CN102070599B - 降倍半萜过氧化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

降倍半萜过氧化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了降倍半萜过氧化合物及其制备方法与应用。本发明发现了从一种海洋真菌Talaromyces sp.HN21-3C CCTCCNo:M2010266中分离的一类新的降倍半萜过氧化合物具有潜在药用价值。海洋真菌生存环境特殊,具有特殊的代谢机制,能产生结构新颖的活性代谢产物,从海洋真菌提取的方法简单;制备成本低廉;新的降倍半萜过氧化合物来源丰富;抗肿瘤活性高,应用前景广阔。

Description

降倍半萜过氧化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物化合物领域,具体涉及一类源于真菌的具有抗肿瘤活性新的降倍半萜过氧化合物及其制备方法,以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
海洋微生物种类繁多,来源广泛,筛选获得率高,海洋微生物与其它海洋生物相比,最大的优势就是对环境友好,具有可持续性发展特征。海洋微生物生活在特殊环境之中,已发展出独特的代谢方式,能够产生结构新颖的活性代谢产物。根据John教授在2010年《Natural Product Reports》的报道,2008年发现海洋天然产物新化合物首次突破1千种(1065种),来源于海洋微生物的代谢产物占21.69%(231种),是海洋来源代谢产物是主要来源之一,成为当今国际上研究的热点。
红树林生态系是世界上最富多样性、生产力最高的海洋生态系之一。红树林沼泽区有充足的植物材料,有丰富的浮游藻类和浮游生物,这些条件正适合于为微生物的繁殖。在过去的十几年里,红树林栖息地被证明是真菌新种属的丰富来源。
本发明所用的真菌Talaromyces sp. HN21-3C, 已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国武汉大学校内),保藏号为  CCTCC No:M 2010266,保藏日为2010年10月15日。其保藏证明和存活证明已经在申请号201010594029.9的中国发明专利中提交了。
发明内容
本发明的目的在于提供一类来源于海洋红树林内生真菌的一类新的降倍半萜过氧化合物。
本发明的另一个目的是提供上述新的降倍半萜过氧化合物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述降倍半萜过氧化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
2010年,发明人从南海海洋真菌 Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266的液体培养的发酵液中,分离得到两种新的降倍半萜过氧化合物,具有抗肿瘤活性,已经申请专利,申请号:201010594029.9,申请日期:2010.12.17。发明人改用固体发酵,从固体培养菌体中,又提取分离得本发明的两种新的降倍半萜过氧化合物1和2,与发明专利201010594029.9的两种化合物互为C-7差向异构体。结构分别如(Ⅰ)所示。
Figure 574902DEST_PATH_IMAGE001
     
化合物1                        化合物2
                            (Ⅰ)
本发明所用的真菌Talaromyces sp. HN21-3C, 已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国武汉大学校内),保藏号为  CCTCC No:M 2010266,保藏日为2010年10月15日。其保藏证明和存活证明已经在申请号201010594029.9的中国发明专利中提交了。
    本发明新的降倍半萜过氧化合物1和2可从真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No:M 2010266 的固体发酵培养菌体提取分离得到,制备方法的具体步骤如下:
(1)真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266的种子培养:
培养基组成按重量比为:葡萄糖0.3~2.5,酵母提取物0.03~0.2,蛋白胨0.1~0.5,琼脂1.5~2.5,氯化钠1.5~4,水100;
制成试管斜面,挑取菌株接入斜面,28~35℃ 培养7~10天;
(2)真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266的发酵培养:
利用固体大米培养基发酵,发酵培养基:大米:海水=1:1~1.5; 
将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基,于室温25~35℃静置1~2个月;
(3)将上述培养好的发酵菌体用甲醇或乙酸乙酯或丙酮萃取多次,浓缩萃取液,将获得的浸膏利用硅胶柱中进行色谱分离,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱;
(4)收集10%-50%乙酸乙酯/石油醚洗脱液,30%的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液,再以凝胶柱层析分离,重结晶纯化,即得到无色固体化合物1和无色颗粒晶体化合物2。
本发明经试验证明,新的降倍半萜过氧化合物1和2能有效抑制5种肿瘤细胞株的生长,可用于制备抗肿瘤药物,可以是药物上可接受的任意一种剂型。
与现有抗肿瘤药物相比,本发明具有如下有益效果:本发明新的降倍半萜过氧化合物1和2来源于海洋真菌,海洋真菌种类繁多、数量庞大,从真菌提取的方法简单,新的降倍半萜过氧化合物1和2来源丰富、制备成本低廉;降倍半萜过氧化合物1和2抗肿瘤活性高,应用前景广阔。
具体实施方式
实施例1  降倍半萜过氧化合物的制备方法
a.真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No:M 2010266  的种子培养:
培养基组成按重量比为:葡萄糖0.3,酵母提取物0.2,蛋白胨0.5,琼脂2,氯化钠3,水100;制成试管斜面,挑取菌株接入斜面,30℃ 培养10天;
b.真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No:M 2010266的发酵培养:
利用固体大米培养基发酵,发酵培养基:大米:海水=1:1;将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基,于室温35℃静置2个月;
c. 将上述培养好的菌体体用甲醇或乙酸乙酯或丙酮萃取多次,浓缩萃取液,将获得的浸膏利用硅胶柱中进行色谱分离,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱;
d. 收集10%-50%乙酸乙酯/石油醚洗脱液,30%的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液,再以凝胶柱层析分离,重结晶纯化,即得到无色固体化合物1和无色颗粒晶体化合物2。
 化合物1和2的试验数据:
化合物1: C14H20O4,HRESI-MS:275.1261(M+Na)+(计算值275.1259), mp 120–122℃. IR ν/cm-1(KBr): 2961, 2922, 1736, 1716, 1469, 1378, 1066, 1044.
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ4.21 (dd, J = 4.1, 1.8 Hz, 1H), 2.93 – 2.81 (m, 2H), 2.70 (ddd, J = 14.3, 4.0, 2.1 Hz, 1H), 2.53 – 2.42 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 2.20 – 2.01 (m, 2H), 1.94 (s, 3H), 1.88 – 1.79 (m, 2H), 1.67 (m, 1H), 1.30 (s, 3H), 1.05 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ207.7, 207.4, 90.6, 80.7, 43.7, 38.6, 36.5, 36.4, 35.5, 27.4, 26.6, 25.7, 24.7, 23.0.
化合物2: C16H24O5,HRESI-MS:319.1525 (M+Na)+(计算值319.1521) , mp 91–93℃. IR ν/cm-1(KBr): 2969, 2878, 1720, 1382, 1247, 1102, 931.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 4.88 (m, 1H), 4.30 (m, 1H), 2.81 (m, 1H), 2.69 – 2.46 (m, 2H), 2.35 – 2.26 (m, 1H), 2.08 (s, 3H), 2.06 – 1.96 (m, 2H), 1.90 (s, 3H), 1.86 (m, 1H), 1.77 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 1.67 (m, 1H), 1.40 (m, 1H), 1.25 (s, 3H), 0.99 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ208.1, 171.3, 89.8, 77.3, 72.8, 43.3, 37.0, 36.1, 35.5, 28.3, 28.1, 27.5, 26.3, 25.2, 24.2, 21.4.
实施例2  MTT还原法检测降倍半萜过氧化合物1和2抗肿瘤活性试验
1.材料:
1.1四脞盐(MTT):用0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4,5-dimethythiazol-z-yl)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, SIGMA)终浓度5mg/mL,过滤除菌,分装后4℃避光保存。
1.2靶细胞的制备:人乳腺癌细胞株MDA-MB435和MCF7,人前列腺癌细胞株PC-3, 子宫颈癌Hela,人肝癌细胞株HepG2和人正常乳腺细胞MCF-10A的复苏与培养。
a.从液氮罐中取出人乳腺癌细胞株MDA-MB435和MCF7,人前列腺癌细胞株PC-3, 子宫颈癌Hela,人肝癌细胞株HepG2和人正常乳腺细胞MCF-10A的冻存管,迅速置入37℃水浴中,不停摇动使之迅速溶化,无菌操作移入离心管中;
b.加全培养液至10mL,1000rmp 离心5s,弃上清;
c.重复以上操作一次;
d.以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中,5% CO2,37℃培养;
e.观察细胞生长情况,及时更换培养液,分瓶。
1.3 细胞计数
a.选取对数生长期细胞,胰酶消化,全培养终止,移入离心管中,加全培至10mL;
b.取一滴滴入计数板一侧凹槽中,显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4,乘104,即为每毫升培养液所含细胞数;
c.调整细胞数至1×105/mL;
1.4降倍半萜过氧化合物1和2的配制:取一定量的化降倍半萜过氧化合物1和2加入到全培中,调整浓度为500μg/mL,超声乳化,过滤除菌,4℃保存。
2.试验方法
a.96孔板各孔加入人乳腺癌细胞株MDA-MB435和MCF7,人前列腺癌细胞株PC-3, 子宫颈癌Hela和人肝癌细胞株HepG2 100 μL(1×105/mL),5% CO2,37℃培养4hr。
b.加入不同浓度受试对象100 μL,对照加全培100 μL,继续培养48hr。
c.加入MTT(5mg/mL)各10 μL,继续培养4hr。
d.去除培养液。每孔加入DMSO100 μL,轻轻振荡5-10min,使颗粒溶解。
e.酶联免疫仪570nm下测定每孔OD值。
f.计算抑制率:  肿瘤细胞杀伤率%=
[(对照组测定的平均OD值 - 加药组测定的平均OD值)/ 对照组测定的平均OD值]×100%
g.以抑制率对药物浓度的对数作图,求得IC50
   以lg c为横坐标,抑制率为纵坐标,求得IC50
3.试验结果
验结果显示降倍半萜过氧化合物1和2均能有效抑制人乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB435,人前列腺癌细胞株PC-3, 子宫颈癌Hela,人肝癌细胞株HepG2,化合物1和2的抑制肿瘤 IC50值(μM)见表1。
表1化合物1和2的体外细胞毒试验结果(IC50 μg/mL) 
Figure 302162DEST_PATH_IMAGE002

Claims (3)

1. 一类降倍半萜过氧化合物,其结构式如式(Ⅰ):
Figure 2011100314876100001DEST_PATH_IMAGE001
     
化合物1                                        化合物2
(Ⅰ)。
2.权利要求1所述降倍半萜过氧化合物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266的种子培养:
培养基组成按重量比为:葡萄糖0.3~2.5,酵母提取物0.03~0.2,蛋白胨0.1~0.5,琼脂1.5~2.5,氯化钠1.5~4,水100;
制成试管斜面,挑取菌株接入斜面,28~35℃ 培养7~10天;
(2)真菌Talaromyces sp. HN21-3C CCTCC No: M 2010266的发酵培养:
利用固体大米培养基发酵,发酵培养基:大米:海水=1:1~1.5;
将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基,于室温25~35℃静置1~2个月;
(3)将上述培养好的菌体用甲醇或乙酸乙酯或丙酮萃取多次,浓缩萃取液,将获得的浸膏利用硅胶柱进行色谱分离,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱;
(4)收集10%-50%乙酸乙酯/石油醚洗脱液,30%的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液,再以凝胶柱层析分离,重结晶纯化,即得到无色固体化合物1和无色颗粒晶体化合物2。
3.权利要求1所述降倍半萜过氧化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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