CN105087397B - 一种海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物在制备抗细菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物在制备抗细菌药物中的应用，其中所述的海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物按以下方法进行制备：1)挑取保藏编号为CGMCC No.8101的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042菌丝接种于PDA固体培养基上斜面培养；2)将斜面培养好的真菌接种于PD液体培养基上培养天，得到发酵培养物；3)将发酵培养物过滤，分离出菌丝体和发酵液；4)取菌丝体用混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得。申请人发现，上述菌丝体提取物对大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆菌和副溶血弧菌等细菌具有较好的抗细菌活性。

Description

一种海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物在制备抗细 菌药物中的应用

本申请是“一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用”的分案申请，原申请的申请日为：2014年5月15日，申请号为：201410203253.9，发明名称为：一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用。

技术领域

本发明涉及海洋微生物菌种，具体涉及一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用。

背景技术

病原细菌和真菌可引起动植物的多种病害，其不仅影响农作物产量和经济动物生长生产，造成极大的经济损失；而且影响人体健康，威胁人类生命安全。为了抑制和消灭病原细菌和真菌，人们一直致力于从不同环境中寻找新的有效的抗菌药物，以缓解越来越严重的耐药性菌株的出现。

在抗真菌药物的研究上，1939年来自青霉菌(Penillicilium griseofulvum)菌体的灰黄霉素(Griseofulvin)成为发现的第一个抗真菌抗生素，1955年第一个抗真菌药物两性霉素问世，以后又陆续开发了氟胞嘧啶和唑类等抗真菌药物。但是目前抗真菌药物仍然存在种类缺乏、选择性小、毒副作用大和耐药性强的缺点，因此研究和开发新型、高效、低毒、广谱的抗真菌药物十分必要。

在抗细菌药物的研究上，从第一个抗菌药物青霉素的出现，到后来的四环素、氯霉素、卡那霉素、利福平等抗生素，都在人类对抗病原细菌上发挥了较重要作用，但随着抗生素的滥用。越来越多的多耐药性病原菌开始出现，这是人类面临的又一挑战，挖掘新的抗菌药物和新的抗菌机制，是人类解决这一问题的有效方法之一。

在当今陆地生物资源越来越枯竭的背景下，从海洋微生物中寻找新型的药物是一条非常有前景的途径。其中2010年1月到2013年2月，就从海洋细菌、真菌、放线菌中发现895个新的具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤和抗污损的天然活性物质(赵成英,朱统汉,朱伟明,2010-2013之海洋微生物新天然产物,有机化学,2012,32,1-41)。海洋微生物产品开发上最为成功的例子是1945年从海洋污泥中分离到顶头孢霉菌，从中发现了头孢菌素，以后发展成系列的头孢类抗菌素。而且有证据表明，原来被认为是来源于海绵等海洋生物的重要活性物质，如海豚毒素、海葵毒素、麻壳鱼毒素等，实际上也是由微生物产生，这些都使利用海洋微生物开发新型药物成为了焦点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用。

本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042，该菌株已于2013年8月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国北京中科院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC No.8101。

本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042是从海洋腐木中分离、纯化得到。其分离纯化方法为：取海洋腐木样品，用无菌玻棒捣碎后加入一定量的无菌生理盐水，再加入玻璃珠在摇床上震荡20～30min(通常在20～30℃条件下进行),静置分层后取上层液做10倍梯度稀释，取原倍液、10倍和100倍稀释液图布PDA固体平板，26～30℃恒温培养，等菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。

本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的特征为产孢子，在海水PDA培养基上生长良好，菌落初期为棕色，后期颜色逐渐变浅，呈轮纹状向外生长，菌落边缘轮廓清晰，菌落生长较慢，薄而平坦，紧贴培养基，不易挑取，有较多厚垣孢子，有孢囊孢子和孢子囊；分生孢子为球型，表面带有明显的小突起，球体直径大小约为18～22um；孢子囊为球型，球体直径大小约为54～60um。

根据常规方法提取该菌株的DNA，利用真菌的ITS区的通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’扩增其ITS区，所得ITS测序序列如下所示：

CAGTGGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAAAGATAATCTTTCAACTCGAAAGATTTTTTCCTTTGTGCTGGCTTTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTAAACATGGCAGCCTTTATGGTTTGCCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAAAACTTACTGAACAACTAAACAATGATTTTAATAATCTGTTTAAAACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACTCCTAACCTTTGTGGTTATGATGTGGAATTGGGATGCGCCGATTTTTACTAGTCGGCACTCCTAAAATGTAGCTCTTGGCTGTTTCCTACTACAGCAGTTTGGCCTAATAGTTTTGACTTTTGTCAAATCTTTGGCTCCATTTGCTTCTGGAAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACTCATTCAAACTTGATCTAAATCAGGAGTTC。

根据常规方法提取该菌株的DNA，利用通用引物5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和NS4：5’-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’扩增真菌18s rRNA基因，所得18s rRNA测序序列如下所示：

ACTTCTCGTCGGAACCGACTGTTGCCAATCAGTTTCCAACAATCCAAAGGACTCACTAAGCCGTTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCGAGCTGATGACTCACGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGATTACCCAGACCTTCCGGCCAAGGTTATAAACTCGTTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATCAATTAAACATTGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAAAAAGACACGACCAAAGTCATGCTGGCTATTTAGCAGAGTAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACGAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAAACTTGGCTTTCGCTGAAATGCCGAATGGGTCAATATAAAATATAACACCATCCGATCCTTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGACAAATGCTTTCGCAGAAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATTGAATACTAATGTCCCCAACTATCCCTATTCATCATTACTTTGGCTTTAGAAACCAACGAAATAAGGCCAAAGTCCTATTTCATTATTCCATGCTAATATGTTCAGGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCCAATTTTTTCAAAGTAAAAGTTCTGGTTCACCAGCCGCCACCGAAATGACGACTGGCTAACCCAGAAGGTGGAGCCCCGCCCGTTGAGGTACCGATCAATGAAGACCGAACCCCACAGGCGAAGGCCAAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCGTAAAGGCCCTGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTAAAAGCATGGTAGGCCACTAACCTACCATCGAAACTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGCATCATCGCCGGCACAAGGCCATGCGATTCGATTAATTATTATGAATCACCATACAAGCGGTTGCCCGCGTTGGCTTTTTATCTAATAAGTGCACCTCTTCCAGAAGTCGAGGTTATGTACGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAGTGAATATCAAATAAATTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTATAAATTTGTT。

综合上述形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，可以确定该菌株为Umbelopsis属真菌，分子生物学鉴定结果表明其亲缘关系与Umbelopsis isabellina最近，但是通过形态鉴定可以发现其分生孢子和产孢器形态结构和大小都与Umbelopsis isabellina有差异，可能为Umbelopsis isabellina的一个新的变种，我们将该菌株暂定为Umbelopsissp.QZ042。

本发明的第二个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物，该提取物是以上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得。其中，所述组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比优选为70～80:15～20:4～8，进一步优选为75～80:15～18:5～8；所述的液体发酵是将海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042菌株接种到PD液体培养基中，于25～32℃条件下摇床培养5～7天或静置培养15～30天，以获得发酵培养物；在摇床培养时，转速优选为130～150r/min。

本发明的第三个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)种子培养：挑取海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042菌丝接种于PDA固体培养基上斜面培养5～7天，温度控制在26～30℃；

2)发酵培养：将斜面培养好的真菌接种于PD液体培养基上，于25～32℃条件下摇床培养5～7天或静置培养15～30天，得到发酵培养物；

3)过滤：将发酵培养物过滤，分离出菌丝体和发酵液；

4)提取：取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得到海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物。

上述方法的步骤2)中，摇床培养时，转速优选为130～150r/min；步骤4)中，所述组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比优选为70～80:15～20:4～8，浸提的温度优选为0～8℃，浸提的时间优选为3～4天。

申请人通过实验发现，本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物在50μg/ml时，对大肠杆菌(E.Coli)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、克雷伯氏杆菌(Klebsiella peneumoniae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)等细菌的抑制圈直径d分别为12.3mm、14.7mm、17.2mm、13.4mm和22.5mm，表明海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物对细菌具有抗细菌活性，可以用来制备抗细菌药物。

因此，本发明的第四个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物在制备抗大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆菌或副溶血弧菌药物中的应用。

本发明的第五个目的则在于提供一种抗大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆菌或副溶血弧菌的药物，该药物包含上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物作为活性成分。

申请人通过实验发现，本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物在100μg/ml时，对散囊菌(Eurotium rubrum)、链格孢霉(Alternariasp.)、毛双孢霉(Lasiodiplodia pseudotheobromae)、茎溃疡病菌(Diaporthephaseolorum)等真菌具有明显的抑菌作用，表明海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物对真菌具有抗真菌活性，可以用来制备抗真菌药物。

因此，本发明的第六个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物在制备抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉或茎溃疡病菌药物中的应用。

本发明的第七个目的则在于提供一种抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉或茎溃疡病菌的药物，该药物包含上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物作为活性成分。

本申请中，所述的PD液体培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、50％人工海水1000mL；所述的PDA固体培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、50％人工海水1000mL。

与现有技术相比，本发明提供了一种新的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042菌株，申请人发现该菌株培养物的菌丝体提取物具有广谱的抗细菌、抗真菌活性，其活性物质和抑菌机制可能不同于已有的抗菌药物，存在新药研发的潜力。

附图说明

本发明所涉及的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042，已于2013年8月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国北京中科院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC No.8101。

图1为本发明所述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042菌株在培养基上的形态，其中，A表示PDA培养基上的菌落照片，B表示在光学显微镜下的孢子照片(放大倍数10×10)，C表示电镜下的厚垣孢子，D表示电镜下的孢子囊，E表示电镜下的分生孢子梗和菌丝；

图2为本发明所述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的ITS序列进化树；

图3为本发明所述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的18s rRNA序列进化树。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的分离和鉴定

1.真菌的分离

用无菌三角瓶取海洋腐木样品，称取5g,采用无菌玻棒捣碎后加入50ml无菌生理盐水，加入玻璃珠在摇床上震荡20min,静置分层后取上层液做10倍梯度稀释，取原倍液、10倍和100倍稀释液图布PDA固体培养基，26～30℃恒温培养，等菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。

2.真菌的培养和形态学观察

培养特征观察：将菌种接种于PDA培养基上,26℃恒温培养获得菌落。记录初生菌丝颜色、菌落颜色变化、表面特征、有无色素产生。

制片及镜检：挑取各菌株产孢器及菌丝制成水封片,棉蓝溶液染色,进行镜下观察,记录菌丝特征及分枝情况、孢子和产孢器结构,并拍照记录。

结果：真菌在PDA培养基上生长良好，菌落初期为棕色，后期颜色逐渐变浅，呈轮纹状向外生长，菌落边缘轮廓清晰，菌落生长较慢，薄而平坦，紧贴培养基，不易挑取，有较多厚垣孢子，有孢囊孢子和孢子囊，真菌的菌落及孢子如图1所示(A表示PDA培养基上的菌落照片，B表示在光学显微镜下的孢子照片(放大倍数10×10)，C表示电镜下的厚垣孢子，D表示电镜下的孢子囊，E表示电镜下的分生孢子梗和菌丝)。孢囊孢子、孢子囊、菌丝的电镜图像见图1,从图1可以看出QZ042的分生孢子为球型，表面带有明显的小突起，球体直径大小约为18～22um；孢子囊为球型，球体直径大小约为54～60um。

3.真菌总DNA的提取

将分离得到的内生真菌接种到PD液体培养基中，于26℃摇瓶培养4d。过滤收集菌丝体。菌丝体采用液氮冻融2次，灭菌玻璃棒研磨后用USAOmega Bio-Tek公司的“真菌基因组DNA小量提取试剂盒”提取真菌的基因组。

4.真菌的ITS分子鉴定

用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID NO：1)和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO：2)扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1区、5.8S区、ITS2区)序列。PCR反应条件为：94℃变性5min，然后94℃，30s→55℃，40s→72℃，1.0min进行35个循环扩增，最后72℃延伸10min。将PCR产物纯化后直接送上海生工生物工程技术服务有限公司，用引物ITS1测序，所得ITS测序序列如下所示：

CAGTGGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAAAGATAATCTTTCAACTCGAAAGATTTTTTCCTTTGTGCTGGCTTTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTAAACATGGCAGCCTTTATGGTTTGCCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAAAACTTACTGAACAACTAAACAATGATTTTAATAATCTGTTTAAAACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACTCCTAACCTTTGTGGTTATGATGTGGAATTGGGATGCGCCGATTTTTACTAGTCGGCACTCCTAAAATGTAGCTCTTGGCTGTTTCCTACTACAGCAGTTTGGCCTAATAGTTTTGACTTTTGTCAAATCTTTGGCTCCATTTGCTTCTGGAAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACTCATTCAAACTTGATCTAAATCAGGAGTTC(SEQID NO：3)。

所得的ITS测序序列在GenBank中采用Blastn进行相似性分析，从核酸序列数据库中找到与其相似度最高的菌株为Umbelopsis isabellina(AJ876493.1)，相似性达97％。

通过对菌株的系统发育分析，发现分离的菌株系统发育关系非常独特，在系统进化关系上与Umbelopsis isabellina、Umbelopsis ramanniana等在同一个分支，所得ITS序列进化树如图2所示。

5.海洋腐木真菌的18s rRNA基因分子鉴定

用引物NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’(SEQ ID NO：4)和NS4：5’-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’(SEQ ID NO：5)扩增真菌18s rRNA基因序列。PCR反应条件为：94℃变性5min，然后94℃，30s→50℃，40s→72℃，2min进行35个循环扩增，最后72℃延伸10min。将PCR产物纯化后直接送上海生工生物工程技术服务有限公司，用引物NS1测序，所得18s rRNA测序序列如下所示：

ACTTCTCGTCGGAACCGACTGTTGCCAATCAGTTTCCAACAATCCAAAGGACTCACTAAGCCGTTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCGAGCTGATGACTCACGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGATTACCCAGACCTTCCGGCCAAGGTTATAAACTCGTTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATCAATTAAACATTGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAAAAAGACACGACCAAAGTCATGCTGGCTATTTAGCAGAGTAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACGAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAAACTTGGCTTTCGCTGAAATGCCGAATGGGTCAATATAAAATATAACACCATCCGATCCTTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGACAAATGCTTTCGCAGAAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATTGAATACTAATGTCCCCAACTATCCCTATTCATCATTACTTTGGCTTTAGAAACCAACGAAATAAGGCCAAAGTCCTATTTCATTATTCCATGCTAATATGTTCAGGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCCAATTTTTTCAAAGTAAAAGTTCTGGTTCACCAGCCGCCACCGAAATGACGACTGGCTAACCCAGAAGGTGGAGCCCCGCCCGTTGAGGTACCGATCAATGAAGACCGAACCCCACAGGCGAAGGCCAAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCGTAAAGGCCCTGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTAAAAGCATGGTAGGCCACTAACCTACCATCGAAACTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGCATCATCGCCGGCACAAGGCCATGCGATTCGATTAATTATTATGAATCACCATACAAGCGGTTGCCCGCGTTGGCTTTTTATCTAATAAGTGCACCTCTTCCAGAAGTCGAGGTTATGTACGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAGTGAATATCAAATAAATTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTATAAATTTGTT(SEQ ID NO：6)。

所得的18s rRNA测序序列在GenBank中采用Blastn进行相似性分析，从核酸序列数据库中找到与其序列相似度最高的菌株为Umbelopsis isabellina(AF157166)，相似性达99％。

通过对菌株的系统发育分析，发现分离的菌株在系统进化关系上与Umbelopsisisabellina等在同一个分支，所得18s rRNA序列进化树如图3所示。

综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，可以确定该菌株为Umbelopsis属真菌，分子生物学鉴定结果表明其亲缘关系与Umbelopsis isabellina最近，但是通过形态鉴定可以发现其分生孢子和产孢器形态结构和大小都与Umbelopsis isabellina有差异，可能为Umbelopsis isabellina的一个新的变种，我们将该菌株暂定为Umbelopsissp.QZ042。

实施例2：海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042活性物质的提取

1.种子培养

培养基：马铃薯180～220g，葡萄糖18～22g，琼脂20g，50％人工海水1000mL。挑取真菌菌丝接种于培养基上进行斜面培养，28℃培养5～7天。其中，人工海水(盐度3.34％)的配方如下：每升水含：氯化钠NaCl 26.726g，氯化镁MgCl₂ 2.26g，硫酸镁MgSO₄ 3.248g，氯化钙CaCl₂ 1.153g，碳酸氢钠NaHCO₃ 0.198g，氯化钾KCI 0.721g，溴化钠NaBr 0.058g，硼酸H₃BO₃ 0.058g，硅酸钠Na₂SiO₃ 0.0024g，硅酸钠Na₂Si₄O₉ 0.0015g，磷酸H₃PO₄ 0.002g，六氯化二铝Al₂Cl₆ 0.013g,，氨NH₃ 0.002g，硝酸锂LiNO₃ 0.0013g。

2.发酵培养

发酵培养基：马铃薯180～220g，葡萄糖18～22g，50％人工海水1000mL。人工海水(盐度3.34％)的配方同上。将斜面培养好的真菌挑到发酵培养基，于25～32℃条件下以140r/min的转速摇床培养5～7天(或采用静置培养15～30天)。

3.将上述发酵液用4层纱布过滤，分别收集菌丝体和发酵液；

4.培养物的菌丝体提取物的制备

将收集的菌丝体用水冲洗，去除发酵液，干燥；然后用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸(体积比为80：15：5)组成的混合溶剂浸提，浸提的温度为0～8℃，时间为4d，过滤，浸提液用旋转蒸发器RE-3000在55℃以50r/min的转速下旋转蒸发浓缩至小体积，70℃水浴挥干溶剂，得到海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物(以下简称菌丝体提取物)，备用。

实施例3：海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的培养物的菌丝体提取物的抗菌活性

1.指示菌的制备

将E.Coli、B.cereus、Arthrobacter nicotianae、Klebsiella peneumoniae、Vibrio parahaemolyticus分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃摇床上以150r/min的转速培养过夜。指示真菌Eurotium rubrum、Alternaria sp.、Lasiodiplodiapseudotheobromae、Diaporthe phaseolorum、Pestalotiopsis microspora分别接种于PDA平板上培养至培养皿的1/2。这些细菌和真菌均由本实验室保存。每株指示菌接2个平板。

2.抗细菌活性的测定

分别称取实施例2制得的菌丝体提取物，通过加入无菌水稀释溶液到400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml,采用平板滤纸片琼脂扩散法测定其抗菌活性。在培养皿中分别移入500μL的指示菌悬液，倒入已融化至45℃的牛肉膏蛋白胨培养基，立即混合均匀。待凝固后，将吸有待测液的5～6cm无菌滤纸片待浸提液挥发干后，贴于平板上。在26℃培养8～10h后，用十字交叉法测量抑菌直径的大小，并记录。用空白无菌滤纸吸取浸提液挥发干后，作为空白对照。结果如下述表1所示：

表1：海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的培养物的菌丝体提取物(50μg/ml)的抗细菌活性

注1:Ⅰ：对照溶剂乙酸乙酯：甲醇：乙酸(80：15：5)；Ⅱ：菌丝体提取物(50μg/ml)。注2：抑菌圈(d)大小:：+:(d)<10.0mm；++:10.0mm<d<20.0mm；+++:d>20.0mm；-:无活性。

3.抗真菌活性的检测

分别称取实施例2制得的菌丝体提取物，通过加入无菌水稀释溶液到400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml,采用打孔法检测待测液的抗真菌活性。用直径5mm的打孔器，在培养了2-4d的指示真菌的菌落边缘打孔。然后吸取40uL的待测液于孔内，26℃培养2d后，观察抑菌结果。吸取浸提液作为空白对照。实验重复三次。结果如下述表2所示：

表2：海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的培养物的菌丝体提取物(100μg/ml)的抗真菌活性

注1：Ⅰ：对照溶剂乙酸乙酯：甲醇：乙酸(70～80:15～20:4～8)；Ⅱ：菌丝体提取物(100μg/ml)。

注2：+：有抗菌活性；-：无抗菌活性。

Claims (2)

1.海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物在制备抗大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆菌或副溶血弧菌药物中的应用；其中，所述的海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物按以下方法进行制备：

1)种子培养：挑取保藏编号为CGMCC No.8101的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042菌丝接种于PDA固体培养基上斜面培养5～7天，温度控制在26～30℃；

2)发酵培养：将斜面培养好的真菌接种于PD液体培养基上，于25～32℃条件下摇床培养5～7天或静置培养15～30天，得到发酵培养物；

3)过滤：将发酵培养物过滤，分离出菌丝体和发酵液；

4)提取：取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得；其中组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比为70～80:15～20:4～8。

2.一种抗大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆菌或副溶血弧菌的药物，其特征在于：该药物包含海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物作为活性成分；其中，所述的海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物按以下方法进行制备：

1)种子培养：挑取保藏编号为CGMCC No.8101的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042菌丝接种于PDA固体培养基上斜面培养5～7天，温度控制在26～30℃；

2)发酵培养：将斜面培养好的真菌接种于PD液体培养基上，于25～32℃条件下摇床培养5～7天或静置培养15～30天，得到发酵培养物；

3)过滤：将发酵培养物过滤，分离出菌丝体和发酵液；

4)提取：取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得；其中组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比为70～80:15～20:4～8。