CN103255061A - 灰黄青霉、由其产生的抗菌活性化合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)CPCC400528,其保藏号为CGMCC NO.5752,由其发酵制备产生的抗菌活性化合物,其分子式为C7H6O4,结构如式(I)所示:
Description
技术领域
本发明属于微生物和制药领域,具体地说,涉及一株灰黄青霉、由其产生的抗菌活性化合物及应用。
背景技术
天然抗菌药物和合成抗菌药物等的出现使有效治疗各种细菌感染成为可能,为保障人类健康做出了卓越贡献。但随着抗生素的广泛应用,也出现了细菌耐药性逐年增加,致使一些抗生素疗效降低、甚至无效的情况。过去已获控制的一些传染性疾病(如结核病等)出现了再次流行的趋势;一些非致病菌成为条件致病菌,如变形杆菌、绿脓杆菌等;尤其是超级细菌的出现,更是让医学界担心“后抗菌药物时代”的到来。因此,迫切要求不断地研发新型抗菌药物。
在蛋白质的生物合成过程中,氨酰-tRNA合成酶起了至关重要的作用,它催化氨基酸与相应的tRNA合成氨酰-tRNA,是遗传信息通过蛋白质形式得以表达所必需的一个组分,是各类生物体生存所必不可少的一类酶。对于病原菌而言,一旦它的某种氨酰-tRNA合成酶受到抑制失去功能,就会导致其蛋白质的生物合成中断以及许多重要的生理过程受影响,病原菌的生长繁殖也就随之终止。因此,氨酰-tRNA合成酶适于作为新型抗菌药物的作用靶点。
苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)作为药物筛选的靶点具有其独特的优点。PheRS与其它氨酰-tRNA合成酶在结构以及催化特性方面的差异将有利于避免交叉耐药的问题。另外,PheRS在不同细菌中的序列比较保守,而且与真核生物的同种功能的蛋白之间不具有相关性,有利于筛选到对多种病原菌都有效的广谱抗生素,而且所筛选到的化合物对人体的毒性也会很小。
微生物及其代谢产物的多样性,为新抗菌药物的筛选提供了丰富来源。目前,已从青霉菌中发现了大量具有新颖化学结构和特异生理功能的化合物,其中许多具有良好的抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性,青霉菌通过人工条件发酵培养,可以提供稳定的天然产物来源。
发明内容
本发明的目的是提供一株灰黄青霉CPCC 400528。
本发明的另一目的是提供由灰黄青霉CPCC 400528产生的具有广谱抗菌作用的化合物及其应用。
为了实现本发明目的,本发明的灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)CPCC 400528,其分离自新疆喀纳斯湖畔的土壤样品中,现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏日期2012年2月13日,保藏号CGMCC NO.5752。
灰黄青霉CPCC 400528的菌落在察氏培养基(CA)上25℃培养7天,产生大量的放射状皱纹,中心有脐状突起;质地通常绒状,带轻微絮状;菌丝体,边缘通常呈现白色,而中部面上往往呈现淡灰黄色;分生孢子结构大量产生,分生孢子梗发生在孢梗束和束丝之中,帚状分枝比较复杂,多是四轮生,少三轮生,叉开,分枝点通常2-3或更多,分生孢子呈现宽椭圆形,分生孢子链呈现较紧密而叉开的近圆柱状。
本发明还提供由灰黄青霉CPCC 400528发酵产生的抗菌活性化合物--异棒曲霉素,其分子式为C7H6O4,结构如式(I’)所示:
其中1~7为碳原子的编号,该抗菌活性化合物为无色油状物,易溶于甲醇、水等溶剂中。
本发明还提供上述抗菌活性化合物的制备方法,包括步骤:
1)将活化后的灰黄青霉CPCC 400528接种到发酵培养基中进行发酵培养;2)发酵结束后,用体积比为17∶3的乙酸乙酯-甲醇作为萃取剂萃取发酵液(萃取至少1次),过滤,滤液经真空浓缩,得到褐色浸膏;3)以水溶解步骤2)中得到的褐色浸膏,然后用乙酸乙酯浸提,并用RP-18反相硅胶柱分离浸提液,以甲醇的水溶液进行洗脱,收集洗脱液,浓缩后用正相硅胶柱分离,以氯仿和甲醇的混合液进行梯度洗脱,当氯仿-甲醇体积比为20∶1时,即得目标化合物。
在步骤1)中,发酵培养的温度为25~28℃,培养时间为3~7d。
在步骤2)中,萃取时间为12~24h,真空浓缩的温度为40~45℃。
对所得化合物进行荧光检测,荧光显暗黑色,碘显色,硫酸显淡黄色,用氯仿-甲醇(体积比6∶1)溶剂体系展开Rf值为0.62。
本发明还提供上述制备的抗菌活性化合物在制备广谱抗菌药物中的应用。
本发明所涉及的活性化合物具有广谱抗菌效果,特别是抗G+和G-菌效果显著;化合物在0-128μg/ml浓度范围内能够有效抑制:(1)金黄色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的标准菌株以及它们的耐药株;(2)结核分枝杆菌等G+菌;(3)大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌标准菌株和它们的耐药株;(4)阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、摩根摩根氏菌、雷极普鲁菲登杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、伤寒沙门菌、弗劳地枸橼酸菌标准菌株等G-菌的生长。抗菌机制为:对细菌生长所必需的PheRS酶具有抑制活性,并呈现一定的量效关系。
本发明进一步提供含有上述抗菌活性化合物的广谱抗菌药物。优选地,所述广谱抗菌药物为抗金黄色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、结核分枝杆菌的药物;所述广谱抗菌药物为抗耐药的金黄色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的药物;所述广谱抗菌药物为抗大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、摩根摩根氏菌、雷极普鲁菲登杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、伤寒沙门菌、弗劳地枸橼酸菌的药物;所述广谱抗菌药物为抗耐药的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的药物。
本发明首次从灰黄青霉菌CPCC 400528发酵提取物中分离具有抗菌活性的化合物。具有灰黄青霉菌株易于发酵培养,由其制备的化合物工艺过程简单易控,化合物产量高,制备的化合物抗菌活性明显等特点,为抗菌新药的研发奠定了基础,具有十分广阔的市场前景。
附图说明
图1为由本发明灰黄青霉菌CPCC 400528发酵产生的活性化合物的制备流程图。
图2为本发明活性化合物的1H-NMR(600MHz)谱图。
图3为本发明活性化合物的1C-NMR(125MHz)谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
实施例1灰黄青霉菌CPCC 400528的发酵及抗菌活性化合物的制备
本发明的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)CPCC 400528分离自新疆喀纳斯湖畔的土壤样品中,现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号CGMCC NO.5752。
A.培养基配方:(斜面培养基配方)
B.发酵培养基配方:
发酵工艺:斜面培养:按上述斜面培养基配方配制培养基,分装试管,121℃灭菌30min后,制斜面。将保存的灰黄青霉CPCC 400528菌种转接至斜面培养基上,28℃下培养5d。挑取菌丝块接种于液体发酵培养基中,28℃下培养2d,即为种子培养物。
将60ml种子培养物接种到装有1000ml的发酵培养基中,28℃振荡培养4d。
抗菌活性化合物(异棒曲霉素)的提取:发酵结束后,将液体发酵液用乙酸乙酯∶甲醇(v∶v)=17∶3的溶液体系萃取3次,每次24h,浸提液用棉花过滤,真空浓缩得到浸膏。
异棒曲霉素的分离精制:上述褐色浸膏以水溶解,等体积乙酸乙酯浸提,RP-18反相硅胶柱分离,以甲醇和水洗脱,收集5%甲醇洗脱的组分,浓缩后用正相硅胶柱层析分离,氯仿-甲醇梯度洗脱,收集组分,当氯仿∶甲醇(v∶v)=20∶1时,得到目标化合物--异棒曲霉素,其为无色油状物,分子式为C7H6O4,结构如式(I)所示:
该抗菌活性化合物易溶于甲醇、水等溶剂中。
对所得化合物进行荧光检测,荧光显暗黑色,碘显色,硫酸显淡黄色,用氯仿-甲醇(体积比6∶1)溶剂体系展开Rf值为0.62。
波谱数据:1H NMR(600MHz,cd3od)δ5.99-5.94(m,2H),5.90(s,1H),4.58(dd,J=17.3,2.5Hz,2H),4.31(dd,J=17.2,3.6Hz,2H),3.27-3.23(m,1H).13C NMR(151MHz,cd3od)δ170.79,153.45,147.83,110.99,109.64,89.87,60.27。(图2和图3)
本发明灰黄青霉菌CPCC 400528发酵产生的活性化合物的制备流程如图1所示。
实施例2抗菌活性化合物(异棒曲霉素)的活性测试
I.化合物抗菌活性测试:用琼脂稀释法测定实施例1中制备的活性化合物的体外抗菌活性。
1、待测菌株:
如表1所示的G+菌金黄色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的标准菌株以及它们的耐药株;结核分枝杆菌以及G-菌大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌标准菌株和它们的耐药株、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、摩根摩根氏菌、雷极普鲁菲登杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、伤寒沙门菌和弗劳地枸橼酸菌标准菌株。
2、待测样品和培养基的制备:
(1)培养基使用Mueller-Hinton(MH)或7H11琼脂培养基,按本领域常规方法进行配制,pH7.2~7.4。
(2)检定菌株的培养:检定菌株于37℃过夜培养或生长至OD600为1.5~2.0。
(3)含药平板的制备:以实施例1制得的化合物为样品,以抗菌药利福平为对照品,将不同浓度(μg/ml)的样品及对照品分别加入MH琼脂或7H11琼脂培养基中(45~50℃),充分混匀后倾倒各灭菌平皿。
(4)接种物制备与接种:制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液,再1∶10稀释,以多点接种器吸取制备好的菌液(约1~2μl)接种于各琼脂平板表面,每点菌数约为104CFU,形成直径为5~8mm的菌斑。接种后置37℃孵育16~48小时,对于结核分枝杆菌,接种后需置37℃孵育3-4周。
(5)结果判断:与生长对照比较,将平板上完全抑制细菌生长的最低药物浓度作为MIC。结果如表1所示。
表1化合物样品及对照药左氧氟沙星的体外抗菌作用(MIC:μg/ml)
II.PheRS酶活抑制检测
1、PheRS酶活测定体系:
2、样品制备
化合物样品:将实施例1中制备的化合物溶解在DMSO中,浓度为2mM,作为混合物样品溶液。
3、样品活性检测
分别向反应体系中添加各组分:
A.阴性对照组(化合物):向PheRS酶活测定体系中加入1μlDMSO溶剂,反应体系的总体积为100μl。
B.阳性对照组:按照上述PheRS酶活测定体系,配制不含PheRS的PheRS酶活测定体系,反应体系的总体积为100μl。
C.样品实验组(化合物):取1μl化合物样品溶液加入到PheRS酶活测定体系中,使化合物的终浓度为20μM,反应体系的总体积为100μl;
将上述各反应组的反应体系分别混匀后加入同一块96孔板中(每孔反应体系总体积为100μl),置于PerkinElmer公司的EnVision酶标仪内,开启温控为37℃进行反应。以反应起始时间为0时刻,每隔2分钟检测一次各孔反应体系在340nm波长处的吸光值OD340,连续检测50min(25次)。
4、结果分析:
分别计算各孔的ΔOD340/min,再按照以下公式计算各孔的抑制率:
其中:
ΔN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量;
ΔP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量;
ΔS是样品实验孔平均每分钟吸光值的变化量。
结果如表2所示,本发明的活性化合物对细菌PheRS酶的活性具有一定的抑制作用,并呈现出一定的量效关系。
表2不同浓度的本发明的活性化合物对细菌PheRS的酶活性抑制情况
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)CPCC 400528,其保藏号为CGMCC NO.5752。
3.权利要求2所述抗菌活性化合物的制备方法,其特征在于,包括步骤:
1)将活化后的灰黄青霉CPCC 400528接种到发酵培养基中进行发酵培养;
2)用乙酸乙酯-甲醇体积比为17∶3作为萃取剂萃取步骤1)所得的发酵液,过滤,滤液经真空浓缩,得到褐色浸膏;
3)以水溶解步骤2)中得到的褐色浸膏,然后用乙酸乙酯浸提,并用RP-18反相硅胶柱分离浸提液,以甲醇的水溶液进行洗脱,收集洗脱液,浓缩后用正相硅胶柱分离,以氯仿和甲醇的混合液进行梯度洗脱,当氯仿∶甲醇体积比为20∶1时,即得目标化合物。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤1)中发酵培养的温度为25~28℃,培养时间为3~7d;步骤2)中萃取时间为12~24h,真空浓缩的温度为40~45℃。
5.权利要求2所述的抗菌活性化合物在制备广谱抗菌药物中的应用。
6.含有权利要求2所述抗菌活性化合物的广谱抗菌药物。
7.根据权利要求6所述的广谱抗菌药物,其为抗金黄色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、结核分枝杆菌的药物。
8.根据权利要求6所述的广谱抗菌药物,其为抗耐药的金黄色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的药物。
9.根据权利要求6所述的广谱抗菌药物,其为抗大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、摩根摩根氏菌、雷极普鲁菲登杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、伤寒沙门菌、弗劳地枸橼酸菌的药物。
10.根据权利要求6所述的广谱抗菌药物,其为抗耐药的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的药物。
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