CN1120832C - 抗肿瘤化合物及其制备方法和制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及式A、式B和式C化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
Description
本发明涉及一类源于真菌的具有抗肿瘤活性的醌类化合物及其制备方法，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。
自从1929年弗莱明从真菌中发现青霉素以来，真菌的代谢产物成为了药物的丰富来源，绝大多数临床应用的抗生素都来源于真菌和细菌，真菌的代谢产物还有其他的药用价值，如抗肿瘤，治疗心血管疾病，免疫调节剂，酶抑制剂等。由于海洋环境的特殊性，海洋真菌能提供陆生真菌无法提供的代谢产物。国际上已从海洋真菌中发现了一些结构独特的化合物，分别具有抗菌，抗病毒，抗肿瘤和神经心血管方面的活性。例如从Acremonium ehrysogenum产生的头孢菌素，已发展为一大类半合成抗生素的先导，广泛应用于临床，还有其他的一些例子见Kerstin Liberra的文章《Marine fungi a profileresource of biologically active natural products？》[Pharmazie 50(1995)，H.9：583]，国际上这方面的研究从八十年代以来呈加速发展的趋势。
植物内源性真菌(Endophytic fungus)生活在高等植物的组织中，对于内源性真菌的次级代谢物的研究还较为缺乏，据保守的估计内源性真菌的种类繁多，大约有1.5×106种，由于数量庞大，而且与其他生物之间紧密的生态关系，使这类真菌成为潜在的具有产生丰富的次级代谢物的来源。目前对生长于海洋环境的内源性真菌的次级代谢物的研究还未见报道。
本发明的目的在于提供一类新的来源于海洋真菌的具有潜在药用价值的化合物及其提取分离方法，以及它们在制备抗肿瘤药物中的用途。
发明人由南海海洋真菌Halorosellinia sp.1403(以下简称真菌1403)的发酵培养物中提取分离得到3种结构相似的化合物，该3种化合物的结构分别如下列式A、式B和式C所示(以下分别简称为化合物A、B和C)：
本发明所用的的真菌1403已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M201018，保藏日为2001年4月23日。
本发明化合物A、B和C可从真菌1403的发酵培养液中提取分离而得到，制备方法的具体步骤如下：
a.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NO：M 201018的种子培养：培养基(按重量比)为：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，琼脂1-1.5，氯化钠3-5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；
b.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NO：M 201018的发酵培养：发酵培养基(按重量比)为：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，氯化钠3-5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2个月；
c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；
d.将发酵液加热浓缩至原液体积的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以乙酸乙酯/石油醚＝1％-100％为洗脱剂梯度洗脱；
e.收集30％-90％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，浓缩得红色针状结晶，即为A、B、C混合物；再经聚酰胺柱层析多次分离，即可分开化合物A、B与C。
本发明经试验证明，化合物A、B与C均能有效抑制肿瘤细胞株的生长，在以大肠癌细胞株(LOVO)为靶细胞的MTT还原法检测抗肿瘤活性试验中，化合物A、B、C的半数致死量IC50均低于10μg/ml。所以，化合物A、B或/和C可用于制备抗肿瘤药物。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
化合物A、B、C的分离制备方法
a.真菌1403的种子培养：培养基(按重量比)：葡萄糖1.0，酵母提取物0.1，蛋白胨0.2，琼脂1.2，氯化钠4，水100，制成试管斜面；挑取菌株接入斜面，30-35℃培养6天：
b.真菌1403的发酵培养：发酵培养基(按重量比)：葡萄糖1.0，酵母提取物0.1，蛋白胨0.2，氯化钠4和水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1.5个月；
c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；
d.将发酵液加热浓缩至原液体积的1/4，用乙酸乙酯萃取6次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以乙酸乙酯/石油醚＝1％-100％为洗脱剂梯度洗脱；
e.收集30％-90％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，浓缩得红色针状结晶，即为A、B、C混合物，再经聚酰胺柱层析多次分离，即可分开化合物A、B与C。
化合物A的试验数据；R5 FABMS：305(M+1)，m/z：69，1HNMR(500Mz，CDCl3，TMS)：12.603(s，)，7.62，7.356(s，H-9)，6.106(s，H-1)，3.914(s，OCH3-16)，3.821(t，5.5，5.5Hz，H-7)，3.083(d，17Hz，H-8a)，2.985(dd，18.5，5Hz，H-5a)，2.920(dd，18.5，5.5Hz，H-5b)，2.786(d，17Hz，H-8b)，1.255(s，CH3-15)，13CNMR(CDCl3)：189.775(C-4)，178.557(C-3)，160.238(C-2)，158.612(C-14)，142.888(C-10)，130.891(C-12)，127.442(C-11)，119.267(C-9)，110.324(C-13)，108.591(C-1)，70.649(C-7)，69.551(C-6)，55.808(C-16)，40.358(C-5)，29.091(C-8)，23.981(C-15).IR v/cm-1(KBr)：3500.8，3369.1，3031.0，2979.0，2924.9，2853.9，1717.0，1674.6，1618.6，1597.2，1511.9，1479.8，1455.5，1415.6，1370.2，1344.2，321.1，1277，1236.3，1104.1，1076.0，1045.9，985.1，933.7，856.7，818.8，795.2，629.6，456.7。元素分析(w/％，C16H16O6)：C63.54(63.15)，H6.208(5.26).
化合物B的试验数据；R9 FABMS：285(M+1)，m/z：105，1HNMR(500Mz，CDCl3，TMS)：13.587(s，OH-4)，13.469(s，OH-1，8.233(d，8Hz，H-8)，8.145(s，H-5)，6.706(s，H-3)，4.011(s，CH3-16)，2.554(s，CH3-15).13CNMlR(CDCl3)：187.656(C-10)，184.669(C-9)，160.638(C-4)，157.464(C-2)，150.168(C-4)，145.126(C-6)，135.509(C-7)，133.221(C-11)，131.802(C-12)，127.304(C-5)，127.055(C-8)，112.684(C-14)，106.890(C-3)，106.163(C-13)，56.637(C-16)，21.936(C-15).IR v/cm-1(KBr)：2921.3，2852.4，2666，1708，1593.1464.7，1421，1409，1371，1275.9，1206，1118，959，821，723.8.元素分析(w/％，C16H12O5)：C(67.60)，H(4.23).
化合物C的试验数据；R6 FABMS：337(M+1)，m/z：55，1HNMIR(500Mz，CDCl3，TMS)：13.345(s，OH-9)，12.615(s，OH-10)，6.457(s，H-3)，4.773(t，4.5，4.5Hz，H-7，OH)，3.917(s，CH3-16)，3.538(t，4.5，4.5Hz，H-5)，2.74(d，18Hz，H-8a)，2.67(d，18Hz，H-8b)，1.235(s，CH3-15).13CNMR(CDCl3)：183.290(C-4)，176.456(C-1)，160.869(C-10)，160.869(C-2)，160.225(C-9)，139.469(C-11)，136.818(C-12)，109.770(C-14)，109.631(C-3)，107.315(C-13)，76.307(C-7)，69.195(C-6)，68.238(C-5)，56.751(C-16)，34.764(C-8)，25.460(C-15).IR v/cm-1(KBr)：3514，3479，3374，3029，2987，2938，2896，1595，1475，1440，1398，1370，1300，1200，1208，1138，1082，997，948，864，821，632，554，491.元素分析(w/％，C16H16O8)：C56.56(57.14)，H4.617(4.76).θmp232℃。
实施例2
MTT还原法检测化合物A、B、C抗肿瘤活性试验
1.材料：
1.1 四脞盐(MTT)：用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT〔3-(4，5dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，SIGMA〕终浓度5mg/ml，过滤除菌，分装后4℃避光保存。
1.2 MTT裂解液的配制：80g的十二烷基磺酸钠(SDS，华美生物工程公司)溶解在200ml的N-N-二甲基甲酰胺(北京化工厂)中，水浴加热助溶，加入200ml蒸馏水，用80％乙酸与1N盐酸(1∶1)混合调pH至4.7。
1.3靶细胞的制备：LOVO细胞的复苏与培养
a.从液氮罐中取出大肠癌细胞株LOVO细胞的冻存管，迅速置入37℃水浴中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；
b.加全培养液至10ml，1000rpm离心5s，弃上清；
c.重复以上操作一次；
d.以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％CO2，37℃培养；
e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。
1.4细胞计数、96孔板准备
a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，全培养终止，移入离心管中，加全培至10ml；
b.取一滴滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘104，即为每毫升培养液所含细胞数；
c.调整细胞数至1×105ml；
d.96孔板置超镜台内在紫外线下照射4hr，距离30cm以内。
1.5化合物A、B与C的配制：分别取一定量的化合物A、B、C加入到全培中，调整浓度为500μg/ml，超声乳化，过滤除菌，4·C保存。
2试验方法
a.96孔板各孔加入LOVO细胞180μl(1×105/ml)，5％CO2、37℃培养4hr。
b.加入不同浓度受试对象，对照加全培2μl，继续培养48hr。
c.每孔去除培养液100μl，加入MTT(5mg/ml)各10μl，继续培养4hr。
d.每孔加入MTT裂解液100μl，轻轻振荡5-10min，使颗粒溶解，过夜。
e.酶联免疫仪570nm下测定各孔OD值。
f.计算抑制率
肿瘤细胞杀伤率％＝
(对照组测定的平均OD值一加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值×100％g.以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC50值以lgc为横坐标，抑制率为纵坐标，求得IC50值
3.试验结果
试验结果显示化合物A、B、C均能有效抑制LOVO细胞株生长，其中A、B、C的IC50值均低于10μg/ml。
Claims (3)
1.下述结构式A、B、C的化合物：
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是该方法包括以下步骤：
a.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NO：M 201018的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，琼脂1-1.5，氯化钠3-5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；
b.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NO：M 201018的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，氯化钠3-5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2个月；
c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；
d.将发酵液加热浓缩至原液体积的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以乙酸乙酯/石油醚＝1％-100％为洗脱剂梯度洗脱；
e.收集30％-90％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，浓缩得红色针状结晶，即为A、B、C混合物；再经聚酰胺柱层析多次分离，即可分开A、B与C。
3.权利要求1所述的式A、式B或/和式C化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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