CN103288847B

CN103288847B - 一类具有苯并螺环缩酮和桥环缩酮化合物的制备方法及用途

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Publication number: CN103288847B
Application number: CN201310232187.3A
Authority: CN
Inventors: 刘为忠; 马丽英; 王春华; 刘德胜; 潘效红; 石寿森
Original assignee: Binzhou Medical College
Current assignee: Binzhou Medical College
Priority date: 2013-06-09
Filing date: 2013-06-09
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2033-06-09
Also published as: CN103288847A

Abstract

本发明涉及青霉缩酮A、B、C的制备方法和用途。本发明用从盐碱地土壤中分离得到的雷斯青霉菌JH-18(Penicillium raistrickii JH-18)(GenBank accession numbers：HQ717799)生产出分子中同时含有苯并螺环缩酮和苯并桥环缩酮结构的骨架新颖的化合物——青霉缩酮A、B和C。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。

Description

一类具有苯并螺环缩酮和桥环缩酮化合物的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及用雷斯青霉菌JH18(Penicillium raistrickii JH18)(GenBank accession numbers：HQ717799)制备分子中同时具有苯并螺环缩酮与苯并桥环缩酮化合物——青霉缩酮A（peniciketal A）、B（peniciketal B）和C（peniciketal C）的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。

背景技术

螺环缩酮类化合物广泛存在于自然界中，如植物、真菌、海洋生物、昆虫等（Perron,F.,Albizati,K.F.Chemistry of spiroketals.Chem.Rev.1989,89:1617-1661），根据螺环的结构分为5,5-、5,6-和6,6-螺环，其中6,6-螺环缩酮类化合物非常少，尤其是芳环稠合的6,6-螺环缩酮类化合物极其罕见(Spery,J.,Wilson,Z.E.,Rathwell,D.C.K.R.,Brimble,M.A.Nat.Prod.Rep.2010,27:1117-1137;Li,J.;Si,Y.;Jiang,X.;Guo,L.;Che,Y.Org.Lett.2011,13:2670-2673)。螺环缩酮类化合物具有广泛的生物活性。本发明人研究发现雷斯青霉菌(P.raistrickii)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞周期抑制活性，遂对其活性成分进行了研究，结果发现了三个分子中同时含有苯并螺环缩酮和苯并桥环缩酮结构的骨架新颖的化合物，它们具有较强的抗肿瘤活性，目前尚未见对该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种全新化学骨架结构的具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的新化合物。目的之二在于提供了用雷斯青霉菌(P.raistrickii)制备该类新化合物的方法。目的之三在于提供该类新化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。

本发明于2008年从盐碱地土壤中分离得到雷斯青霉菌(P.raistrickii)，并保存于滨州医学院化学教研室。在对其发酵物化学成分研究的过程中发现了三个同时含有苯并桥环缩酮和苯并螺环缩酮结构的骨架新颖的化合物，如式Ⅰ和式Ⅱ所示：

其结构特征是：式Ⅰ和式Ⅱ均含有苯并桥环缩酮的结构片段，式Ⅰ还含有苯并6,6-螺环缩酮的骨架，式Ⅱ还含有苯并5,6-螺环缩酮的骨架。式Ⅰ和式Ⅱ都含有苯甲醛的结构片段，其中R₁、R₂、R₃和R₄可以为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。式Ⅰ和式Ⅱ是全新骨架的化合物。

上述发明中最优选的化合物是由盐碱地土壤来源的雷斯青霉菌(P.raistrickii)的液体发酵物经正反相硅胶柱层析、薄层层析、葡聚糖凝胶LH20和高压液相色谱等现代色谱分离技术分离得到。经核磁共振谱、质谱、红外光谱、紫外光谱、CD谱和X-射线等技术确定其结构。

本发明采用MTT法测试了式Ⅰ和式Ⅱ化合物对A549、HL-60和K562细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，式Ⅰ和式Ⅱ化合物对这三种肿瘤细胞均有增殖抑制和杀伤作用。因此本发明的式Ⅰ和式Ⅱ化合物可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。

式Ⅰ和式Ⅱ化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。

式Ⅰ和式Ⅱ化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式Ⅰ和式Ⅱ化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。

本发明的式Ⅰ和式Ⅱ化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化而得到；也可用化学方法合成获得。

需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式Ⅰ和式Ⅱ化合物的方法可采用其它任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为生产菌用于制备式Ⅰ和式Ⅱ化合物。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物青霉缩酮A（peniciketal A）、青霉缩酮B（peniciketal B）和青霉缩酮C（peniciketal C）的化学结构分别是（结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位）：

青霉缩酮A（R=OH）；青霉缩酮C

青霉缩酮B（R=H）

实施例1青霉缩酮A、B和C的发酵生产及分离精制

1发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取雷斯青霉菌(P.raistrickii)(GenBank accession numbers：HQ717799)适量，接种到PDA斜面培养基上，在28℃的条件下，培养箱中培养4天。

取斜面培养4天的雷斯青霉菌(P.raistrickii)适量，接种到培养皿平板上，28℃培养7天。取少量在培养皿平板上生长良好的孢子，接种到经121℃灭菌20分钟的装有180mL培养基的500mL锥型瓶中，在28℃转速为170r/min的条件下，摇床培养9天，获得发酵液。其中，所述培养基按照下述方法配制而成：将200g去皮土豆用适量海水煮20分钟获取浸汁，再加20g葡萄糖、10g麦芽糖、10g甘露醇、3g酵母膏、0.3g FeSO₄·7H₂O和0.5g KH₂PO₄，最后用海水定容为1L。

2浸膏的获得

用棉布将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用甲醇浸提三次，减压浓缩至不含甲醇，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取四次，减压浓缩，得粗浸膏。发酵液用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共42克。

3化合物的分离精制

浸膏（42克）用氯仿-甲醇(二者体积比为9:1)混合溶剂溶解后，加60克200-300目硅胶（青岛海洋化工集团公司产品）拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为8个馏分（Fr₁-Fr₈）。馏分Fr₂经反相硅胶柱（RP18,25-40μm,Merck），用水-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分成16个馏分（Fr_2-1-Fr_2-16）；馏分Fr_2-12以甲醇为溶剂，用葡聚糖凝胶LH20分成8个馏分（Fr_2-12-1-Fr_2-12-8），馏分Fr_2-12-4经甲醇重结晶得到命名为青霉缩酮A的新化合物65mg。馏分Fr_2-13经葡聚糖凝胶LH20后，再用半制备高压液相（75%CH₃OH,4ml/min)）纯化得命名为青霉缩酮B的新化合物1.5mg。馏分Fr_2-12-5用半制备高压液相（67.5%CH₃OH,4ml/min)）纯化得命名为青霉缩酮C的新化合物2.8mg。

青霉缩酮A:无色块状晶体;熔点184-186°C;[α]_D ²⁰+23.7(c,0.53,acetone);UV(MeOH)λ_max(lgε):292(3.81),206(4.49)nm;CD(CH₃OH)λ_max(Δε):323(-0.36),292(+0.80),239(-0.43)nm;IR(ATR)ν_max3362,2976,2926,2871,1672,1604,1495,1429,1376,1350,1296,1254,1172,1162,1121,1100,1048,996,970,929,871,850,792,743cm^-1.HRESIMS m/z539.2279[M-H]^-(C₃₀H₃₅O₉的计算值为539.2276).¹H and¹³C NMR数据见表1。青霉缩酮A的结构通过¹H and¹³NMR、H-H COSY、HSQC、HMBC、NOESY、高分辨质谱和X-射线等方法确定。

青霉缩酮A的晶体结构:分子式为C₃₀H₃₆O₉·CH₃OH，分子中含有一分子甲醇;分子量M_r=572.63,单斜晶系,P2₁空间群,晶胞参数a=8.3023(2)b=12.4556(4)c=13.7273(4)β=90.279(2)°,V=1419.53(7)晶胞内分子数Z=2,T=290(2)K,μ(Cu Kα)=0.825mm^-1,D_calc=1.340g/cm³,F(000)=612.0,晶胞的衍射点数12163(6.44≤2Θ≤133.14),独立衍射点4757(R_int=0.0120)。可观测衍射点的R₁为0.0252[I≥2σ(I)]，可观测衍射点的wR₂是0.0701。

表1.青霉缩酮A的核磁数据（400MHz，in CD₃OCD₃）

青霉缩酮B:无色的固体;[α]_D ²⁰+10.4(c,1.0,acetone);UV(CH₃OH)λ_max(lgε):292(4.18),213(4.44)nm;CD(CH₃OH)λ_max(Δε):321(-1.54),292(+3.61),237(-2.04)nm;IR(ATR)ν_max3258,2930,2900,1703,1615,1446,1372,1354,1301,1251,1163,1120,1088,1053,996,973,925,873,755cm^-1.HRESIMS m/z523.2332[M-H]^-(C₃₀H₃₅O₈的计算值为523.2326).¹H and¹³C NMR数据见表2。青霉缩酮B的结构通过¹H and¹³C NMR、¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC、NOESY、高分辨质谱和CD等方法确定。

表2.青霉缩酮B的核磁数据（500MHz，in CD₃OCD₃）

青霉缩酮C:无色的固体;[α]_D ²⁰+9.1(c,1.9,acetone);UV(CH₃OH)λ_max(lgε):292(4.14),210(4.48)nm;CD(CH₃OH)λ_max(Δε):323(-2.73),287(+3.82),237(-9.61)nm;IR(ATR)ν_max3236,2925,2900,1700,1615,1493,1436,1300,1250,1224,1170,1120,1093,1051,1027,998,983,968,940,893,839,788,757cm^-1.HRESIMS m/z525.2128[M-H]^-(C₂₉H₃₃O₉的计算值为525.2119).¹H and¹³C NMR数据见表3。青霉缩酮C的结构通过¹H and¹³C NMR、¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC、NOESY、高分辨质谱和CD等方法确定。

表3.青霉缩酮C的核磁数据（500MHz，in CD₃OCD₃）

实施例2抗肿瘤活性的测试

1实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物青霉缩酮A、B和C。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。

细胞系及细胞的继代培养：活性测试采用A549、HL-60和K562细胞系。各种细胞均用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在37°C通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。

细胞增殖抑制活性测试方法（MTT法）：

本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于甲臜的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。

活性测试时，取对数生长期的A549、HL-60和K562细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5×10⁴个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，在37°C下培养24小时后，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20μL含MTT的RPMI-1640溶液（5mg/L），再培养4小时，移出150μL培养液后加入150μL DMSO溶解甲臜，在540nm处测定其吸收度。按照IR%=(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100%式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%)。平行测定3次，求出半数抑制浓度IC₅₀值。

2实验结果

青霉缩酮A、B和C对人早幼粒白血病细胞（HL-60）显示很强的抗肿瘤活性，对慢性髓原白血病细胞（K562）呈中等的活性，对人肺腺癌细胞（A549）的活性相对较弱。青霉缩酮A、B和C具体的抗肿瘤实验结果见表4。

表4.青霉缩酮A、B和C对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC₅₀inμM)

3结论

本发明的青霉缩酮A、B和C对哺乳动物来源的癌细胞具有较好的抗肿瘤作用，具有开发为抗肿瘤药物的潜力，可作为抗肿瘤剂（即抗肿瘤药物）用于肿瘤的治疗；也可作为细胞增殖抑制的低分子生物探针用于探索生命现象本质的生命科学实验研究中。

Claims

1.一类具有苯并螺环缩酮和桥环缩酮化合物，选自化合物青霉缩酮A、青霉缩酮B和青霉缩酮C，其化学结构式分别是

2.权利要求1所述的一类具有苯并螺环缩酮和桥环缩酮化合物的制备方法，其特征是发酵培养雷斯青霉菌，获取含有上述化合物的发酵物，然后从发酵物中经正反相硅胶柱层析、薄层层析、Sephadex LH20和高压液相色谱一系列现代色谱分离技术分离纯化出化合物。

3.权利要求1所述的一类具有苯并螺环缩酮和桥环缩酮化合物在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。

4.权利要求1所述的一类具有苯并螺环缩酮和桥环缩酮化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。