CN102070598B - 一类降倍半萜过氧化合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类降倍半萜过氧化合物，分子式为C₁₄H₂₀O₄或C₁₆H₂₄O₅，该类化合物来源于海洋真菌Talaromycessp.HN21-3CCCTCCNo:M2010266。本发明还公开了该类化合物的制备方法，包括真菌的种子培养、发酵培养、分离菌丝体、有机溶剂萃取菌丝体、色谱分离、凝胶柱层析分离以及重结晶纯化等步骤。本发明的降倍半萜过氧化合物可以用于制备抗肿瘤药物，药效显著。

Description

一类降倍半萜过氧化合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物化合物领域，具体涉及一类源于真菌的具有抗肿瘤活性的降倍半萜过氧化合物及其制备方法，以及这类降倍半萜过氧化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。 

背景技术

海洋占地球表面积70%，海洋微生物无论从数量上或是多样性方面都相当丰富，美国“国际海洋微生物普查”项目首席科学家米切尔·索金最近公布，海洋微生物的总量应在500～1000万种，远远超出原来20万种的估计，也远远超出全球动植物种类的总和。 

海洋微生物生活在特殊环境之中，例如高盐度、高压、低营养、低温（特别是深海）或局部高温和无光照以及不同的生物之间的关系等等。在这些所谓生命的极限环境中，海洋微生物已发展出独特的代谢方式，这不仅确保其在极端环境中生存，也提供了在陆地微生物中未遇到过的代谢产物的生产潜力，因而是多种多样新颖化合物的极好资源。科技界相信，海洋微生物将成为21世纪开发新型医药品的资源。 

红树林生态系是世界上最富多样性、生产力最高的海洋生态系之一。红树林沼泽区有充足的植物材料，有丰富的浮游藻类和浮游生物，这些条件正适合于微生物的繁殖。在过去的十几年里，红树林栖息地被证明是真菌新种属的丰富来源，这形成了海洋真菌第二大的生态学亚类。 

自从1929年从真菌中发现青霉素以来，真菌的代谢产物成为了药物的丰富来源，它们在抗菌，抗肿瘤，治疗心血管疾病，免疫调节剂等有重要应用。海洋微生物种类繁多，来源广泛，筛选获得率高，根据John教授在2008年《Natural Product Reports》的报道， 2006年发现海洋天然产物新化合物中，海洋微生物是主要来源之一，成为当今国际上研究的热点。 

发明内容

本发明的目的在于提供来源于海洋红树林内生真菌的一类降倍半萜过氧化合物。 

本发明的另一个目的是提供上述降倍半萜过氧化合物的制备方法。 

本发明的又一目的是提供上述降倍半萜过氧化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。 

本发明通过以下技术方案实现上述目的： 

发明人由南海海洋真菌 Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266的发酵培养物中提取分离得到一类降倍半萜过氧化合物，结构式如（Ⅰ）或（Ⅱ）：

本发明所用的真菌Talaromyces sp. HN21-3C，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国 武汉大学校内），保藏号为CCTCC No：M 2010266，保藏日为2010年10月15日。

上述降倍半萜过氧化合物的制备方法，包括以下步骤： 

（1）真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266的种子培养；

（2）真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266的发酵培养；

（3）将步骤（2）得到的发酵液和菌体离心，除去发酵液，得到菌丝体；

（4）将菌丝体用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，得到浸膏，对浸膏进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集10％～50％乙酸乙酯/石油醚洗脱液；

（5）将步骤（4）得到的洗脱液以30%的乙酸乙酯-石油醚为洗脱液进行凝胶柱层析分离，重结晶纯化，得到化合物Ⅰ和Ⅱ。

其中，步骤（1）所述种子培养，培养基组成及重量份数为：葡萄糖0.3～2.5，酵母提取物0.03～0.2，蛋白胨0.1～0.5，琼脂1.5～2.5，氯化钠1.5～4，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，28～35℃培养7～10天。 

步骤（2）所述发酵培养，发酵培养基组成及重量份数为：葡萄糖0.5～5，酵母提取物0.2～1，蛋白胨0.5～2，氯化钠1.5～5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于25～35℃静置1～2个月。 

步骤（4）中所述有机溶剂为甲醇、乙酸乙酯或丙酮。 

上述降倍半萜过氧化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌或肝癌。 

本发明经试验证明，降倍半萜过氧化合物Ⅰ和Ⅱ能有效抑制多种肿瘤细胞株的生长，可用于制备抗肿瘤药物，可以是药物上可接受的任意一种剂型。 

与现有抗肿瘤药物相比，本发明具有如下有益效果：本发明的降倍半萜过氧化合物Ⅰ和Ⅱ来源于海洋真菌，海洋真菌种类繁多、数量庞大，从真菌提取的方法简单，使得降倍半萜过氧化合物Ⅰ和Ⅱ来源丰富、成本低廉；降倍半萜过氧化合物Ⅰ和Ⅱ抗肿瘤活性高，应用前景广阔。 

具体实施方式

实施例1  降倍半萜过氧化合物的制备方法

a.真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No：M 2010266的种子培养：

培养基组成按重量比为：葡萄糖2.5，酵母提取物0.2，蛋白胨0.5，琼脂2.5，氯化钠3.5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，28℃ 培养10天；

b.真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No：M 2010266的发酵培养：

发酵培养基组成按重量比为：葡萄糖5%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，氯化钠3.5%，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25～35℃静置1个月；

c. 将上述培养好的发酵液和菌体离心除去发酵液；

d. 将离心得到的菌丝体用甲醇萃取多次，浓缩萃取液，将获得的浸膏利用硅胶柱进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；

e. 收集10％－50％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，30％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以凝胶柱层析分离，重结晶纯化，即得到无色颗粒晶体化合物Ⅰ和Ⅱ。

化合物Ⅰ和Ⅱ的试验数据： 

化合物Ⅰ: C₁₄H₂₀O₄，HRESI-MS：275.1292(M+Na)⁺(计算值275.1259), mp 232℃. IR ν/cm^-1(KBr): 3424, 2952, 2912, 2888, 1739, 1723，1433，1324，1180，1132，1086，1019, 967, 817，739, 591, 509. 

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)：δ 4.18 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 2.95 (ddd, J = 17.3, 12.0, 8.5 Hz, 1H), 2.75 (ddd, J = 15.2, 14.6, 6.7 Hz, 1H), 2.61 (dd, J = 17.3, 7.4 Hz, 1H), 2.50 (ddd, J = 15.5, 4.8, 2.5 Hz, 1H), 2.36 (dddd, J = 14.1, 8.5, 3.9, 1.6 Hz, 1H), 2.29 (dt, J = 14.1, 3.8 Hz, 1H), 2.06 (td, J = 14.4, 4.7 Hz, 1H), 1.99 – 1.88 (m, 2H), 1.66 (ddd, J = 14.4, 6.6, 2.5 Hz, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 1.04 (s, 3H).

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃)：δ 206.98, 206.65, 91.00, 81.63, 41.99, 39.36, 37.71, 35.84, 35.73, 32.21, 26.42, 26.21, 24.82, 22.00.

化合物Ⅱ: C₁₆H₂₄O₅，HRESI-MS：319.1518 (M+Na)⁺(计算值319.1521) , mp 169℃. IR ν/cm^-1(KBr): 3434, 2961, 2881, 1729, 1459, 1395, 1370, 1255, 1163, 1126, 1102, 1044, 1013, 965, 900, 810, 623, 605, 545, 500, 469.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ4.87 (ddd, J = 11.3, 7.6, 3.8 Hz, 1H), 4.23 (td, J = 4.4, 2.1 Hz, 1H), 2.72 – 2.59 (m, 1H), 2.46 – 2.33 (m, 2H), 2.14 (s, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.05 – 1.91 (m, 3H), 1.73 – 1.47 (m, 3H), 1.39 (s, 3H), 1.23 (s, 3H), 0.95 (s, 3H). 

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃): δ207.91, 171.02, 90.02, 76.02, 71.71, 41.39, 37.40, 35.80, 35.68, 30.53, 27.45, 26.25, 25.37, 24.71, 21.49, 21.27.

实施例2  MTT比色法检测降倍半萜过氧化合物Ⅰ和Ⅱ抗肿瘤活性实验

1.材料：

1.1噻唑蓝（MTT）：用0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解MTT（3-(4,5-dimethythiazol-z-yl)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, SIGMA）终浓度5mg/mL，过滤除菌，分装后4℃避光保存。

1.2靶细胞的制备：人乳腺癌细胞系MDA-MB-435和MCF7、人前列腺癌细胞系PC-3、子宫颈癌细胞系Hela、人肝癌细胞系HepG2和人正常乳腺细胞系MCF-10A的复苏与培养。 

a. 从液氮罐中取出人乳腺癌细胞系MDA-MB-435和MCF-7，人前列腺癌细胞系PC-3, 子宫颈癌细胞系Hela，人肝癌细胞系HepG2和人正常乳腺细胞系MCF-10A的冻存管，迅速置入37℃水浴箱中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中； 

b. 加DMEM完全培养液至10mL，1000rmp离心5min，弃上清；

c. 重复以上操作一次；

d. 以DMEM完全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％CO₂，37℃培养；

e. 观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。

1.3 细胞计数 

a. 选取对数生长期细胞，胰酶消化，DMEM完全培养基终止，移入离心管中，加DMEM完全培养基至10mL；

b. 取10μl细胞悬液滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘10⁴，即为每毫升培养液所含细胞数；

c. 调整细胞数至1×10⁵/mL。

1.4降倍半萜过氧化合物Ⅰ和Ⅱ的配制：取降倍半萜过氧化合物Ⅰ和Ⅱ加入到DMEM完全培养基中，调整浓度为500μg/mL，超声乳化，过滤除菌，4℃保存。 

2.试验方法 

a. 96孔板各孔加入人乳腺癌细胞系MDA-MB-435和MCF-7，人前列腺癌细胞系PC-3, 子宫颈癌细胞系Hela，人肝癌细胞系HepG2和人正常乳腺细胞系MCF-10A 100μL（1×10⁵/mL），5％CO₂，37℃培养4h。

b. 加入不同浓度受试对象100 μL，对照加DMEM完全培养基100 μL，继续培养48h。 

c.加入MTT（5mg/mL）各10 μL，继续培养4h。 

d.去除培养液。每孔加入DMSO100 μL，轻轻振荡5～10min，使颗粒溶解。 

e.酶联免疫仪570nm下测定每孔OD值。 

f.计算抑制率：  

肿瘤细胞杀伤率％＝[（对照组测定的平均OD值－加药组测定的平均OD值）/ 对照组测定的平均OD值]×100％。

g. 以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC₅₀值；以lg c为横坐标，抑制率为纵坐标，求得IC₅₀值。 

3.试验结果 

试验结果显示降倍半萜过氧化合物Ⅰ和Ⅱ均能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-435和MCF-7，人前列腺癌细胞株PC-3, 子宫颈癌Hela，人肝癌细胞株HepG2，化合物Ⅰ和Ⅱ的抑制肿瘤 IC₅₀值（μg/mL）见表1。

表1化合物Ⅰ和Ⅱ的体外细胞毒试验结果(IC₅₀ μg/mL) 

Claims (3)

1.一种真菌，分类命名为Talaromyces sp. HN21-3C，该菌于2010年10月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为M 2010266。

2.一种降倍半萜过氧化合物的制备方法，所述降倍半萜过氧化合物的结构式如（Ⅰ）或（Ⅱ）：

所述制备方法包含以下步骤：

（1）真菌Talaromyces sp. HN21-3C的种子培养，培养基组成及重量份数为：葡萄糖0.3～2.5，酵母提取物0.03～0.2，蛋白胨0.1～0.5，琼脂1.5～2.5，氯化钠1.5～4，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，28～35℃培养7～10天；

（2）真菌Talaromyces sp. HN21-3C的发酵培养，发酵培养基组成及重量份数为：葡萄糖0.5～5，酵母提取物0.2～1，蛋白胨0.5～2，氯化钠1.5～5，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于25～35℃静置1～2个月；

（3）将步骤（2）得到的发酵液和菌体离心，除去发酵液，得到菌丝体；

（4）将菌丝体用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，得到浸膏，对浸膏进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集10％～50％乙酸乙酯/石油醚洗脱液；

（5）将步骤（4）得到的洗脱液以30%的乙酸乙酯-石油醚为洗脱液进行凝胶柱层析分离，重结晶纯化，得到化合物Ⅰ和Ⅱ。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（4）中所述有机溶剂为甲醇、乙酸乙酯或丙酮。