CN101423521A

CN101423521A - 两种异黄酮类化合物制备方法及其抗肿瘤与抗植物病菌用途

Info

Publication number: CN101423521A
Application number: CNA2008101851903A
Authority: CN
Inventors: 方玉春; 朱天骄; 王长云; 孙丽萍; 尹志伟; 侯捷
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2008-12-18
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2009-05-06

Abstract

本发明涉及两种异黄酮类化合物的制备方法及其抗肿瘤与抗植物病菌用途。本发明用采自海绵及鱼藤内生真菌YT2－02次级代谢产物生产出两种异酮类结构化合物。经生物活性试验证实，这两种异酮类结构化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗植物病菌剂。

Description

两种异黄酮类化合物制备方法及其抗肿瘤与抗植物病菌用途

技术领域：

本发明涉及用内生真菌YT2-02生产两种异酮类化合物的生产方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。

背景技术：

有关异黄酮类化合物的文献报道较多，但是从内生真菌发酵培养液中分离制备这类化合物未见报道。本发明人研究得知，内生真菌YT2-02液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞增值抑制活性，遂对其活性成分进行了研究。研究发现所示异黄酮类化合物具有抗肿瘤活性和抗植物病菌作用，目前尚未见从内生真菌中分离培养制备具有细胞增殖抑制活性的异黄酮化合物的报道，抗肿瘤药物市场上也尚未见有与此有关的药物。

发明内容：

本发明旨在提供两种具有很强的细胞增殖抑制抗肿瘤活性与抗植物病菌的化合物的新制备途径。两种化合物的结构式分别是：

化合物I 化合物II

本发明采用MTT法测试了化合物I II对HCT-8、A549、BEL-7402、BGC-823和A2780细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，化合物I II对这两种肿瘤细胞均有抗肿瘤作用；本发明采用碟纸片法测得化合物抗真菌活性。化合物I II对几种植物致病菌生长均有抑制活性。

因此本发明的化合物I II可用作肿瘤细胞细胞增殖抑制剂或化合物I II可用于生物农药。

本发明的化合物I II可通过微生物发酵培养来获取，含有该异黄酮类化合物的发酵物，经硅胶柱层析、制备HPLC等方法分离纯化得到。

本发明的下述实施例中列举了利用内生真菌YT2-02制备本发明式化合物I II实例及化合物I II抑制多种肿瘤细胞增殖抑制和抑制植物病菌实例。

本发明的内生真菌采自广西北海围洲岛海绵样品及鱼藤根中分离得到的一株代号为YT2-02的内生真菌，该菌株微生物具有形状球形，丰茂的白色气生菌丝，分生孢子梗分枝次数为2-3次。

需要特别说明的是化合物I II结构中含有多个手性碳，目前尚不能大规模的合成生产；文献报道化合物I在植物中含量非常低，也不适宜大量生产获取；化合物I II具有抑制多种肿瘤细胞增殖活性及抑制植物病菌活性。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物I II的化学结构分别是：

实施例1 化合物I II的发酵生产及分离精制

1 发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取内生真菌YT2-02适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养3天。

取斜面培养3天的内生真菌YT2-02适量，接种到装有120mL培养液[培养基组成(克/升)：麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH₂PO₄ 0.5，MgSO₄ 0.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL锥型瓶中，在28℃、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获得内生真菌的种子培养液。按10％接种量将该种子培养液接种于装有200毫升优化后的生产培养液，培养基组成(克/升)：可溶性淀粉30g，蔗糖10g，麦芽糖20g，蛋白胨6g，酵母膏2g，黄豆粉4g，谷氨酸钠0.5g，七水硫酸镁0.08g，磷酸二氢钾1.2g，装载于28℃、140转/分钟的摇床上，进行为期10天的生产发酵，获得菌丝体和发酵液。

2 浸膏的获得

用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓缩至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。发酵液减压浓缩为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共48.0克。

3 化合物的分离精制

浸膏(48.0克)用氯仿-甲醇(9:1)混合溶剂溶解后，加100克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以环己烷、环己烷-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为10个流份。Fr-2(12g，氯仿-甲醇50：1洗脱物)，以氯仿-甲醇(20：1)为溶剂进行硅胶柱层析，再经HPLC以甲醇-水(70：30)为溶剂得化合物I(折算得3.6g)；Fr-3(4.8克，氯仿-甲醇15：1洗脱物)，再经半制备HPLC(甲醇-水65：35)得化合物II(折算得2.1g)。

化合物I为无色丝状晶体，m.p.198～199℃，[α]25 D＝-22°(c 0.024，C6H6)。ESI-MS在m/z 393、433、843处给出[M-H2O+H]+、[M+Na]+[2M+Na]+离子峰，其核磁共振氢谱数据和碳谱数据与tephrosin文献一致(表1)。

化合物II为无色片状晶体，m.p.162～164℃，[α]25 D＝-228°(c 0.024，C6H6)。ESI-MS在m/z 394处给出[M+H]+准分子离子峰。其核磁共振氢谱数据和碳谱数据与rotenone文献一致(表1)。

Table 1 NMR data of compound I II

^a 1H and¹³C NMR were obtained at 600MHz and 150MHz in CDCl₃ at room temperature，respectively.

本发明采用MTT法测试了式I-II化合物对HCT-8、A549、BEL-7402、BGC-823和A2780细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，式I-II化合物对这两种肿瘤细胞均有抗肿瘤作用；本发

实施例2 抗肿瘤活性的测试

1 实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物I II。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。

细胞系及细胞的继代培养：活性测试采用HCT-8、A549、BEL-7402、BGC-823和A2780细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在37℃通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。

细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)

本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。

活性测试时，取对数生长期的HCT-8、A549、BEL-7402、BGC-823和A2780细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5×10⁴个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150μL培养液后加入150μL DMS0溶解formazan，在540nm处测定其吸收度。按照IR％＝(OD_空白 _对照-OD_样品)/OD_空白对照 X 100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。

2 实验结果

表1 化合物I II对肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50(mol·L-1)

Tablel IC50 values of compound I II against cancer cells(mol·L-1)

实施例3 抗肿瘤活性的测试

本发明采用碟纸片法测得化合物抗真菌活性如表2所示，其中鱼藤酮对几种植物致病菌生长均有抑制活性，对葡萄白腐病菌抑制率可达61.1％。

表2 纯化合物对病菌菌丝生长的抑制作用

Table2 Inhibition of compound against plant pathogen

4 结论

化合物I II对包括人在内的哺乳动物来源的癌细胞具有抗肿瘤作用，化合物I对葡萄白腐病菌，苹果腐烂病菌，化合物II对苹果轮纹病菌有很好的抑制作用

因此化合物I II可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于抗肿瘤的研究中，具有开发为抗肿瘤药物的潜力；也可作为生物农药来开发应用。

Claims

1.化合物I II化合物

化合物I 化合物II

2.权利要求1所述式I II化合物的制备方法，其特征是发酵培养内生真菌YT2-02，获取含有述式I II化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式化合物I II。

3.权利要求2所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以环已烷、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱；其中氯仿-甲醇50：1洗脱部分，以氯仿-甲醇20：1为溶剂进行硅胶柱层析，再经HPLC以甲醇-水70：30为溶剂分离得到式I II化合物。

4.权利要求2所述式I II化合物的制备方法，其特征是发酵培养内生真菌YT2-02的新型培养基，，每升所述新型培养基包括：可溶性淀粉20～100g，蔗糖10～100g，麦芽糖20～100g，蛋白胨0.5-6g，酵母膏0.3-6g，黄豆粉0.2-4g，谷氨酸钠0.5-10g，七水硫酸镁0.01-1g，磷酸二氢钾0.01-2g，其余为人工海水，还提供了其制备方法。本发明的原料易得、成本低、制备方法简单、能显著促进异黄酮化合物I II的产量，化合物III产量从原始的15mg/L提高到100mg/L，有利于大规模工业化生产，对化合物I II在医药学及生物农药研究具有重要意义。

5.权利要求1所述的化合物I，II在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途。

6.权利要求1所述化合物I II在制备抗肿瘤药物中的用途。

7.权利要求1所述化合物I II在抗植物有害病菌增殖药物中的用途。

8.权利要求1所述化合物I II在生物农药中的用途。