。
人参皂甙RGl Rt 9.57min
人参皂甙Rbl Rt 11.35rain
其它还有几个主要色谱峰,它们的保留时间(Rt)分别是14.53min、15.59min、15.94min、16.19min和20.14min
3.效力检定
以淋球菌作为效力检定代表菌,效力检定结果:在滴入样品的T-M琼脂平板上,1-2分钟内就应全部杀死淋球菌。
4.微生物限度检查
按照微生物限度检查法《中国药典)2005年版二部附录XJ有关要求进行。
附录1
1、检测菌株:淋球菌WHO药敏参考株A株(青霉素敏感)
2、检测方法及步骤
(1)将在T-M琼脂培养基(淋球菌Thayer-MarTin专用培养基)活化的新鲜淋球菌菌苔在生理盐水中稀释,计数后调整至1.0×108cfu/ml备用。
(2)将样品(临床用剂量含安体爽康成份4000u/ml),取0.9ml,再加入经(1)定量的菌液01ml充分混匀后,分别作用1分钟、2分钟、3分钟、5分钟后,取0.05ml滴在T-M琼脂平板上,用接种环均匀划种后,放入CO2培养箱中培养48-72小时,计数菌落,同时设空白对照,记录结果。在滴入经1-2分钟处理过的样品在T-M琼脂平板上,淋球菌应全部被杀死。
本发明临床前的试验研究结果表明,应用高科技生物发酵工程技术和高科技生化技术研发出的本发明药物,既不是传统的中药也不是化学药物,而是一种属于发酵工程制备的新型抗菌天然创新药物,是一类极具开发价值的高效广谱,使用安全、药效稳定的药物,其特点及优势如下:
一、药效学研究结果表明:该原液制剂浓度稀释2倍后,在1~2分钟内,可将杀灭包括:疱疹病毒、淋球菌、阴道滴虫、梅毒螺旋体、衣原体和支原体多种性病致病菌和妇科性传播性疾病。
单纯疱疹病毒定量灭活试验
一材料
1.单纯疱疹病毒毒株单纯疱疹病毒2型(HSV-2)333株,为国际标准毒株,自中国卫生部药品与生物制品检定所引进。
2.细胞非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),自中国科学院上海细胞生物所引进。
3.样品本发明原液制剂(ZYK-001)消毒液,由昆明云大科斯创生物工程有限公司生产。20030101。为棕褐色均质液体。
4.细胞完全培养基(含10%胎牛血清RPMI 1640)
5.细胞维持培养基(含2%胎牛血清的RPMI】640)
6.磷酸盐缓冲液(PBS)0.03molfI。,pH7.20
二、方法
参照卫生部《消毒技术规范》(第三版)第一分册“实验技术规范”中“2.10艾滋病病毒灭活试验(细胞感染法)”的操作方法,结合单纯疱疹病毒的特点进行试验。将Vero细胞接种于96孔培养板中,长成细胞单层后待用。用PBS将消毒液按1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10稀释,配制成4个浓度的溶液。试验温度为25℃。
试验分组及方法如下:
1.试验组:将相应浓度的消毒液50μL分别与HSV-2病毒悬液50μL(病毒量为1000TCID50)混匀,作用1分、3分、5分钟后,用细胞完全培养基900μL稀释中止反应,充分混匀5分钟后,取100μL接种于Veto细胞单层。置37℃孵育1小时后,更换新鲜维持培养基。然后置37℃、5%CO2条件下培养72小时,根据细胞病变判断有无病毒生长。
2.阳性对照组:以PBS代替消毒液,按试验组步骤加入病毒进行试验和培养。
3.阴性对照组:用不含病毒的维持培养基为阴性对照。
三、结果
原液制剂((ZYK-001)消毒液对单纯疱疹病毒的灭活效果,见下表。
表:本发明原液制剂(ZYK-001)消毒液对单纯疱疹病毒的灭活效果
注:所用单纯疱疹病毒为HSV2333株,病毒接种量为100’FCIDso。
四、结论在25℃时,本发明原液制剂(ZYK-001)消毒液在1∶2稀释时,作用1分钟可完全灭活单纯疱疹病毒;在1∶5稀释时,作用3分钟可完全灭活单纯疱疹病毒。
淋球菌消杀试验
一、材料和方法:
1检测菌株:淋球菌WHO药敏参考株A株(青霉素敏感、大观霉索耐药)。
2测方法及步骤:将在TM琼脂(淋球菌专用培养基)上活化的新鲜淋球菌菌苔在生理盐水中,至1.0×108cfu/ml,备用。
3将样品用蒸馏水稀释成1∶2、1∶5、1∶10、1∶20共4个稀释度,各取0.9mL,再各加入经(1)定量的菌液0.1mL,充分混匀后,分别于1分钟、3分钟和5分钟,分别取0.05mL,滴在TM平板上,用接种环均匀划种后,放入烛缸中培养48-72小时。计数菌落,同时设空白对照。结果计入表内。
表:本发明原液制剂外对淋球菌的杀菌作用
注:-:平板划线处无菌生长:
+:淋球菌生长菌落数在10个以内;
++:淋球菌生长菌落数在10~100个:
+++:淋球菌生长菌落数在数百个,但未融合成片:
++++:淋球菌生长菌落融合成片,无法计数;
结论:检测结果表明:在1∶2浓度1分钟即可杀死淋球菌.而1∶5浓度时,需5分钟才能杀死淋球菌。
沙眼衣原体的杀菌试验作用
材料与方法1.沙眼衣原体菌株沙眼衣原体L3型,国际标准菌株。2.本发明原液制剂(ZYK-001)无色透明液体。用灭菌双蒸水稀释,配制成不同浓度的水溶液。3.试验方法按卫生部“消毒剂鉴定技术规范”,结合沙眼农原体特点加以改良。稀释后的药液与L3株沙眼衣原体作用1、3、5分钟后,用稀释法中止反应并接种McCoy单层细胞。离心,换分离培养基,培养48小时后,作碘染色,显微镜下检查包涵体。结果见下表
表:本发明原液制剂对沙眼衣原体的杀菌作用
+见到细胞内衣原体的包涵体
-未见到细胞内衣原体的包涵体
结论发明原液制剂1∶10稀释时,作用1分钟对沙眼衣原体有杀灭作用。
对解脲支原体的杀灭试验
一、材料
1、试验菌株:解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)国际标准株,初代由首都儿科研究所提供,试验前重复传代6次。
2、消毒剂名称:本发明原液制剂(zYK-001)。性状:棕色液体、浑浊
3、培养基:解脲支原体液体培养基
二、方法
1、按”卫生部消毒产品检验规定”,根据支原体特点稍作改良。
2、消毒剂浓度:将原液按体积比用无菌蒸馏水稀释成1∶2、1∶5、1∶10、1∶20四个浓度。
3、支原体悬液:106
4、作用时间:1分钟、2分钟、5分钟。
5、试验温度:25℃。
6、试验重复次数:3次。
三.结果:(见下表)
“”表示无支原体生长
“-”:表示无支原体生长
空白对照:-(无支原体生长)
加样品不加菌液对照:-(无支原体生长)
加菌液不加样品对照:+(有支原生长)
四结论:检测结果表明,用1∶2(v/v)的本发明原液制剂作用1分钟,即可杀灭解脲支原体。
梅毒螺旋体制动试验
一.材料与方法
1.本发明原液制剂提取液(ZYK-001)
2.梅毒螺旋体(Nichols株)
3.试验方法及步骤
①制各梅毒螺旋体旋液(每个视野I>30条螺旋体)。
②样品用无菌蒸馏水作系列稀释。本试验未用终止剂。
③观察制动效果。
二.结果:本发明原液制剂提取液(ZYK-001)对梅毒螺旋体的制动作用(见表)
表:本发明原液制剂取液(ZYK-001)对梅毒螺旋体的制动作用
-:有制动作用,.+:无制动作用
三.结论:本发明原液制剂提取液(ZYK-001)原液作用2分钟,1∶2稀释作用4分钟可制动梅毒螺旋体。
对阴道毛滴虫的抑杀试验
一、材料
1.阴道毛滴虫临床株:
在本院性病科临床取材数株,经实验室灭菌、分离,得到纯培养的阴道毛滴虫虫株。
2.肝浸液培养基:按照《现代性传播疾病实验诊断技术》的方法,常规配制并分装试管。
3.稀释剂:即为简易培养液,按照《现代性传播疾病实验诊断技术》的方法,常规配制。
4.消毒剂:本发明原液制剂(ZYK-001)l。
实验前用无菌蒸溜水稀释药液,常规配成1∶2、1∶5、1∶10、1∶20的药液待用。
二、方法
参照卫生部《消毒技术规范》的有关条例,结合阴道毛滴虫的特点加以改良。试验前将纯化的新鲜活泼的虫体洗涤三次后浓集。经计数后制成1.O×10’个虫体/ml的悬液备用。
1.试验组:将稀释后不同浓度的消毒液分别与滴虫悬液作用1分钟、3分钟、5分钟,用简易培养液稀释终止反应。离心后,将滴虫沉淀接种于肝浸液培养基中,于37℃培养48小时,镜检观察。有完整且活动的虫体,示为无抑杀作用㈩;虫体破碎或无活动虫体,示为有抑杀作用(-)。对阴道毛滴虫有抑杀作用的最低浓度的药物管浓度为该药对阴道毛滴虫的最低抑杀浓度。
2.阳性对照组:以简易培养液代替消毒剂,按实验组步骤加入滴虫悬液进行试验。
3.阴性对照组:以不接种滴虫的培养基为阴性对照。
4.试验温度:22℃±2。
三、结果:见下表::抑杀试验结果
注:.(-)可见虫体破残碎片和无活动虫体:(+)有活动宴体;
结论:本发明原液制剂(ZYK-001)为褐色液体,溶于水。在其原液1∶5稀释后与滴虫作用3分钟,培养48小时后镜检观察,阴道毛滴虫全部死亡,认为此液体有抑杀阴道毛滴虫作用。
本检测符合卫生部《消毒技术规范》(第三版)第一分册实验技术规范1999.11.的要求。
本发明生物提取原液制剂液体抗艾滋病病毒1型的实验研究
1.实验材料
1.1药物
①药物:生物提取液原液制剂(ZYK.001),由昆明云大科斯创生物工程有限公司制备,中国医学科学院皮肤病研究所提供,批号:20030101,临用前用IMDM培养液作倍比稀释。
②膦甲酸钠(PFA),由常州一厂制备,作为体外RT酶实验阳性对照药。
1.2试剂
IMDM培养粉,GIBCO公司产品:P24检测试剂盒,CO[JLTER公司产品;poly(A)(dT)15为Boehringer Mannheim GmbH公司产品;3HdTTP为杜邦公司产品;DTT,牛血清白蛋白为天象人公司产品;其余均为国产分析纯产品。
1.3CEM细胞:含15%小牛血清的IMDM培养液定期传代,由医药生物技术研究所病毒室保存。
1-4艾滋病病毒1型(III B株):由美国西奈山医学中心提供。
1.5艾滋病病毒1型逆转录酶(HIV-1RT):为基因工程酶,由医药生物技术赢所病毒室制备并纯化。
2.实验方法 2.1 生物提取液原液制剂在细胞外直接对HIV.RT抑制作用的测定
2.1.1 将生物提取液原液制剂用双蒸水作1∶5,1∶25,1∶125,1∶625稀释,样品稀释后加入含有(啊s.-HCl,BSA,DTT,Biotin-dUTP,MgCl2,KCl)的反应Buffer中,并加入适量酶。37℃反应1小时。取样,测OD450值。
2.2生物提取液原液制剂对人T-淋巴细胞系(CEM-细胞)毒性的测定
以4万CEM细胞/孔接种于96孔培养板,分别加入不同稀释度的生物提取液原液制剂,每个稀释度重复3个孔,同时设细胞培养对照孔,37℃培养48小时,台盼兰计数每孔细胞数,用Reed-Muench法计算半数毒性剂量(TC50)。
2.2本发明生物提取液原液制剂对HIV-I活体全病毒灭活作用的测定
将2万CEM细胞/孔接种子96孔板中,加入不同稀释度生物提取液原液制剂,使其终浓度为原液的1∶250,1∶500,1∶1000,1∶2000,1∶4000和1∶8000,每个稀释度重复4个孔,用HIV-1病毒感染细胞,设病毒对照孔,每两天换一次培养液,至病毒对照孔细胞出现典型的HIV-1病毒引起细胞融合特征性病变(SI),记录各稀释度样品Sl,结果。
2.3本发明生物提取液原液制剂对HIV-1在CEM细胞内P24抗原表达量的影响
方法同2.2,于培养第五天取各稀释度4个复孔细胞悬液,合并,用P24检测试剂盒测定其p24蛋白含量。
3.实验结果
3.1本发明生物提取液原液制剂在细胞外直接对HIV-RT的抑制作用
本发明生物提取液原液制剂对HIV-1RT的活性有直接抑制作用,其半数有效浓度为原液的0.017倍,结果见下表。
表:生物提取液原液制剂对HIV-RT的IC50测定
3.2生物提取液原液制剂对人T-淋巴细胞(CEM细胞)毒性作用
台盼兰计数法测定生物提取液原液制剂48小时对CEM细胞的半数有毒浓度为其原液的1∶84倍稀释,结果见下表。
表:生物提取液原液制剂对CEM细胞毒性结果
样品/稀释度 0 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024 TC50
生物提取液 68×1014 014×1014 66×1014 68×1014 69×1014 69×1014 1∶84
原液制剂
3.3生物提取液原液制剂在CEM细胞上抗HIV-1作用
CEM细胞加入不同稀释度的生物提取液原液制剂,同时感染HIV-1病毒,其抑制病毒引起细胞融合特征性病变(SI)的结果见下表。
表:生物提取液原液制剂抗HIV-1引起CEM细胞融合病变(SI)作用
注:SI标准为:“+”为细胞鼢数>3个;“±”为细胞融合数在1-3个;“-”无细胞融合。
3.4本发明生物提取液对HIV-1病毒在CEM细胞内P24抗原表达量的影响
生物提取液原液制剂对HIV-1活病毒在CEM细胞内复制能力有抑制作用,结果见下表。
表:生物提取液原液制剂对HIV-1病毒在CEM细胞内复制能力检测结果(P24抗原量的测定)
结论1.本发明生物提取液原液制剂对HIV-1RT活性有抑制作用,半数抑制浓度为原液的0.017倍。
2.生物提取液原液制剂在我们的检测系统中可抑制HIV-1病毒引起细胞融合特征性病变(SI),对HIV-1活病毒在CEM细胞内P24抗原表达量的半数抑制浓度为原液的1∶833倍稀释(即原液的0.0012倍)。
毒理安全性研究结果表明:通过本发明对实验动物进行的皮肤、阴道粘膜的毒性和刺激性试验研究,免疫毒性试验研究以及长期毒性试验研究结果表明,该药物无毒副作用、无刺激性、无过敏反应,使用安全可靠。
皮肤刺激试验
1.0规察实验动物完整和破损皮肤接触受试物后所产生的局部刺激作用及其恢复情况。
2.0试验材料:
2.1供试品:本发明原液制剂,每ml含有效成份0.04g,皮肤外用。
2.2实验动物:白色家兔,体重2-2.5kg,由昆明医学院实验动物中心提供。
3.0实验方法:
3.1本实验设三个剂量组,即对照组(生串盐水);低剂量组(有效成份0.04g/ml为临床用剂型);声剂量组(有效成份0.08g/ml;为临床用剂型2倍)
3.2选用健康的白色家免12只,体重2-2.5kg,雌,雄各半。分为三组,每组4只,2只完好皮肤试验,2只为破损皮尽试验。涤药前24小时剪去动物背部被毛,面积约12.5×10.0cm,检查去毛皮肤无损伤即可开始试验。
每只动物分别涂2.0ml供试药品,涂药后,放入固定笼内,每笼1只,6小时用用温水将药物洗净,每天肉眼观察涂药皮肤局部有无红斑,水肿等刺激反应,每天涂药一次,连续一周。停药后再继续观察7天,观寒皮肤刺激反应。并按下列表进行打分评价。
表:皮肤刺激性激性反应评分标准
表:皮肤刺激性程度评价标准
3.0结果:
对家兔皮肤刺激性反应强度
结果显示:试验动物涂抹溶剂和不同剂量的原液制剂一周,停药后连续观察7天,完好皮肤和破损皮肤均未发现有红斑、水肿、出血点、色素沉着等刺申反应,破损皮肤愈合完好,刺激反应平均分值为o。根据皮肤刺激强度评价标准,提示对家兔皮肤无刺激性作用。
皮肤急性毒性试验
1.0试验目的:
观察动物完整皮肤及破损皮肤短时期内大剂量接触受试物所产生的毒性反应。
2.0试验材料:
2.1供试品:本发明原液制剂,每ml含有效成份0.04g,皮肤外用。由昆明云大科期创生物工程有限公司提供,批号,ZYK-001
2:2实验动物:白色家兔,体重2.0-2.5ks,由昆明医学院实验动物中心提供。
3.0试验方法:
3.1实验设三个剂量疽,即:
对照缉(生理盐水入)
低剂量组(有效成份0.04g/m):,为临床用剂型),
高剂量组(有效成份,0.08s/ml,为临床用剂型2倍),
3.2选用健康白色家免24只,体重2.48±0.52kg,分为三个剂量,每组8只,4只为完好皮肤试验组,4只为破损皮肤试验组。涂药前24小时剪去动物背部被毛,面积约12.5×10.0cm,检查去毛皮肤无损伤即可开始试验。见下表:
表:动物分组情况
对照组、低剂量组、高剂量量组动物各涂2。0ml受试药物,涂药后,放入固定笼内,单笼饲养。24小时后用温水将药物洗净。于1、24、48、72直至第7天连续观察动物的不良反应,每天记录动物皮肤的变化,并观察呼吸、中枢神经系统,四肢活动、食量及其它中毒表现,如有死亡应立即进行尸解和病理组织学观察。
实验结果:见下表
表:爽士洁康液皮肤急性毒性结果
结果评价:本研究室用原液制剂进行家兔皮肤急性毒性试验;结果显示:家兔经皮给予原液制剂液后,对照组和实验组7天观察中,家兔体重增长,为2.97土0.50kg食量正常,未观察到呼吸、中枢神经系统出现的不良反应,动物一般情况良好.涂药局部皮肤未见红斑,水肿,糜烂等刺激反应,破损皮肤于72小时后愈合较好,皮肤光滑。
提示:本发明原液制剂对家兔未产生经皮急性毒性作用。
阴道用药毒性及刺激性试验
实验材料
供试药品:本发明原液制剂主、每ml有效成份0.04g,皮肤外用
实验动物:SD雌性大鼠36只,体重230g±9g
实验方法:实验设三个剂量纽,即:对照组(生理熬水);低剂量组(有效成份0.04g/ml,为临床用剂型);高剂量组(有效成份0.08g/ml,为临床用剂型2倍)。
剂量分组及给药方法:将36只动物随机分为3组,每组12只。
空白对照组:用约0.3ml无菌蒸馏水将自制消毒小棉球完全浸湿后塞入大鼠阴道内,每天一次。
低剂量组:用原药液约0.3ml将自制消毒小棉球完全浸湿后塞入大鼠阴道内,每天一次。
高剂量组:用浓缩药液约0.3ml,将自制消毒小棉球完全浸湿后塞入大鼠阴道内,每天一次。
放入药物后使药物在阴道内至少保持4-6小时,如观察到有棉球漏出再补给药一次。
试验观察
一般情况观察:实验期间观察记录动物食欲、活动情况及体重变化和是否有全身中绝毒反应。
阴道局部观察:连续7大多次给药,给药后24、48小时直至第7天分三次处巧死动物,每次剖杀1/3动物,剖开阴道肉眼观察记录阴道粘膜刺激反应情况。将阴道组织置于10%福尔马林液中固定,进行病理组织学检查
结果与评价
一般情况观察:给药后各组动物一般情况良好,食欲正常,活动自如,观察至第7天均未发现任何不良反应。体重增长为280g±17g,
阴道粘膜肉眼观察:见下表
注:括号内的数字为动物只数;-表示肉眼观察未见刺激反应
本发明原液制剂对大鼠进行阴道用药局部刺激和毒性试验,结果显示:
1、动物给药后未出现不良反应,体重增长。2、大鼠阴道局部刺激肉眼观察发现所有试验动物阴道粘膜呈淡红色,表面光滑湿润,可见皱壁,未见水肿,红斑和糜烂等刺激反应。
病理组织学检查:镜下所见:阴道粘膜可见横行皱壁,鳞状上皮细胞形态,层次正常为4-7层,表面为未角化的复层扁子上皮,上皮下降层为致密的结缔组织,弹性纤维较多,肌层为疏松的平滑肌,每只动物阴道上皮可见不同的动情周期变化,所检标本均未见异常的病理组织学改变,各时段及各剂量组之间未见明显差异。
综上所述:提示本发明原液制剂阴道用药后来发生全身毒性反应。肉眼观察阴道粘膜未见刺激反应,病理组织上学检查也未见异常改变。
过敏性试验
试验材料:
供试品:本发明原液制剂,每ml含有效成份0.04g,皮肤外用。
试验动物,花白色豚鼠,体重275土2.5g
试验方法:
动物:选用健康的花白色豚鼠30只,雌,雄各半;分为三组,每组10只,涂药前24小时用推剪推去豚鼠背部两侧被毛,面积约3×3cm,检查去毛皮肤无损伤即可开始试验。
剂量设计
取供试品0.5ml涂在动物左侧脱毛区,每笼1只,持续6小时,每天肉眼观察涂药皮肤局部有无红斑,水肿等反应,第7天和第14天,以同样给药方法各重复一次,共计三次。空白对照组和阳性对照组试验方法同供试品一样。
豚鼠致敏接触一览表
激发接触:于未次给供试品致敏后14天,即试验第28天将供试品0.5ml涂于豚鼠动物背部右侧脱毛区,阳性对照0.1%2、4二硝基氯苯,6小时后去掉供试品,即刻观察,然后于24、48、72小时再次观察皮肤过敏反应情况,同时注意动物是否有哮喘、站立不稳或休克等严重的全身过敏反应。并按表2-3进行打分,计算过敏反应平均值。根据各组出现皮肤过敏或全身过敏反应的动物数计算致敏发生率。
表.皮肤过敏反应程度的评分标准
表:皮肤致敏评价标准
结果:见下表
豚鼠皮肤过敏反应观察结果
结果显示:本发明原液制剂对豚鼠皮肤进行致敏和激发接触后24、48和72小时未观察到豚鼠皮肤出现红斑、水肿、破溃等皮肤过敏反应和哮喘、休克等全身过敏反应.而阳性对照品2、4二硝基氯苯则有80%动物出现皮肤过敏反应,过敏反应平均分值3.3-5.0之间,提示本发明原液制剂无致敏作用。
本发明原液制剂毒性试验
1、试验目的:
本发明原液制剂为皮肤粘膜外用药。为观察用药后是否引起透皮吸收所致的全身毒性反应和皮肤粘膜的刺激性、过敏性。故对爽士洁康液进行了家兔皮肤给药皂性毒性试验,家兔皮肤刺激性试验,豚鼠皮肤过敏性试验和大鼠阴道粘膜用药毒性、刺激性试验和长期毒性试验。
2.供试晶:
原液制剂,有效成份含量0.04g/ml,0.08g/ml两种规格。山昆明云大科斯创生物工程有限公司提供,批号:ZYK-001。
3.试验动物:
白色家兔,合格证:云动管99002。豚鼠,合格证:滇实动证2002079。SD大鼠,合格证:滇实动证9803。由昆明医学院实验动物中心提供。
4.试验结果:
4.1家兔皮肤给药急性毒性试验结果显示:溶媒对照组,0.04g/ml低剂量组,0.08g/ml高剂量组家兔完整皮肤和破损皮肤动物食量正常,体重增长,未出现明显不良反应。提示:本发明原液制剂皮肤用药对家兔无急性毒性反应。
4.2家兔皮肤刺激性试验结果显示:溶媒对照组,0.04g/ml低剂量组,0.08g/ml高剂量组家兔完整皮肤和破损皮肤未见红斑、水肿、出血点和色素沉着等刺激反应,试验结束时,破损皮肤愈合完好,刺激反应平均分值为0。提示:本发明原液制剂对家兔皮肤无刺激性作用。
4.3豚鼠皮肤过敏性试验:用爽士洁康液和阳性对照品2.4-二硝基氯苯进行豚鼠皮肤致敏给药和激发给药观察。结果显示:爽士洁康液对豚鼠皮肤致敏和激发接触所24、48、72h未观察到皮肤红斑,水肿等皮肤过敏反应体征。而2,4-二硝基氯苯阳性对照组动物有80%的动物出现皮肤过敏反应,过敏反应平均分值在3.3-5.0之间,提示本发明原液制剂对豚鼠皮肤无致敏作用。
4.4人鼠阴道粘膜用药毒性及刺激性试验:溶媒对照组,0.04g/mf低剂量组,0.08g/ml高刮量组三个试验组,每组雌性大鼠12只,分别用自制消毒小棉球浸湿供试晶后塞入大鼠阴道内,至少保持4-6h,连续给药7天,于给药后24、48和第7天分别各处死4只动物,解剖阴道,肉眼观察阴道粘膜刺激反应情况后,置于10%福尔马林液中固定,进行病理组织学检查。结果显示:各组动物一般状况良好,未见明显异常,阴道粘膜表面光滑湿润,色泽淡红,可见皱壁。未见水肿、红斑、糜烂等刺激反应。阴道组织病理切片观察,各组动物阴道鳞状上皮细胞形态正常,上皮下为结缔组织,可见部份动物阴道粘膜为发情期表现,其余未见异常组织学改变,提示本发明原液制剂对大鼠粘膜无刺激作用。
4.5用安体爽康液0.08g/2ml/只,0.16g/2ml/只和高压灭菌水2ml/只进行家兔皮肤涂抹给药4周,停药恢复2周长期毒性试验。观察动物一般体征、给药局部皮肤、体重和进食量,并进行血液学、血清电解质、血清尘化学检查。解剖动物肉眼观察脏器、器官及病理组织学检查。结果显示:
1.给药期和恢复期各组动物进食;饮水正常;一般状态良好,活动自如,毛皮光泽,给药局部皮肤未见红斑、水肿等刺激反应。体重有增长,组间比较无显著性差异(P>0.05)。
2,给药木期血液学检查发现低剂量组红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)及红细胞比容(Hct)高于对照和高剂量组,有显著性差异(P<0.0I/0.05)。但无剂量反应关系。其余指标组间比较无显著性差异(P>0.05)。
3.给药木期血清尘化学检查发现低剂量组葡萄糖(GLU)高于对照组和高剂量组,有显著性差异(P<0.0I/0.01),但无剂量反应关系。其余指标组间比较无显著性差异(P>0.05)。
4.给药水期血清电解质检查,组间比较无显著性差异(P>0.05)。
5.给药木期和恢复期解剖动物肉眼可见各组动物主要脏器、器官表面光滑、色泽正常,未见充血,粘连等异常改变。脏器重量和脏器系数组间比较无显著性差异(P>0.05)。病理组织学检查发现对照、低、高剂罩组动物均有1~2例动物肺、肾、肝主要脏器镜下可见局灶性间质性肺炎、肾间质炎细胞浸润和肝门管区炎细胞浸润,病理改变程度组间无明显差异。
综上所述:长期大剂量经皮给予安体爽康液对试验动物未引起明显中毒反应和局部皮肤刺激反应。血液学及血清尘化学所测指标未见明显异常,病理组织学检查也未观察到与药物有关的病理组织学改变。在该试验条件卞提示本发明原液制剂临床用剂型有效成份4倍量(0.16g/ml)以下为基本无毒性反应剂量。
5.结论:
本发明原液制剂对家兔皮肤给药无急性毒性作用;对家兔皮肤无刺激性作用;对豚鼠皮肤无致敏性作用;对大鼠阴道粘膜无刺激性作用。长期大剂量经皮肤对试验动物未引起明显中毒反应和局部皮肤刺激反应。血液学及血清生化学所测指标未见明显异常,病理组织学检查也未观察到与药物有关的病理组织学改变。
在该试验条件下提示本发明原液制剂临床用剂型有效成份4倍量(0.16g/ml以下为基本无毒性反应剂量。
药效稳定性研究结果表明:在保质期内。A、理化性质、指纹图谱、“指标成份”稳定;B、药物抗菌效力稳定。稳定性详见附图2、图3和图4。稳定性检测结论见下表
Claims (1)
1.一种二次发酵法天然药物制剂的制备方法,特征在于:
(1)第一次发酵:
先将龙胆草、桑白皮、木贼和三七四种中药材原料分别制成发酵用培养液,并分别接种进行第一次发酵,在28~35℃温度下发酵3-7天,获得的发酵液经灭菌、过滤和冷冻处理、待用;
(2)第二次发酵:
将上述四种发酵液按1∶0.5-3∶0.5-3∶1比例混合,制成二次发酵用培养液,接种后进行第二次发酵,在28~35℃温度下发酵2-4天,中止发酵灭菌过滤、冷冻,即获得具有抗菌活性的中间代谢产物,待用;
上述第一次发酵和第二次发酵接种用菌种是灵芝菌的菌丝体;
(3)再经生化技术处理,并加入5-10%丙二醇稳定剂,制成原液制剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008100583688A CN101322746B (zh) | 2008-05-09 | 2008-05-09 | 二次发酵法天然药物制剂、制备方法及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008100583688A CN101322746B (zh) | 2008-05-09 | 2008-05-09 | 二次发酵法天然药物制剂、制备方法及用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101322746A CN101322746A (zh) | 2008-12-17 |
CN101322746B true CN101322746B (zh) | 2011-07-27 |
Family
ID=40186547
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008100583688A Active CN101322746B (zh) | 2008-05-09 | 2008-05-09 | 二次发酵法天然药物制剂、制备方法及用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101322746B (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102978024B (zh) * | 2012-12-14 | 2014-03-12 | 柳州两面针股份有限公司 | 防霉抑菌中药洗涤剂 |
CN103493681A (zh) * | 2013-09-24 | 2014-01-08 | 成都信息工程学院 | 一种利用三七渣混菌发酵生产药性菌质的方法 |
CN104782675B (zh) * | 2015-03-18 | 2017-11-21 | 云南明侍达生物科技有限责任公司 | 新型植物病害抗生剂及其制备方法 |
CN104825830B (zh) * | 2015-03-18 | 2018-06-05 | 云南明侍达生物科技有限责任公司 | 一种呼吸系统抗生液及其制备方法 |
CN106579376B (zh) * | 2016-11-30 | 2020-09-08 | 山东瑞芝生物科技股份有限公司 | 一种半固体灵芝发酵菌粉的配方及二次发酵全自动生产工艺 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1711885A (zh) * | 2004-06-24 | 2005-12-28 | 王冬 | 无公害复合菌丝体活性饲料及其制备方法 |
-
2008
- 2008-05-09 CN CN2008100583688A patent/CN101322746B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1711885A (zh) * | 2004-06-24 | 2005-12-28 | 王冬 | 无公害复合菌丝体活性饲料及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101322746A (zh) | 2008-12-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101796423B1 (ko) | 질염을 일으키는 특정 바이러스와 감염균을 억제시킬 수 있는 항바이러스 및 항균 조성물과 이를 포함하는 여성청결제 조성물 제조방법 | |
CN1883275B (zh) | 一种植物抗生素及其应用 | |
KR101864409B1 (ko) | 한방 추출물 및 미생물 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 항균, 살균 또는 항진균용 조성물 | |
CN105112177A (zh) | 抗微生物可发泡皂 | |
CN101322746B (zh) | 二次发酵法天然药物制剂、制备方法及用途 | |
CN102178862A (zh) | 香连消毒液的制备及质量检测方法 | |
CN108904376A (zh) | 一种具有控油祛痘功效的化妆品用中药复方发酵液及其制备与应用 | |
CN104367907A (zh) | 一种中草药羊蜱抗虫剂及其制备与使用方法 | |
CN101890030A (zh) | 抗菌、抗病毒、抗氧化及抗色素沉积的组合物 | |
US20220047494A1 (en) | Antibacterial, deodorization, easing of acne and atopy or skin calming-functional composition for y-zone cleanliness containing quercus acutissima sap and zinc ricinoleate | |
CN108853358A (zh) | 一种抗菌中药组合物及其制备方法和用途 | |
CN113430148A (zh) | 一种动物双歧杆菌的发酵培养基及其应用 | |
CN103783089A (zh) | 一种用于餐具及厨具消毒的复方中草药消毒剂 | |
Sabarinath et al. | Phytochemical and Antibacterial screening on leaves of Solanum torvum | |
CN106581320A (zh) | 植物提取物的制备方法、含植物提取物的妇用制剂 | |
Husni et al. | The effect of ethanol extract of moringa leaf (moringa oleifera lam) against the activity and capacity of phagocytosis of macrofag cells and the percentage of leukosit cells of white mice | |
CN100558357C (zh) | 治疗混合感染性疾病的药物组合物 | |
CN103272134A (zh) | 一种杀灭抗酸染色阳性(红色)杆菌的药物 | |
CN106880698A (zh) | 一种用于治疗幼儿性阴道炎的植物精油及制备方法 | |
US11666621B2 (en) | Composition having inhibitory effect on virus and bacteria | |
CN113462610A (zh) | 动物双歧杆菌发酵滤液、制备方法及其应用 | |
CN104212723B (zh) | 一株牡蒿内生尤韦可拟盘多毛孢及其应用 | |
CN109939038A (zh) | 一种天然抑菌消炎的沐浴液及其制备方法 | |
CN109091521A (zh) | 一种中药洗消制剂及其制备方法 | |
CN107050061A (zh) | 抑制白色念珠菌生长的组合物及其制备方法与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20081217 Assignee: Yunnan Ming Shida biotechnology Co., Ltd Assignor: Zhou Yingkui Contract record no.: 2013530000034 Denomination of invention: Secondary fermentation method natural medicinal preparation, preparation and use Granted publication date: 20110727 License type: Exclusive License Record date: 20130424 |
|
LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model |