CN101362745A

CN101362745A - Xanthenes类化合物及其制备方法与抗肿瘤应用

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Publication number: CN101362745A
Application number: CNA2008101985236A
Authority: CN
Inventors: 佘志刚; 林永成; 李静; 蔡小玲; 符立梧; 梁永钜
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2008-09-16
Publication date: 2009-02-11

Abstract

本发明涉及药物化合物领域，公开了一种Xanthenes类化合物及其制备方法与应用。本发明从南海海洋真菌Talaromyces spSBE－14的发酵菌体和发酵培液中提取分离得到一种黄色的Xanthenes类化合物及橙黄色的二氯衍生物，均能有效抑制肿瘤细胞株的生长，能用于开发抗肿瘤药物，应用前景广阔。

Description

Xanthenes类化合物及其制备方法与抗肿瘤应用

技术领域

本发明涉及药物化合物领域，具体涉及一种来自海洋真菌的Xanthenes类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

海洋微生物总量在500～1000万种之间，远远超出原来20万种的估计，也远远超出全球动植物种类的总和。由于海洋微生物生活在特殊环境之中，具有与陆地不同的独特的代谢方式，能产生结构新颖的活性代谢产物，为药物开发提供了多种模式化合物。

20世纪50年代，首次从海洋真菌发现了头孢菌素C，具有与青霉素有不同的作用机理，接着经过结构修饰，发展到现在第4代30多个临床使用的头孢菌素抗生素，成了目前第1大类最重要的抗生素。对头孢菌素的研究仍然连续不断，2001年美国FDA又批准了新一代广谱口服头孢菌素上市(ME1207)。头孢菌素药物是从海洋微生物乃至海洋生物开发临床药物最成功的一个例子。据申请者粗略统计，至2003年就有1000多种结构新颖的活性强的代谢产物被发现，例如最近从蓝细菌Symploca hydnoides，发现的非常强的抗癌物质其抗P-388，A-549，and HT-29的IC₅₀达0.2-0.5ng/mL；从细菌Bacillus cereus QN03323分离得到的两个新的抗菌素，其抗staphylococci and enterococci的MICs达0.02和1.56μg mL^-1等。故此，人们对从海洋微生物能找到新的特效药物寄予极大的希望。

根据国际著天然产物名杂志NPR 2008年报道，在发现海洋天然产物新化合物中，海洋微生物是主要来源之一，成为当今国际上研究的热点。海洋微生物也将成为21世纪开发新型医药品的资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于海洋红树林真菌的具有抗肿瘤活性的Xanthenes化合物。

本发明的另一个目的是提供上述Xanthenes化合物的制备方法。

本发明的进一步目的是提供上述Xanthenes类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明从南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14(以下简称真菌SBE-14)的发酵培养物中提取分离得到一种黄色的Xanthenes类化合物，其结构式如式(I)：其中R为OH或Cl。

当R为OH时，Xanthenes类化合物为STb；当R为Cl，Xanthenes类化合物为STb-C。

本发明所用的真菌SBE-14已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M207195，保藏日为2007年12月10日。该真菌SBE-14已记载在公开号为CN101215283，公开日期为2008.07.09的中国发明专利上。

本发明的Xanthenes化合物可从真菌SBE-14的发酵培养液中提取分离得到，制备方法的具体步骤如下：

a.南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖0.3-2.0，酵母提取物0.02-0.25，蛋白胨0.001-0.5，琼脂0.1-2.5，氯化钠0.5-3.5，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，28-32℃培养5-7天；

b.南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖2-20，酵母提取物0.5-5，蛋白胨0.1-6，氯化钠1-8，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置25～45天；

c.将上述培养好的发酵液过滤得到菌体和培养液；菌体和培养液分别处理；

d.在温度不超过50℃条件下，将培养液加热浓缩至原液体积的1/10-1/2，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；

e.培养液浸膏经过柱层析后，收集40％～90％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶STb(R＝OH)；

f.将菌体风干，用甲醇浸泡，提取液浓缩成浸膏，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集40％～90％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶STb(R＝OH)。

STb的二氯衍生物是由STb经过Vilsmeier反应(POCl₃/DMF)，得到STb-C(R＝Cl)，制备方法的具体步骤如下：

将STb和DMF混合，加入0.5～3倍摩尔的POCl₃，加热回流，TLC跟踪，直至原料消失，用柱色谱，收集50～100％，用乙酸乙酯和环己烷进行重结晶，得到橙黄色的晶体STb-C(R＝Cl)。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明经试验证明，Xanthenes类化合物STb和STb-C均能有效抑制肿瘤细胞株的生长，能用于开发抗肿瘤药物，应用前景广阔。

具体实施方式

实施例1 化合物STb和衍生物STb-C的分离制备方法

(1)南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖2.0，酵母提取物0.02，蛋白胨0.4，琼脂2.0，氯化钠2.5，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30℃培养6天；

(2)南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖10，酵母提取物4，蛋白胨3，氯化钠5，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温30℃静置30天；

(3)将上述培养好的发酵液过滤得到菌体和培养液；菌体和培养液分别处理；

(4)在温度50℃条件下，将培养液加热浓缩至原液体积的1/10，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；

(5)培养液浸膏经过柱层析后，收集40％～90％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶STb；

(6)将菌体风干，用甲醇浸泡，提取液浓缩成浸膏，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集40％～90％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶STb(R＝OH)。

(7)STb的二氯衍生物是由STb经过Vilsmeier反应(POCl₃/DMF)，得到STb-C，制备方法的具体步骤如下：

将STb和DMF混合，加入3倍摩尔的POCl₃，加热回流，TLC跟踪，直至原料消失，用柱色谱，收集50～100％，用乙酸乙酯和环己烷进行重结晶，得到橙黄色的晶体STb-C(R＝Cl)。

STb为黄色针状结晶，熔点为230-231℃，易溶于乙腈，THF，微溶于甲醇/氯仿，氯仿和乙酸乙酯，不溶于水。元素分析显示C60.01％，H4.32％(理论值C 60.19％，H 4.74％，O 35.08％)。FABMS显示分子离子峰为639[M+1]⁺。

¹H NMR(DMSO，500MHz)：δ 7.43(2H，d，8.5Hz)，6.62(2H，d，8.5Hz)，3.80(2H，d，11.0Hz)，2.65(2H，dd，6.0，6.0Hz)，2.30，2.44(4H，m)，1.03(6H，d，6.5Hz)，3.59(6H，s)，11.57(2H，br s)，2.05(2H，br s)，13.56(2H，br s)，

¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)：δ158.6，117.5，140.3，107.7，159.0，75.5，29.9，35.9，178.3，101.8，186.7，106.4，85.3，17.9，170.2，52.9

STb-C：橙黄色结晶，熔点156-157℃.易溶于乙腈，THF，DMSO，DMF，微溶于甲醇/氯仿，氯仿和乙酸乙酯，不溶于水。ESI-MS显示分子离子峰为：675[M+1]⁺，EI：674[M]⁺，分子量为674。

¹H NMR(DMSO，500MHz)：1.16(d，6.3Hz，6H)，2.05(2H)，2.54，2.48(m，4H)，2.89(dd，4.2Hz，11.1Hz，2H)，3.98(d，11.1Hz，2H)，6.60(d，8.4Hz，2H)，7.50(d，8.4Hz，2H)，3.75(s，6H)，12.44(2H).

实施例2 MTT还原法检测化合物STb和STb-C抗肿瘤活性试验

1、材料：

1.1 四脞盐(MTT)：用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，SIGMA)终浓度5mg/mL，过滤除菌，分装后4℃避光保存。

1.2 靶细胞的制备(以KB细胞为例)：以KB细胞的复苏与培养：

a.从液氮罐中取出人肝癌细胞株KB细胞的冻存管，迅速置入37℃水浴中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；

b.加全培养液至10mL，1000rmp离心5s，弃上清；

c.重复以上操作一次；

d.以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％CO₂，37℃培养；

e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。

1.3 细胞计数：

a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，全培养终止，移入离心管中，加全培至10mL；

b.取一滴滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘10⁴，即为每毫升培养液所含细胞数；

c.调整细胞数至1×10⁵/mL；

1.4 化合物E和F的配制：分别取化合物E和F加入到全培中，调整浓度为500μg/mL，超声乳化，过滤除菌，4℃保存。

2.试验方法(以KB细胞为例)

a.96孔板各孔加入KB细胞100μL(1×10⁵/mL)，5％CO₂，37℃培养4hr。

b.加入不同浓度受试对象100μL，对照加全培100μL，继续培养48hr。

c.加入MTT(5mg/mL)各10μL，继续培养4hr。

d.去除培养液。每孔加入DMSO100μL，轻轻振荡5—10min，使颗粒溶解。

e.酶联免疫仪570nm下测定每孔OD值。

f.计算抑制率

肿瘤细胞杀伤率％＝[(对照组测定的平均OD值—加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值]×100％

g.以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC₅₀值

以1g c为横坐标，抑制率为纵坐标，求得IC₅₀值

多药耐药口腔癌细胞株KBv200的试验方法同上。

3.试验结果

试验结果显示化合物STb和STb-C均能有效抑制口腔癌细胞株KB，多药耐药口腔癌细胞株KBv200。它们的IC₅₀值(μg/mL)见表1。

表1、STb和STb-C的体外细胞毒试验结果(IC₅₀μg/mL)

细胞株	STb	STb-C
细胞株	STb	STb-C	口腔癌细胞株KB	0.25	1.6
耐药口腔癌细胞株KBv200	0.39	1.1	口腔癌细胞株KB	0.25	1.6

Claims

1.Xanthenes类化合物，其结构式如式(I)：

其中R为OH或Cl。

2.如权利要求1所述的Xanthenes类化合物，其特征在于R为OH。

3.如权利要求1所述的Xanthenes类化合物，其特征在于R为Cl。

4.权利要求1所述Xanthenes类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖0.3-2.0，酵母提取物0.02-0.25，蛋白胨0.001-0.5，琼脂0.1-2.5，氯化钠0.5-3.5，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，28-32℃培养5-7天；

(2)南海海洋真菌Talaromyces sp SBE-14的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖2-20，酵母提取物0.5-5，蛋白胨0.1-6，氯化钠1-8，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置25～45天；

(3)将上述培养好的发酵液过滤得到菌体和培养液；

(4)在温度40～70℃条件下，将培养液加热浓缩至原液体积的1/10-1/2，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；

(5)培养液浸膏经过柱层析后，收集40％～90％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶；

(6)将菌体风干，用甲醇浸泡，提取液浓缩成浸膏，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集40％～90％的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，70％的乙酸乙酯/甲醇为洗脱液，再以丙酮进行重结晶纯化，即得到黄色针状结晶；

(7)黄色针状结晶经过Vilsmeier反应，具体步骤如下：

将黄色针状结晶和DMF混合，加入0.5～3倍摩尔的POCl₃，加热回流，TLC跟踪，直至原料消失，用柱色谱，收集50～100％，用乙酸乙酯和环己烷进行重结晶，得到橙黄色的晶体。

5.权利要求1所述的Xanthenes类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。