CN107739740A - 一种海洋真菌来源的Lasiodiplodins化合物的制备方法及应用 - Google Patents

一种海洋真菌来源的Lasiodiplodins化合物的制备方法及应用 Download PDF

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刘岚
闫素君
张柳红
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曾昆姣
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
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Abstract

本发明属于药物化学的技术领域，具体涉及一种海洋真菌来源Lasiodiplodins化合物的制备方法和应用。所述的Lasiodiplodins化合物的结构式如式（Ӏ）所示。该化合物具有抗菌的作用，可用于制备抗菌药物。本发明所述的Lasiodiplodins化合物是从一种海洋真菌Lasiodiplodia sp.307的发酵产物中分离提取得到，该提取获得方法简单，使得Lasiodiplodins化合物来源丰富，成本低廉。（Ӏ）。

Description

一种海洋真菌来源的Lasiodiplodins化合物的制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及药物化合物的技术领域，更具体地，涉及一种海洋真菌来源的Lasiodiplodins化合物的制备方法及应用。
背景技术
Lasiodiplodins化合物的结构式如式（Ӏ）所示：
（Ӏ）
现有技术中Lasiodiplodins化合物的有机合成方法复杂、合成成本比较高，限制了人们对Lasiodiplodins化合物的深入研究和应用开发。因此，关于Lasiodiplodins化合物的功能方面的研究鲜有报道。
海洋真菌来源广泛，药物筛选获得率高，与其它海洋生物相比，最大的优势就是对环境友好，具有可持续性发展的特征。海洋真菌在特殊环境之中，已发展出独特的代谢方式，能够产生结构新颖、生理活性显著的各类次级代谢产物。其代谢产物具有抗菌、抗肿瘤、免疫调节、酶抑制等多种药用价值。目前，从包括海洋真菌在内的海洋微生物中寻找新的药源已成为国际国内研究的热点。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术所述的缺陷，提供一种Lasiodiplodins化合物的制备方法，具体为从海洋真菌Lasiodiplodia sp. 307的发酵产物中分离得到所述化合物。另外，发明人通过研究发现，所述Lasiodiplodins化合物对金黄色葡萄球菌均表现表现较好的抗菌活性，可应用于制备抗菌药物。
因此，本发明的另一个目的是提供上述Lasiodiplodins化合物的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种Lasiodiplodins化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1. 将海洋真菌Lasiodiplodia sp. 307菌株接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；
S2. 将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养得到发酵物；
S3. 将发酵物用甲醇浸泡提取，甲醇提取液浓缩后经氯仿萃取、浓缩，得到浸膏，再经层析分离，得到式（Ӏ）化合物；
所述海洋真菌Lasiodiplodia sp. 307菌株已在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址是中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，保藏日期是2017年08月01日，保藏号是GDMCC No: 60216；
其中，所述Lasiodiplodins化合物的结构式如式（Ӏ）所示：
（Ӏ）。
本发明所述海洋真菌Lasiodiplodia sp. 307菌株的来源为采自广东省湛江红树林自然保护区苦郎树（Clerodendrum inerme）的茎，所述海洋真菌的分类命名是：Lasiodiplodia sp.。
进一步地，步骤S1中，所述种子培养基为马铃薯葡萄糖水培养基。优选地，所述马铃薯葡萄糖水培养基的组分为：葡萄糖18~22 g、马铃薯290~310 g（从中提取浸出粉）、水0.95~1.05 L。
更优选为，葡萄糖20 g、马铃薯300 g（从中提取浸出粉）、水1 L。
进一步地，步骤S1中，所述摇床培养的条件是：25~28℃下，摇床转速150~200 rpm，培养时间为25~35天。优选为28℃下，摇床转速150 rpm，培养时间为4天。
进一步地，步骤S2中，所述发酵培养基为大米培养基。优选地，所述大米培养基的组分为：大米45~55 g、水80~110 mL。更优选为：大米50 g、水100 mL。
进一步地，步骤S2中，所述静置培养的条件是：25~28 ℃下，培养时间为25~35天。优选为：28℃下，培养时间为28天。
进一步地，步骤S3中，所述甲醇的用量为与发酵物等体积；氯仿用量为甲醇用量的1/3；所述浸膏用硅胶柱进行层析分离，硅胶柱进行层析分离时分别用10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱。
更进一步地，还将8:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱部分用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行洗脱。
所述硅胶柱为本领域所用到的常规硅胶柱，硅胶柱的目数为100~200目。
上述制备方法所获得的Lasiodiplodins化合物具有抗菌活性，可用于制备抗菌药物。
所述抗菌为抗金黄色葡萄球菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种从海洋真菌Lasiodiplodia sp. 307中获取Lasiodiplodins化合物的方法，该获取方法简单，使得Lasiodiplodins化合物来源丰富，降低获取成本。
附图说明
图1为本发明实施例1所述Lasiodiplodins化合物的核磁共振氢谱。
图2为本发明实施例1所述Lasiodiplodins化合物的核磁共振碳谱。
图3为本发明实施例1所述Lasiodiplodins化合物的ESIMS质谱。
具体实施方式
下面结合具体说明书附图和实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
实施例1 化合物的提取与表征
化合物的具体制备步骤如下：
S1. 配制种子培养基，种子培养基为马铃薯葡萄糖水培养基，具体组分为：葡萄糖20g，马铃薯300 g（从中提取浸出粉），蒸馏水1 L；然后将海洋真菌Lasiodiplodia sp. 307菌株接入种子培养基，在28℃下，摇床转速150 rpm，摇床培养4天，得到种子培养液。
S2. 配制发酵培养基，发酵培养基为大米培养基，组分为：大米50 g，水100 mL；然后将步骤S1得到的种子培养液接入发酵培养基中，在28℃下，静置培养28天，得到发酵物。
S3. 将步骤S2得到的发酵物用甲醇浸泡提取，甲醇的用量为与发酵物等体积；甲醇提取液浓缩后经氯仿萃取、浓缩，得到浸膏，氯仿用量为甲醇用量的1/3，获得的浸膏再经硅胶柱（100~200目）层析分离，硅胶柱进行层析分离时分别用10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，然后将8:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱部分用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱液经多次重结晶，得到白色固体。
表征
对该白色固体进行核磁共振检测，所得谱图如图 1~3所示，经分析检测，该化合物结构的理化性质数据如下：
ESIMS m/z 277 [M - H]-。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δH: 12.12 (s, 1H), 6.29(d, J = 2.5 Hz, 1H),6.24(d, J = 2.5 Hz,1H), 5.14 (m, 1H), 3.25(m, 1H), 2.47(m, 1H), 1.90(m, 1H),1.76(m, 1H), 1.56-1.64(m, 2H), 1.60(m, 1H), 1.50-1.62(m, 2H), 1.49(m, 2H),1.42(m, 2H), 1.42(m, 1H), 1.36(d, J = 6.2 Hz, 3H)。
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δC: 172.1 (C), 165.2(C), 160.3(C), 149.6(C),111.1(CH), 105.5(C), 101.5 (CH), 75.4 (CH), 33.6 (CH2), 31.1(CH2), 30.9(CH2),27.3(CH2), 24.8(CH2), 24.2(CH2), 21.2(CH2), 20.2(CH3)。
从质谱和核磁共振的结果分析可确定化合物的分子式为C16H22O4，其结构式如下：
。
实施例2 化合物的抗菌活性测试
实验菌株：
选取大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、鲍曼不动杆菌ATCC19606和金黄色葡萄球菌ATCC29213等4种ATCC标准菌株作为实验对象。
配制水解酪蛋白培养液（MH培养基）：
将水解酪蛋白肉汤MUELLER-HINTON BROTH（OXOID,CM0405）21g溶解于1 L双蒸水中，121℃高压灭菌15 min。
操作步骤：
S1. 用生理盐水配制菌悬液，菌悬液的浓度为0.5麦氏浊度，用MH培养液1:100稀释，使其菌含量为1.5×106 cfu/mL，于96孔板中每孔接种50 μl。
S2. 配制不同检测浓度的Lasiodiplodins化合物，首先用DMSO将化合物溶解成储存浓度为2000 μg/mL的化合物溶液，再用MH培养基使用微量二倍稀释法配制成检测浓度0.5~16 μg/mL的化合物溶液，向加有受试菌菌悬液的96孔板中，每孔加入该化合物溶液50μl，阳性对照为不加化合物的受试菌，阴性对照为MH培养基，在37℃下，培养16~20 h。
S3. 抑菌效果的判断与检测：
1）肉眼判断：肉眼观察标准为肉眼所见条件下，若96孔板中液体澄清，则说明无细菌生长，可判断为化合物在该浓度下对该受试菌有抑菌效果。能抑制细菌生长的最低浓度为该化合物的最小抑菌浓度（MIC值）。
2）同时使用多功能酶标仪，在595 nm波长处测定每孔液体的吸光度（OD值），用计算其生长抑制率作为抗菌活性的辅助判定数据，若其OD值与阴性对照接近或一致，也判断为该化合物有抑菌效果。
根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI）规定的标准，每次实验重复2次。
抗菌活性结果：
Lasiodiplodins化合物对该四种标准株的抑菌活性实验结果如表1所示：
表1
从表1结果可知，Lasiodiplodins化合物在8 μg/mL和16 μg/mL的浓度下对金黄色葡萄球菌ATCC29213有良好的抑菌效果，且其最小抑菌浓度为8 μg/mL。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种Lasiodiplodins化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将海洋真菌Lasiodiplodia sp. 307菌株接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；
S2. 将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养得到发酵物；
S3. 将发酵物用甲醇浸泡提取，甲醇提取液浓缩后经氯仿萃取、浓缩，得到浸膏，再经层析分离，得到式（Ӏ）化合物；
所述海洋真菌Lasiodiplodia sp. 307菌株已在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期是2017年08月01日，保藏号是GDMCC No: 60216；
其中，所述Lasiodiplodins化合物的结构式如式（Ӏ）所示：
（Ӏ）。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述种子培养基为马铃薯葡萄糖水培养基。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述摇床培养的条件是：25~28℃下，摇床转速150~200 rpm，培养时间为25~35天。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述发酵培养基为大米培养基。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述静置培养的条件是：25~28℃下，培养时间为25~35天。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述甲醇的用量为与发酵物等体积；氯仿用量为甲醇用量的1/3；所述浸膏用硅胶柱进行层析分离，硅胶柱进行层析分离时分别用10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还将8:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱部分用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行洗脱。
8.权利要求1~7任一项所述制备方法所获得的Lasiodiplodins化合物在制备抗菌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌为抗金黄色葡萄球菌。
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