CN101215283A - 双口山酮化合物Secalonic acid A及其制备方法与制备神经元细胞保护药物中的应用 - Google Patents
双口山酮化合物Secalonic acid A及其制备方法与制备神经元细胞保护药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了双口山酮化合物Secalonic acid A及其制备方法与制备神经元细胞保护药物中的应用。结构式如式(I)，可从真菌Talaromyces stipitatus SBE－14的发酵培养液和菌体中提取分离得到。提取方法简单，成本低廉；能抑制神经元细胞的凋亡的活性高，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及药物化合物领域，具体涉及一类源于真菌的具有保护神经元细胞活性的双口山酮化合物Secalonic acid A的制备方法以及在神经元细胞保护中的应用。
背景技术
就寻找新化合物和新抗生素药物而言，在经过半个世纪每年数十亿美元的投入的全球性筛选后，目前从陆源微生物发现新化合物的几率已大大降低，分离所得的化合物有90％以上是前人鉴定过的。而另一方面，海洋微生物研究传来了令人们兴奋的发现，研究人员已从海洋微生物中分离出众多的新化合物，有些结构类型以前从未在陆生生物中发现过，在得到的化合物中新结构物质比例远高于陆生生物所得，由于海洋环境的特殊性，海洋微生物种类繁多，来源广泛，筛选获得率高，海洋微生物成了又一个吸引人的天然药物宝库。
2006年，John教授等在《Natural Product Reports》的“海洋天然产物”的综述中报道，2004年报道的海洋天然产物768个化合物(716个新化合物，其中有380个化合物有药理活性，占55％)中，海洋微生物(包括海洋真菌)是主要来源之一(另外包括海绵和腔肠动物)。2004年的海洋天然产物的研究成果进一步证明，海洋真菌是研究和增加新颖化合物的热点。到目前为止，已从海洋真菌中发现大量新型抗生素、抗癌、抗病毒、抗菌、抗其它重大疾病等的生物活性物质。
Talaromyces sp.是海洋真菌的一种，二十世纪五十年代首次被发现，能产生丰富的代谢产物，而海洋真菌Talaromyces sp SBE-14来自香港红树林植物，是一种典型的内源性真菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新的来源于海洋真菌的具有潜在药用价值的双口山酮化合物Secalonic acid A。
本发明的另一个目的是提供上述化合物Secalonic acid A的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述化合物Secalonic acid A化合物在制备神经元细胞保护药物中的应用。
发明人由南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的发酵培养物中提取分离得到化合物Secalonic acid A，该化合物的结构如下：
本发明所用的真菌Talaromyces sp SBE-14已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为M 207195，保藏日为2007年12月10日。
本发明双口山酮化合物Secalonic acid A可从真菌Talaromyces spSBE-14的发酵培养液和菌体中提取分离得到，制备方法的具体步骤如下：
a.南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖0.1-1.5，酵母提取物0.01-0.15，蛋白胨0.005-0.3，琼脂0.5-1.5，氯化钠0.1-2.5，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；
b.南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖5-15，酵母提取物1-4，蛋白胨0.5-4，氯化钠3-5，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2个月；
c.将上述培养好的发酵液过滤得到菌体和培养液；菌体和培养液分别处理；
d.在温度不超过50℃条件下，将培养液加热浓缩至原液体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；
e.培养液浸膏经过柱层析后，收集50％～100％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶Secalonic acid A；
f.将菌体风干，用甲醇浸泡，提取液浓缩成浸膏，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集50％～100％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶Secalonic acid A。
本发明经试验证明，双口山酮化合物Secalonic acid A，能有效抑制神经元细胞的凋亡，能用于开发神经元保护药物，如中枢慢性神经退行性疾病或脑缺血疾病的治疗药物。
与现有神经元保护药物相比，本发明具有如下有益效果：本发明的Secalonic acid A来源于海洋真菌，海洋真菌种类繁多、数量庞大，从真菌提取的方法简单，使得醌类化合物来源丰富、成本低廉；Secalonic acid A，抑制神经元细胞的凋亡的活性高，应用前景广阔。
附图说明
图1为双口山酮化合物Secalonic acid A抑制神经原细胞凋亡结果图。
具体实施方式
实施例1化合物Secalonic acid A分离制备方法
a.南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖0.1-1.5，酵母提取物0.01-0.15，蛋白胨0.005-0.3，琼脂0.5-1.5，氯化钠0.1-2.5，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；
b.南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖5-15，酵母提取物1-4，蛋白胨0.5-4，氯化钠3-5，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2个月；
c.将上述培养好的发酵液过滤得到菌体和培养液；菌体和培养液分别处理；
d.在温度不超过50℃条件下，将培养液加热浓缩至原液体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；
e.培养液浸膏经过柱层析后，收集50％～100％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶Secalonic acid A；
f.将菌体风干，用甲醇浸泡，提取液浓缩成浸膏，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集50％～100％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶Secalonic acid A。
Secalonic acid A为黄色针状结晶，熔点为230-231℃，易溶于乙腈，THF，微溶于甲醇/氯仿，氯仿和乙酸乙酯，不溶于水。元素分析显示C60.01％，H 4.32％(理论值C 60.19％，H 4.74％，O 35.08％)。FABMS显示分子离子峰为639[M+1]+。
1H NMR(DMSO，500MHz)：δ7.43(2H，d，8.5Hz)，6.62(2H，d，8.5Hz)，3.80(2H，d，11.0Hz)，2.65(2H，dd，6.0，6.0Hz)，2.30，2.44(4H，m)，1.03(6H，d，6.5Hz)，3.59(6H，s)，11.57(2H，br s)，2.05(2H，br s)，13.56(2H，br s)，
13C NMR(CDCl3，125MHz)：δ158.6，117.5，140.3，107.7，159.0，75.5，29.9，35.9，178.3，101.8，186.7，106.4，85.3，17.9，170.2，52.9
实施例2免疫荧光法检测化合物Secalonic acid A的神经元保护活性试验
1.试验材料
1.1实验动物：新生Sprague-Dawley大鼠，由中山医科大学实验动物中心提供。
1.2主要药品与试剂及来源：DMEM+F12培养基、B27无血清培养基添加剂、Kreb’s解剖液(Gibco公司)，Poly-L-lysine、Trysine、DMSO、Hoechst33258(Sigma公司)。
1.3主要仪器设备：细胞培养器皿(Corning，美国)，超洁净工作台(北京半导体设备一厂)，CO2细胞培养箱(Forma Scientific，美国)，DK-8D型电热恒温水槽，倒置相差显微镜(OLYMPMS，日本)，pH计(PTC100型，MG公司，美国)，倒置荧光显微镜(OLYMPMS，日本)，电子天平(Sartorius，德国)。
2.实验方法：
2.1实验分组：
a.正常对照组。
b.1μM秋水仙碱组。
c.药物组：以不同浓度(1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml)各种药物预孵2小时，再加入1μM秋水仙碱作用24小时。
2.2大鼠皮层神经元培养
取新生24小时内Sprague-Dawley大鼠，在超净工作台中，75％酒精消毒皮肤，断头，开颅，取出大脑，置于无菌的培养皿中，在Kreb’s解剖液(3.625％NaCl，0.2％KCL，0.07％NaH2PO4，1.3％D-glucose，1％Phenal Red，2.97％Hepes(w/v))中，除去脑表面的脑膜血管，小心分离出大脑皮层部分。用眼科剪把皮层组织剪碎，转移入含0.125％胰蛋白酶的Kreb’s解剖液，37℃水浴消化17分钟，开始五分钟取出振荡摇匀一次，后均隔3分钟振荡摇匀一次，见有蟾卵状的浮起物时，即可终止消化。消化后，加入等体积胰酶抑制剂(0.1％大豆胰酶抑制剂，0.002％DNase抑制剂，0.1％MgSO4(w/v))，吹打，混匀，终止消化。静置10分钟。取上清，离心1000rpm，5分钟。去上清，用含有DMEM的培养基洗涤沉淀，离心1000rpm，5分钟，去上清，将沉淀加入含有DMEM的培养基(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium)(含10％灭活胎牛血清，100M/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素)混匀并稀释至细胞浓度为106/ml，在CO2细胞培养箱中预置18分钟，取上清夜接种于预铺了poly-L-lysine(10μg/ml)的35mm一次性塑料培养皿(Corning)。置于保持5％CO2，37℃环境的培养箱培养24小时后，全部换成含2％B27的无血清培养基，以后每隔两天半量换液一次，培养至第六天加药。无血清浓度足以抑制大部分胶质细胞的增殖。以免疫荧光法进行神经元鉴定，用特异性结合于神经元的带荧光标记的破伤风毒素染色，以每个视野下神经元数目占每个视野下的总细胞数的比例为神经元纯度。经鉴定神经元纯度达90％。培养第6日全部换成无血清培养基，并施加处理。
2.3核荧光染色
取待测的培养神经元，除去培养基，用冷磷酸盐缓冲液PBS(0.8％NaCl，0.02％KCl，0.115％Na2HPO4，0.02％KH2PO4(w/v))洗两次。4％甲醛溶液4℃固定10分钟。PBS洗两次，室温吹干。加入1mlHoechst33258(8μg/ML，溶于PBS)，室温下染色5分钟。蒸馏水洗两次，室温吹干。在倒置荧光显微镜下进行凋亡核计数和拍照记录。
统计分析：每100个细胞中凋亡细胞的数量定为凋亡率。每个样本数6个不同的视野，进行3次独立试验。结果表示为mean±SD，两组以上比较用SPSS11.0软件进行单因素方差分析(One-wayANOVA)。
3.实验结果
试验结果见图1，筛选结果表明Secalonic acid A即Try-7-1，能有效的抑制神经原细胞的凋亡，并且有浓度依赖性。
Claims (5)
1.双口山酮化合物Secalonic acid A，其结构式如式(I)所示。
2.权利要求1所述双口山酮化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)南海海洋真菌Talaromyces stipitatus SBE-14的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖0.1-1.5，酵母提取物0.01-0.15，蛋白胨0.005-0.3，琼脂0.5-1.5，氯化钠0.1-2.5，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；
(2)南海海洋真菌Talaromyces stipitatus SBE-14的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖5-15，酵母提取物1-4，蛋白胨0.5-4，氯化钠3-5，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2个月；
(3)将上述培养好的发酵液过滤得到菌体和培养液；菌体和培养液分别处理；
(4)在温度不超过50℃条件下，将培养液加热浓缩至原液体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；
(5)培养液浸膏经过柱层析后，收集50％～100％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶Secalonic acid A；
(6)将菌体风干，用甲醇浸泡，提取液浓缩成浸膏，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集50％～100％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶Secalonic acid A。
3.权利要求1所述双口山酮化合物Secalonic acid A在制备神经元细胞保护药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述神经元细胞保护药物是指中枢慢性神经退行性疾病或脑缺血疾病的治疗药物。
5.一种南海海洋真菌Talaromyces stipitatus SBE-14，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 207195。
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