CN116003318A - 一种喹啉酮类生物碱化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种喹啉酮类生物碱化合物及其制备方法与应用。本发明从海菖蒲来源的真菌Aspergillus alabamensis SYSU‑6778的发酵产物中提取分离、纯化得到一系列喹啉酮类生物碱化合物;并且通过实验证明,所述喹啉酮类生物碱化合物对水产养殖中常见的致病菌均具有显著的抑制作用,可应用于水产养殖中作为新型抗菌药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地,涉及一种喹啉酮类生物碱化合物及其制备方法与应用。
背景技术
鱼、虾、蟹等水产品一直是人类重要的食物来源之一,其所富含的矿物质、蛋白质、脂质、人体必需脂肪酸以及维生素类等营养成分在人类饮食结构中占有十分重要的位置。但是,由于人类活动、环境恶化、工业化污染等,水产生物面临多种疾病,包括真菌、病毒和细菌感染。其中,细菌感染在鱼类养殖中十分常见,例如由柱状黄杆菌(flavobacteriumcolumnare)所引起的柱状菌病、爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)导致鲶鱼肠败血症、海豚链球菌(Streptococcus iniae)引起的链球菌病等,都会造成水产养殖业巨大的经济损失。
目前现有技术对水产生物细菌性疾病的控制主要是使用抗菌药物和疫苗。但是疫苗研发时间长、制备成本高,一般来说一种疫苗仅能针对特定的某种生物某种病菌,极大地限制了其应用。而对于抗菌药物研发则较多,如中国专利申请CN108863749A公开了一种降二萜化合物,该化合物从海洋真菌温特曲霉的发酵产物中得到,对水产病害菌迟缓爱德华氏菌、哈氏弧菌、副溶血性弧菌都具有显著的抑菌活性。但是水产病害菌很容易对药物产生耐药性,因此,仍然需要提供更多新的抗菌药物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有水产病害菌容易对药物产生耐药性的缺陷和不足,提供一种具有显著抗菌作用的喹啉酮类生物碱化合物。
本发明的目的是提供一种海菖蒲来源的真菌。
本发明另一目的是提供所述喹啉酮类生物碱化合物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供所述喹啉酮类生物碱化合物的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种喹啉酮类生物碱化合物,所述喹啉酮类生物碱化合物具有以下任一结构:
另外的,本发明还要求保护一种海菖蒲来源的真菌,所述真菌为Aspergillusalabamensis真菌菌株SYSU-6778,保藏单位:广东省微生物菌种保藏中心,保藏日:2022年07月12日,保藏号:GDMCC No.62617。
并且,本发明还提供了所述喹啉酮类生物碱化合物的制备方法,具体包括以下步骤:
S1、真菌发酵培养:将所述真菌接种至种子培养基中,培养3~5天获得种子培养液;将种子培养液接种至大米培养基中,培养28~32天,得发酵物;
S2、提取分离:将步骤S1所得发酵物用甲醇浸泡,浓缩得到浸膏,浸膏用乙酸乙酯萃取(5次)完全,浓缩得萃取物,将所得萃取物用硅胶柱进行层析梯度洗脱分离,洗脱液为体积比(10~100):(90~0)的甲醇-水混合溶液,得到包含不同极性组分的洗脱液;
S3、液相色谱纯化:将步骤S2所得洗脱液用高效液相色谱进行纯化,其中,所述高效液相色谱的条件为:采用C18色谱柱,设置流速为2~6mL/min,以乙腈-乙酸水溶液为流动相,进行等度洗脱。
进一步地,步骤S1中,所述大米培养基中大米的添加量为0.9~1.2g/mL;优选地,按照每瓶45~50ml水、45~50g大米的比例进行配制大米培养基,高温灭菌后待用。
更近一步地,步骤S1中,所述种子培养基中的培养条件为:25~28℃,摇床培养,摇床转速100~150rpm。
进一步地,步骤S1中,所述大米培养基中的培养条件为:25~28℃,静置培养。
更进一步地,步骤S2中,所述梯度洗脱分离的洗脱液依次采用体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇-水混合溶液。
进一步地,步骤S2中,所述浓缩为减压浓缩。
优选地,步骤S2中,所述硅胶柱的目数为200~300目。
更进一步地,步骤S3中,所述用高效液相色谱进行纯化为体积比为70:30或60:40的甲醇-水混合溶液的洗脱液。
进一步地,步骤S3中,所述C18色谱柱为ACE-C18-PFP,10×250mm,5μm,12nm;或Ultimate XB-C18,20×250mm,5μm。
更近一步地,步骤S3中,所述乙酸水溶液的乙酸体积浓度为0.1~0.2%。
进一步地,步骤S3中,所述等度洗脱中乙腈与乙酸水溶液的体积比为(40~83):(17~60)。
具体的,对体积比为70:30甲醇-水混合溶液的洗脱液用高效液相色谱进行纯化,采用色谱条件:流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比60:40);流速:2mL/min,色谱柱:ACE-C18-PFP,10×250mm,5μm,12nm;得到化合物1。
对体积比为70:30甲醇-水混合溶液的洗脱液用高效液相色谱进行纯化,采用色谱条件:流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比83:17);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;于12.5min左右得到化合物2。
对体积比为70:30甲醇-水混合溶液的洗脱液用高效液相色谱进行纯化,采用色谱条件:流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比83:17);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;于13.2min左右得到化合物3。
对体积比为70:30甲醇-水混合溶液的洗脱液用高效液相色谱进行纯化,采用色谱条件:流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比83:17);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;于16.2min左右得到化合物4。
对体积比为70:30甲醇-水混合溶液的洗脱液用高效液相色谱进行纯化,采用色谱条件:流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比73:27);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;得到化合物5。
对体积比为60:40甲醇-水混合溶液的洗脱液用高效液相色谱进行纯化,采用色谱条件:流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比53:47);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;得到化合物6。
实验发现本所述喹啉酮类生物碱化合物具有显著的抗菌效果,因此,本发明还要求保护所述喹啉酮类生物碱化合物在制备抗菌药物中的应用。
进一步地,所述药物主要应用于抑制水产养殖中常见的致病菌。
优选地,所述致病菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、海豚链球菌(Sterptococcus iniae)、爱德华氏黄杆菌(Edwardsiella ictalurid)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)。
本发明具有以下有益效果:
本发明从海菖蒲来源的真菌Aspergillus alabamensis SYSU-6778的发酵产物中提取分离、纯化得到一系列喹啉酮类生物碱化合物;并且通过实验证明,所述喹啉酮类生物碱化合物对水产养殖中常见的致病菌均具有显著的抑制作用,可应用于水产养殖中作为新型抗菌药物。
附图说明
图1为本发明实施例1所得化合物1的核磁共振氢谱图。
图2为本发明实施例1所得化合物1的核磁共振碳谱图。
图3为本发明实施例1所得化合物1的HRESIMS质谱图。
图4为本发明实施例2所得化合物2的核磁共振氢谱图。
图5为本发明实施例2所得化合物2的核磁共振碳谱图。
图6为本发明实施例2所得化合物2的HRESIMS质谱图。
图7为本发明实施例3所得化合物3的核磁共振氢谱图。
图8为本发明实施例3所得化合物3的核磁共振碳谱图。
图9为本发明实施例3所得化合物3的HRESIMS质谱图。
图10为本发明实施例4所得化合物4的核磁共振氢谱图。
图11为本发明实施例4所得化合物4的核磁共振碳谱图。
图12为本发明实施例4所得化合物4的HRESIMS质谱图。
图13为本发明实施例5所得化合物5的核磁共振氢谱图。
图14为本发明实施例5所得化合物5的核磁共振碳谱图。
图15为本发明实施例5所得化合物5的HRESIMS质谱图。
图16为本发明实施例6所得化合物6的核磁共振氢谱图。
图17为本发明实施例6所得化合物6的核磁共振碳谱图。
图18为本发明实施例6所得化合物6的HRESIMS质谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明所采用的真菌SYSU-6778分离自海菖蒲,并经过鉴定,分类命名为Aspergillus alabamensis SYSU-6778,保藏在广东省微生物菌种保藏中心,保藏日期为2022年07月11日,保藏号为GDMCC No.62617。
其中,大米培养基的组成为大米45g/瓶,水50ml/瓶,高温灭菌备用。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1化合物1的提取和表征
1、化合物1的提取具体包括以下步骤:
S1、种子培养液的获得
S11、配制种子培养基:将PDB液体培养基(按照每升水中24g PDB培养基粉末进行配制)平均分配到4个1L锥形瓶内,经高温灭菌锅121℃(0.1MPa)条件下灭菌25min,之后冷却至室温,静置24小时,备用;
S12、种子的培养:将真菌SYSU-6778接入步骤S11制备的种子培养基,将接种后的锥形瓶放置在摇床上25℃恒温培养72小时,摇床转速100~150rpm,获得种子培养液;
S2、发酵培养:将大米培养基置于培养瓶混匀后密封,经121℃(0.1MPa)高温灭菌25min,冷却至室温放置2天;挑选瓶内培养基无染菌现象的进行接种,每瓶接种10mL步骤S12所得种子培养液,共接种150瓶,静置培养30天,得发酵物。
S3、提取分离:
将步骤S2所得发酵物用甲醇浸泡,减压浓缩得到粗浸膏;用乙酸乙酯萃取甲醇浓缩物五次并减压浓缩以获得萃取物;分别依次以不同体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇-水混合溶液,对萃取物采用硅胶柱进行层析梯度洗脱分离,分别得到包含不同极性组分的洗脱部分,然后采用高效液相色谱纯化;
其中,本实施例对体积比为70:30的甲醇-水混合溶液洗脱部分用高效液相色谱纯化,所述高效液相色谱的条件为:
流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比60:40);流速:2mL/min,色谱柱:ACE-C18-PFP,10×250mm,5μm,12nm;仪器Essentia LC-16。
分离得到化合物1,为淡黄色无定形固体。
2、化合物1的表征:
对所得淡黄色无定形固体进行核磁共振和质谱检测,谱图参见图1~3。从质谱和核磁共振的结果分析可确定化合物1的分子式为C27H26N2O5,其结构式如下:
实施例2化合物2的提取和表征
1、化合物2的提取具体包括以下步骤:
S1、种子培养液的获得
S11、配制种子培养基:将PDB液体培养基(按照每升水中24g PDB培养基粉末进行配制)平均分配到4个1L锥形瓶内,经高温灭菌锅121℃(0.1MPa)条件下灭菌25min,之后冷却至室温,静置24小时,备用;
S12、种子的培养:将真菌SYSU-6778接入步骤S11制备的种子培养基,将接种后的锥形瓶放置在摇床上25℃恒温培养72小时,摇床转速100~150rpm,获得种子培养液;
S2、发酵培养:将大米培养基置于培养瓶混匀后密封,经121℃(0.1MPa)高温灭菌25min,冷却至室温放置2天;挑选瓶内培养基无染菌现象的进行接种,每瓶接种10mL步骤S12所得种子培养液,共接种150瓶,静置培养30天,得发酵物。
S3、提取分离:
将步骤S2所得发酵物用甲醇浸泡,减压浓缩得到粗浸膏;用乙酸乙酯萃取甲醇浓缩物五次并减压浓缩以获得萃取物;分别依次以不同体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇-水混合溶液,对萃取物采用硅胶柱进行层析梯度洗脱分离,分别得到包含不同极性组分的洗脱部分,然后采用高效液相色谱纯化;
其中,本实施例对体积比为70:30的甲醇-水混合溶液洗脱部分用高效液相色谱纯化,所述高效液相色谱的条件为:
流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比83:17);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;仪器Essentia LC-16。
于12.5min处分离得到化合物2,为棕色无定形固体。
2、化合物2的表征:
对所得棕色无定形固体进行核磁共振和质谱检测,谱图参见图4~6。从质谱和核磁共振的结果分析可确定化合物2的分子式为C27H26N2O5,其结构式如下:
实施例3化合物3的提取和表征
1、化合物3的提取具体包括以下步骤:
S1、种子培养液的获得
S11、配制种子培养基:将PDB液体培养基(按照每升水中24g PDB培养基粉末进行配制)平均分配到4个1L锥形瓶内,经高温灭菌锅121℃(0.1MPa)条件下灭菌25min,之后冷却至室温,静置24小时,备用;
S12、种子的培养:将真菌SYSU-6778接入步骤S11制备的种子培养基,将接种后的锥形瓶放置在摇床上25℃恒温培养72小时,摇床转速100~150rpm,获得种子培养液;
S2、发酵培养:将大米培养基置于培养瓶混匀后密封,经121℃(0.1MPa)高温灭菌25min,冷却至室温放置2天;挑选瓶内培养基无染菌现象的进行接种,每瓶接种10mL步骤S12所得种子培养液,共接种150瓶,静置培养30天,得发酵物。
S3、提取分离:
将步骤S2所得发酵物用甲醇浸泡,减压浓缩得到粗浸膏;用乙酸乙酯萃取甲醇浓缩物五次并减压浓缩以获得萃取物;分别依次以不同体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇-水混合溶液,对萃取物采用硅胶柱进行层析梯度洗脱分离,分别得到包含不同极性组分的洗脱部分,然后采用高效液相色谱纯化;
其中,本实施例对体积比为70:30的甲醇-水混合溶液洗脱部分用高效液相色谱纯化,所述高效液相色谱的条件为:
流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比83:17);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;仪器Essentia LC-16。
于13.2min处分离得到化合物3,为棕色无定形固体。
2、化合物3的表征:
对所得棕色无定形固体进行核磁共振和质谱检测,谱图参见图7~9。从质谱和核磁共振的结果分析可确定化合物3的分子式为C27H25ClN2O5,其结构式如下:
实施例4化合物4的提取和表征
1、化合物4的提取具体包括以下步骤:
S1、种子培养液的获得
S11、配制种子培养基:将PDB液体培养基(按照每升水中24g PDB培养基粉末进行配制)平均分配到4个1L锥形瓶内,经高温灭菌锅121℃(0.1MPa)条件下灭菌25min,之后冷却至室温,静置24小时,备用;
S12、种子的培养:将真菌SYSU-6778接入步骤S11制备的种子培养基,将接种后的锥形瓶放置在摇床上25℃恒温培养72小时,摇床转速100~150rpm,获得种子培养液;
S2、发酵培养:将大米培养基置于培养瓶混匀后密封,经121℃(0.1MPa)高温灭菌25min,冷却至室温放置2天;挑选瓶内培养基无染菌现象的进行接种,每瓶接种10mL步骤S12所得种子培养液,共接种150瓶,静置培养30天,得发酵物。
S3、提取分离:
将步骤S2所得发酵物用甲醇浸泡,减压浓缩得到粗浸膏;用乙酸乙酯萃取甲醇浓缩物五次并减压浓缩以获得萃取物;分别依次以不同体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇-水混合溶液,对萃取物采用硅胶柱进行层析梯度洗脱分离,分别得到包含不同极性组分的洗脱部分,然后采用高效液相色谱纯化;
其中,本实施例对体积比为70:30的甲醇-水混合溶液洗脱部分用高效液相色谱纯化,所述高效液相色谱的条件为:
流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比83:17);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;仪器Essentia LC-16。
于16.2min处分离得到化合物4,为棕色无定形固体。
2、化合物4的表征:
对所得棕色无定形固体进行核磁共振和质谱检测,谱图参见图10~12。从质谱和核磁共振的结果分析可确定化合物4的分子式为C27H25ClN2O5,其结构式如下:
实施例5化合物5的提取和表征
1、化合物5的提取具体包括以下步骤:
S1、种子培养液的获得
S11、配制种子培养基:将PDB液体培养基(按照每升水中24g PDB培养基粉末进行配制)平均分配到4个1L锥形瓶内,经高温灭菌锅121℃(0.1MPa)条件下灭菌25min,之后冷却至室温,静置24小时,备用;
S12、种子的培养:将真菌SYSU-6778接入步骤S11制备的种子培养基,将接种后的锥形瓶放置在摇床上25℃恒温培养72小时,摇床转速100~150rpm,获得种子培养液;
S2、发酵培养:将大米培养基置于培养瓶混匀后密封,经121℃(0.1MPa)高温灭菌25min,冷却至室温放置2天;挑选瓶内培养基无染菌现象的进行接种,每瓶接种10mL步骤S12所得种子培养液,共接种150瓶,静置培养30天,得发酵物。
S3、提取分离:
将步骤S2所得发酵物用甲醇浸泡,减压浓缩得到粗浸膏;用乙酸乙酯萃取甲醇浓缩物五次并减压浓缩以获得萃取物;分别依次以不同体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇-水混合溶液,对萃取物采用硅胶柱进行层析梯度洗脱分离,分别得到包含不同极性组分的洗脱部分,然后采用高效液相色谱纯化;
其中,本实施例对体积比为70:30的甲醇-水混合溶液洗脱部分用高效液相色谱纯化,所述高效液相色谱的条件为:
流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比73:27);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;仪器Essentia LC-16。
分离得到化合物5,为淡黄色油状物。
2、化合物5的表征:
对所得淡黄色油状物进行核磁共振和质谱检测,谱图参见图13~15。从质谱和核磁共振的结果分析可确定化合物5的分子式为C31H31ClN2O6,其结构式如下:
实施例6化合物6的提取和表征
1、化合物6的提取具体包括以下步骤:
S1、种子培养液的获得
S11、配制种子培养基:将PDB液体培养基(按照每升水中24g PDB培养基粉末进行配制)平均分配到4个1L锥形瓶内,经高温灭菌锅121℃(0.1MPa)条件下灭菌25min,之后冷却至室温,静置24小时,备用;
S12、种子的培养:将真菌SYSU-6778接入步骤S11制备的种子培养基,将接种后的锥形瓶放置在摇床上25℃恒温培养72小时,摇床转速100~150rpm,获得种子培养液;
S2、发酵培养:将大米培养基置于培养瓶混匀后密封,经121℃(0.1MPa)高温灭菌25min,冷却至室温放置2天;挑选瓶内培养基无染菌现象的进行接种,每瓶接种10mL步骤S12所得种子培养液,共接种150瓶,静置培养30天,得发酵物。
S3、提取分离:
将步骤S2所得发酵物用甲醇浸泡,减压浓缩得到粗浸膏;用乙酸乙酯萃取甲醇浓缩物五次并减压浓缩以获得萃取物;分别依次以不同体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇-水混合溶液,对萃取物采用硅胶柱进行层析梯度洗脱分离,分别得到包含不同极性组分的洗脱部分,然后采用高效液相色谱纯化;
其中,本实施例对体积比为60:40的甲醇-水混合溶液洗脱部分用高效液相色谱纯化,所述高效液相色谱的条件为:
流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(体积比53:47);流速:6mL/min,色谱柱:UltimateXB-C18,20×250mm,5μm;仪器Essentia LC-16。
分离得到化合物6,为黄色固体。
2、化合物6的表征:
对所得黄色固体进行核磁共振和质谱检测,谱图参见图16~18。从质谱和核磁共振的结果分析可确定化合物6的分子式为C22H16Cl2N2O5,其结构式如下:
实验例化合物1~6的抗菌活性测试
1、实验材料
Florfenicol(氟苯尼考,阿拉丁生物化学科技有限公司);Kanamycin(卡那霉素,元业生物科技有限公司);枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,百欧微生物科技有限公司);金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,百欧微生物科技有限公司);海豚链球菌(Sterptococcus iniae,百欧微生物科技有限公司);爱德华氏黄杆菌(Edwardsiellaictalurid,百欧微生物科技有限公司);副乳房链球菌(Streptococcus parauberis,百欧微生物科技有限公司);96孔(平底)无菌聚苯乙烯微板。
2、实验方法
分别采用实施例1~6所得喹啉酮类生物碱化合物1~6作为试验对象,以Florfenicol与Kanamycin为阳性对照,所得样品与两种阳性对照物质均用DMSO配制为初始浓度。采用连续稀释法测定喹啉酮类生物碱化合物对4种革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、海豚链球菌(S.iniae)、副乳房链球菌(S.parauberis))以及1种革兰氏阴性细菌爱德华氏黄杆菌(E.ictalurid)进行抑菌测试。
具体操作步骤:
S1、分别将四种革兰氏阳性细菌与一种革兰氏阴性细菌接种于LB培养液中,25~28℃条件下于摇床中300rpm培养24h,得菌液;
S2、使用DMSO配制化合物1~6及两种阳性对照的原液。
S3、吸取步骤S1所得菌液与步骤S2所得化合物1~6及两种阳性对照的原液于96孔板中,利用LB培养液在96孔板中连续稀释至化合物浓度分别为40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25和0.625μg/mL,每组做三个平行试验;
S4、将96孔板静置于培养箱中28~30℃条件下培养12h,观察结果。
3、实验结果
结果参见表1。
表1化合物1~6的抑菌活性测试结果
细菌 | S.aureus | S.iniae | B.subtilis | S.parauberis | E.ictalurid |
化合物1 | 10.0 | 10.0 | - | 20.0 | - |
化合物2 | 10.0 | 10.0 | - | 20.0 | - |
化合物3 | 5.0 | 2.5 | - | 5.0 | - |
化合物4 | 5.0 | 2.5 | - | 5.0 | - |
化合物5 | - | 1.25 | - | 40.0 | - |
化合物6 | 10.0 | 20.0 | 10.0 | 40.0 | 5.0 |
Florfenicol | NT | 0.4 | NT | 0.4 | 0.4 |
Kanamycin | 30 | NT | 4.0 | NT | NT |
注:“-”指抑菌浓度>40μg/mL。
由表可见,本发明所得喹啉酮类生物碱化合物1~6对不同的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、海豚链球菌、爱德华氏黄杆菌、副乳房链球菌均具有不同程度的抑菌活性,甚至部分化合物对特定细菌的抑菌活性还要优于阳性对照Florfenicol或Kanamycin。
其中,相对于两种阳性对照,化合物1~6对海豚链球菌(S.iniae)展现出中等至强的抗菌活性,特别是化合物5活性最强,其次为化合物3与化合物4,化合物6最弱;但化合物6对金黄色葡萄球菌(10μg/mL)的抑制活性高于卡那霉素(30μg/mL),对其他菌株也表现出较强的抑制活性,表明化合物6具有较宽的抑菌谱。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
2.一种海菖蒲来源的真菌,其特征在于,所述真菌为Aspergillus alabamensis真菌菌株SYSU-6778,保藏单位:广东省微生物菌种保藏中心,保藏日:2022年07月12日,保藏号:GDMCC No.62617。
3.权利要求1所述喹啉酮类生物碱化合物的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
S1、真菌发酵培养:将权利要求2所述真菌接种至种子培养基中,培养3~5天获得种子培养液;将种子培养液接种至大米培养基中,培养28~32天,得发酵物;
S2、提取分离:将步骤S1所得发酵物用甲醇浸泡,浓缩得到浸膏,浸膏用乙酸乙酯萃取完全,浓缩得萃取物,将所得萃取物用硅胶柱进行层析梯度洗脱分离,洗脱液为体积比(10~100):(90~0)的甲醇-水混合溶液,得到包含不同极性组分的洗脱液;
S3、液相色谱纯化:将步骤S2所得洗脱液用高效液相色谱进行纯化,其中,所述高效液相色谱的条件为:采用C18色谱柱,设置流速为2~6mL/min,以乙腈-乙酸水溶液为流动相,进行等度洗脱。
4.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,步骤S1中,所述大米培养基中大米的添加量为0.9~1.2g/mL。
5.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,步骤S2中,所述梯度洗脱分离的洗脱液依次采用体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇-水混合溶液。
6.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,步骤S3中,所述用高效液相色谱进行纯化为体积比为70:30或60:40的甲醇-水混合溶液的洗脱液。
7.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,步骤S3中,所述C18色谱柱为ACE-C18-PFP,10×250mm,5μm,12nm;或Ultimate XB-C18,20×250mm,5μm。
8.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,步骤S3中,所述乙酸水溶液的乙酸体积浓度为0.1~0.2%。
9.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,步骤S3中,所述等度洗脱中乙腈与乙酸水溶液的体积比为(40~83):(17~60)。
10.权利要求1所述喹啉酮类生物碱化合物在制备抗菌药物中的应用。
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